CN104888191A - 一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法 - Google Patents
一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104888191A CN104888191A CN201510167710.8A CN201510167710A CN104888191A CN 104888191 A CN104888191 A CN 104888191A CN 201510167710 A CN201510167710 A CN 201510167710A CN 104888191 A CN104888191 A CN 104888191A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ossification
- ligamenta flava
- animal model
- medicine
- construction method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Instructional Devices (AREA)
Abstract
本发明涉及疾病动物模型构建方法技术领域,本发明提供了一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,该方法不破坏黄韧带的完整性,将药物与matrigel相混合后多点注入黄韧带中,最大程度的延长了药物与黄韧带相作用的时间,并扩大了药物与黄韧带的接触面积。本发明制备的动物模型更接近人体内黄韧带骨化的发生机制,而减少破坏黄韧带的完整性,提高建立模型的成功率,对将来研究人体内黄韧带骨化发生机制提供一定的理论基础,从而更好的应用于临床。
Description
技术领域:
本发明涉及疾病动物模型构建方法技术领域,具体涉及一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法。
背景技术:
黄韧带骨化症(Ossification of ligamentum flavum,OLF),是一种发生在人脊柱黄韧带的异位骨化症,该病变可以造成脊髓后方的压迫,引起四肢瘫痪、大小便功能障。OLF的发病机制目前尚不清楚,当前关于黄韧带骨化症发病机制的实验研究对象主要以人黄韧带细胞为主,而动物模型作为验证体外细胞学实验结果和疾病机制的重要手段,对OLF研究较少。
黄韧带骨化症的发生是一个多因素致病过程,根据现有的文献报道,黄韧带骨化动物模型主要通过黄韧带局部干预法(Mimatsu K,Kishi S,Hashizume Y.Experimental chronic compression on the spinal cord of the rabbit by ectopic bone formation in the ligamentum flavum with bone morphogenetic protein.Spinal Cord.1997;35(11):740-6.)和基因改造(Uchida K1,Nakajima H,Watanabe S,et al.Apoptosis of neurons and oligodendrocytes in the spinal cord of spinal hyperostotic mouse(twy/twy):possible pathomechanism of human cervical compressive myelopathy.Eur Spine J.2012;21(3):490-7.)的方法建立,其中黄韧带局部干预法是目前建立黄韧带骨化模型的主要方式。
本发明人所在的课题组前期试验取新西兰大白兔作为实验对象,将明胶海绵作为BMP诱导骨化的载体,每侧植入物中含rhBMP 0.1mg,诱导黄韧带骨化成功,相关研究成果参见以下论文(陈雄生,贾连顺,倪斌,袁文,陈华江,李玉莉.重组人骨形态发生蛋白2诱发黄韧带骨化的病理学研究.第二军医大学学报,2000;21(7):642-644。陈雄生,贾连顺,倪斌,孔庆毅,徐爱民,陈华江,李玉莉.重组人骨形态发生蛋白-2诱发黄韧带骨化的实验模型.中国脊柱脊髓杂志,2002;12(1):31-34)
新西兰大白兔是建立动物模型应用较多的动物,其黄韧带的暴露相对 比较容易,解剖结构的研究也非常明确。以往建立兔黄韧带骨化模型,术中需要将大部分的黄韧带破坏掉,仅残留靠近硬脊膜后方的一薄层黄韧带,然后将实验所用的药物和载体植入到去除黄韧带的部位,然后用游离肌肉覆盖。该方法的主要缺陷是:1、黄韧带结构破坏过多,黄韧带骨化过程与人黄韧带骨化症发病机制不相符合;2、兔大部分的黄韧带已被破坏,标本量大量减少,阳性结果较难得到;3、兔黄韧带结构小,在黄韧带内甚至椎管内包埋诱导骨化药物,很容易造成脊髓的损伤,操作上难度较大;4、药物与黄韧带的接触面积较局限;5、载体以胶原蛋白和明胶海绵为主,干预药物容易流失。
上述缺陷致使黄韧带骨化动物模型成功率也较低,克服或改善上述缺陷是提高黄韧带骨化症动物模型构建成功率的关键。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种克服上述缺点,提高黄韧带骨化症动物模型构建成功率的动物模型构建方法。
本发明提供一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,该方法具体是一种注射器注射法建立黄韧带骨化模型和药物与matrigel相混合后注入黄韧带的方法。
本发明的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,包括以下步骤组成:
A、药物与matrigel胶相混合;
B、选取3月兔龄的健康成年新西兰大白兔,暴露其黄韧带;将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中。
所述的步骤A中,所述的药物为致骨化药物,优选为骨桥蛋白(OPN)、重组人骨形态发生蛋白2等;所述的药物的浓度可根据模型需要调节,药物浓度为1--50ng/μl;骨桥蛋白较优为20ng/μl(相对于药物与matrigel胶混合物的重量体积比)。
所述的步骤A国,matrigel胶优选BD公司,其中含层粘连蛋白60%、Ⅳ型胶原蛋白30%、8%巢蛋白以及少量生长因子;
所述的步骤A中,较优的为,混合在冰浴上进行,抽取一定量的matrigel与药物相混合,充分吹打混匀,避免气泡的出现。混合后将含有药物的matrigel放入4℃冰箱中保存。
所述的步骤B中,较优的为,沿棘突、椎板骨膜下剥离棘旁肌群,切除L5-7棘突间韧带,显露相应节段的黄韧带,保留黄韧带表面的筋膜组织。
所述的步骤B,较优的为,用一次性注射器将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中,多点注射指不少于注射点不少于4点,每点注射8μl,总计注射40μl量为宜,注射深度以保留matrigel于黄韧带内部为宜。
本发明的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,在黄韧带骨化模型建立过程中不破坏黄韧带的完整性;由于药物的注入形式是以药物与matrigel相混合的方法,最大程度的延长了药物与黄韧带相作用的时间;另外,通过注射器相黄韧带内多点注射含有药物的matrigel,最大限度的扩大了药物与黄韧带的接触面积。
本发明构建方法的优点在于:1、操作方便,对黄韧带破坏小,保留了黄韧带的完整性;2、采用多点注射,最大限度的增加了药物与黄韧带的接触面积;3、选取matrigel作为干预药物的载体,其冰浴(4℃)下为液态,常温下为胶体,因此可用于注射,并且注入的matrigel成为胶体,药物在黄韧带内能够维持一定的浓度,并且与黄韧带的作用时间会大大延长;4、不容易碰到硬脊膜,很少发生因手术操作而发生脊髓损伤,导致动物瘫痪。
本发明制备的动物模型更接近人体内黄韧带骨化的发生机制,而减少破坏黄韧带的完整性,提高建立模型的成功率,对将来研究人体内黄韧带骨化发生机制提供一定的理论基础,从而更好的应用于临床。
附图说明:
图1为本发明的新西兰大白兔OLF动物模型建立过程,其中a为黄韧带的显露,箭头所指为黄韧带和两侧黄韧带之间的间隙;b为药物-matrigel多点注射。
图2为本发明的新西兰大白兔OLF动物模型黄韧带大体标本及Micro-CT检查:术后8周开始影像学开始发现黄韧带骨化,大体标本见黄韧带明显增厚,内部含骨化组织(图2a黑色箭头),而相邻节段未见黄韧带明显增厚骨化(图2a白色箭头)。Micro-CT检查见横断面局部骨化(图2b白色箭头),三维重建呈蜂窝状(图2c白色箭头)。术后12周三维重建可见黄韧带大块骨化组织形成(图2f白色箭头),横断面可见片状骨化组织形成(图2e白色箭头)。而术后12周对照组未见明显骨化组织形成(图2d白色箭头)。
图3为本发明的新西兰大白兔OLF动物模型骨化黄韧带组织学检查,其中术后8周HE染色可见黄韧带内可见软骨细胞形成(图3a),甲苯胺蓝染色阳性表现(图3b);术后12周HE染色可见骨组织形成(图3c),甲苯胺蓝染色无明显阳性表现(图3d)。
具体实施方式:
以下结合附图和具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1:骨桥蛋白+matrigel诱导新西兰大白兔黄韧带骨化模型
一、骨桥蛋白与matrigel相混合
Matrigel的特性:Matrigel(购自BD公司)的主要成分是层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白,当温度在0-4℃时以液态形式存在,高于4℃时呈胶冻状。
Matrigel与人骨桥蛋白(购自Protech公司)相混合的方法:本实验操作需要在冰浴上进行。根据实验所需,抽取一定量的matrigel与药物相混合成药物浓度20ng/μl,充分吹打混匀,避免气泡的出现。然后将含有药物的matrigel放入4℃冰箱中保存。
二、新西兰大白兔的OLF动物模型的构建
1)取体重在2.5-3.0kg的健康成年新西兰大白兔(购自中国人民解放军第二军医大学动物中心),按每千克体重4ml、10%水合氯醛腹腔注射麻醉,麻醉成功后,以双侧髂棘连线与脊柱的交点为中心备皮,范围约5cm×4cm大小。将大白兔俯卧位于操作台上。常规消毒,铺无菌洞巾。
2)取1%利多卡因进行皮下局部麻醉,沿棘突纵向切开皮肤,长约4cm;切开腰背筋膜,钝性分离棘突两侧附着的肌肉,撑开器撑开两侧肌肉,咬掉相邻两节段的棘突,显露L5-7任一节段的黄韧带,保留黄韧带表面的筋膜组织,如图1a所示。
3)冰浴下用微量加样器(移液枪)量取含有骨桥蛋白的matrigel混合液,用一次性1ml无菌注射器将matrigel+骨桥蛋白20ng/μl共40μl通过多点注射的方法注入到黄韧带中,相邻节段仅注射matrigel作比较,如图1b所示。
4)逐层缝合肌肉、皮下筋膜及皮肤。术区安尓碘消毒。
5)麻醉苏醒后,将大白兔放回笼中单独饲养。
三、影像学、黄韧带标本的获取及染色
分别在术后8周和12周,用按每千克体重4ml、10%水合氯醛腹腔注射麻醉,麻醉成功
1)术后8周大体标本matrigel+骨桥蛋白注射节段见黄韧带明显增厚,内部含骨化组织(图2a红色箭头),而相邻节段对照组(仅注射matrigel)未见黄韧带明显增厚骨化(图2a白色箭头)。
2)行Micro-CT(Latheta LCT-200)扫描,见matrigel+骨桥蛋白注射节段横断面局部骨化(图2b白色箭头),三维重建呈蜂窝状(图2c白色箭头)。术后12周三维重建可见黄韧带大块骨化组织形成,横断面可见片状骨化组织形成。而术后12周对照组(仅注射matrigel)未见明显骨化组织形成(图2d白色箭头)。
3)取骨化黄韧带组织行组织学检查,术后8周HE染色可见黄韧带内可见软骨细胞形成(图3a),甲苯胺蓝染色阳性表现(图3b);术后12周HE染色可见骨组织形成(图3c),甲苯胺蓝染色无明显阳性表现(图3d)。提示黄韧带骨化过程是软骨内成骨。
结果说明:我们用该方法建立诱导新西兰大白兔黄韧带骨化模型共12例,其中10例诱导骨化成功,成功率达83.3%以上,而且安全性高,没有一例大白兔在造模时发生瘫痪,并且能保留完整的黄韧带结构。该动物模型骨化的过程与文献报道黄韧带骨化病理过程相吻合,对黄韧带骨化发病机制的研究有重要意义,是目前较为理想的构建黄韧带骨化模型的方法。
实施例2.重组人骨形态发生蛋白2+matrigel诱导新西兰大白兔黄韧带骨化模型
重组人骨形态发生蛋白2(购自上海瑞齐实业科技有限公司)浓度2.5μg/μl,其余构建模型方法同实施例1,共构建3例动物模型,均获得成功。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例诱导骨化药物、matrigel基质和动物类型,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或 替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,包括以下步骤组成:
A、药物与matrigel胶相混合;
B、选取3月兔龄的健康成年新西兰大白兔,暴露其黄韧带;将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中。
2.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的步骤A中,所述的药物为骨桥蛋白、重组人骨形态发生蛋白2。
3.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的药物浓度为1--50ng/μl。
4.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的药物为骨桥蛋白,浓度为20ng/μl。
5.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的步骤A中,药物与matrigel胶的混合在冰浴上进行,抽取一定量的matrigel胶与药物相混合,充分吹打混匀,避免气泡的出现;混合后将含有药物的matrigel胶放入4℃冰箱中保存。
6.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的步骤B中,暴露其黄韧带的方法如下:沿棘突、椎板骨膜下剥离棘旁肌群,切除L5-7棘突间韧带,显露相应节段的黄韧带,保留黄韧带表面的筋膜组织。
7.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的步骤B,多点注射指注射点不少于4点。
8.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法,其特征在于,所述的步骤B,用一次性注射器将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中,每点注射8μl,总计注射40μl,注射深度以保留matrigel胶于黄韧带内部。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510167710.8A CN104888191A (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | 一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510167710.8A CN104888191A (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | 一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104888191A true CN104888191A (zh) | 2015-09-09 |
Family
ID=54021432
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510167710.8A Pending CN104888191A (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | 一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104888191A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110051449A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-07-26 | 贾志强 | 一种大鼠黄韧带肥厚模型的多模式诱导装置及造模方法 |
-
2015
- 2015-04-09 CN CN201510167710.8A patent/CN104888191A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
RIPAMMONTI U ET AL: "induction of cementogenesis and periodontal ligament regeneration by recombinant human transforming growth factor-beta3 in matrigel with rectus abdominis responding cells", 《J PERIODONTAL RES》 * |
UCHIDA K1等: "Apoptosis of neurons and oligodendrocytes in the spinal cord of spinal hyperostotic mouse(twy/twy):possible pathomechanism of human cervical compressive myelopathy", 《EUR SPINE J》 * |
陈雄生等: "重组人骨形态发生蛋白-2诱发黄韧带骨化的实验模型", 《中国脊柱脊髓杂志》 * |
陈雄生等: "重组人骨形态发生蛋白2诱发黄韧带骨化的病理学研究", 《第二军医大学学报》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110051449A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-07-26 | 贾志强 | 一种大鼠黄韧带肥厚模型的多模式诱导装置及造模方法 |
CN110051449B (zh) * | 2019-05-20 | 2023-08-01 | 贾志强 | 一种大鼠黄韧带肥厚模型的多模式诱导装置及造模方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Jiang et al. | Three-dimensional bioprinting collagen/silk fibroin scaffold combined with neural stem cells promotes nerve regeneration after spinal cord injury | |
Curtis et al. | A first-in-human, phase I study of neural stem cell transplantation for chronic spinal cord injury | |
Cristante et al. | Therapeutic approaches for spinal cord injury | |
Bakshi et al. | Minimally invasive delivery of stem cells for spinal cord injury: advantages of the lumbar puncture technique | |
Canavero | The “Gemini” spinal cord fusion protocol: Reloaded | |
Liang et al. | Human neural stem cells promote corticospinal axons regeneration and synapse reformation in injured spinal cord of rats | |
Hu et al. | In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO‐labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
Grunert et al. | Annular repair using high-density collagen gel: a rat-tail in vivo model | |
Bourne | Unravelling the development of the visual cortex: implications for plasticity and repair | |
ES2822909T3 (es) | Fibroblastos dérmicos para el tratamiento de enfermedad discal degenerativa | |
Aufiero et al. | Regenerative injection treatment in the spine: review and case series with platelet rich plasma. J Stem Cells Res | |
Lei et al. | Co-transplantation of neural stem cells and Schwann cells within poly (L-lactic-co-glycolic acid) scaffolds facilitates axonal regeneration in hemisected rat spinal cord | |
Tang et al. | The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model | |
Erichsen et al. | Morphology and ultrastructure of medial rectus subgroup motoneurons in the macaque monkey | |
Deng et al. | The co-transplantation of human bone marrow stromal cells and embryo olfactory ensheathing cells as a new approach to treat spinal cord injury in a rat model | |
Kataoka et al. | Rotator cuff tear healing process with graft augmentation of fascia lata in a rabbit model | |
Martínez‐Ramos et al. | Biohybrids for spinal cord injury repair | |
CN109486765A (zh) | 一种nf2-/-前庭神经鞘瘤施旺细胞系的建立方法及其细胞系 | |
CN106890359A (zh) | 用于中枢神经损伤修复的三维多孔聚氨酯支架及制备方法 | |
Lam et al. | Fibrin sealant augmentation with autologous pericranium for duraplasty after suboccipital decompression in Chiari 1 patients: a case series | |
Geisbauer et al. | Transplantation of enteric cells into the aganglionic rodent small intestines | |
US20220154142A1 (en) | Production of schwann cells | |
Kim et al. | Pelvic floor muscle function recovery using biofabricated tissue constructs with neuromuscular junctions | |
CN104888191A (zh) | 一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法 | |
Lee et al. | Transplantation of schwann cells inside PVDF-TrFE conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150909 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |