CN104838011A - 用于增强酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供的是用某些可以任选地与酶连接的聚合物来增强酶活性的方法。聚合物可以是热响应聚合物，包括聚N-异丙基丙烯酰胺或聚N-异丙基甲基丙烯酰胺。聚合物还可以是具有至少两种不同单体残基的共聚物。单体残基可以具有式(I)的结构：其中R1、RA和RB如说明书所述。这样的单体残基的实例可以包括N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)。聚合物可以包括另外的单体残基，如具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基，其可以被改性以改变聚合物的低临界溶解温度(LCST)。

Description

用于增强酶活性的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年12月7日提交的美国临时专利申请第61/734,918号以及2013年3月15日提交的美国临时专利申请第61/801,982号的权利，其公开内容在此全部并入以供参考。
技术领域
本公开内容大体上涉及增强酶的活性，并且更具体地涉及在例如由生物质中的纤维素制备糖的过程中使用某些聚合物来增强酶的活性和稳定性。
背景技术
酶被用在多种商业应用中，包括食品和农业工业、制药工业、以及化学和生物燃料工业。例如，可以使用纤维素酶例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶来将生物质的纤维素组分转化成用于制造生物燃料的可发酵糖。总体上，这些纤维素酶已从各种各样的有机体中分离，并表现出最适宜的温度、pH和底物范围。然而，纤维素酶的成本，常常成为使用该酶的工艺的商业化过程中的障碍。
与酶水解有关的成本能够通过在相同酶负载下增加水解产率或增加反应器生产能力来降低。已研究分子生物学方法来改善酶功能并减少底物顽拗性(recalcitrance)。参见Wilson D B.,Curr.Opin.Biotech.,2009,20:295-299。涉及在水解混合物中包括大分子“添加剂”如表面活性剂的另外可选的方法也已被用于增加酶产率。参见Eriksson T等人,Enzyme Microb.Tech.,2002,31:353-364；Kaar W E&Holtzapple M T.,Biotechnol.Bioeng.,1998,59(4):419-427；Kristensen J B等人,EnzymeMicrob.Tech.,2007,40:888-895；Kumar R&Wyman C E.,Biotechnol.Bioeng.,2008,102(6):1544-1557；Qing Q等人,Bioresource Technol.,2010,101:5941-5951；Sipos B等人,C.R.Biol.,2011,334:812-823；以及Zheng Y等人,Appl.Biochem.Biotechnol.,2008,146:231-248。然而，这些添加剂在何种水平增强酶活性可能基于多种因素变化，包括酶负载、底物预处理、水解温度、以及底物和酶的选择。因此，本领域需要的是更一致且可靠、在工业规模上可行的能够改善酶的活性和稳定性的方法。
与酶水解有关的成本还能够通过经多轮处理以收集和再利用酶而被降低。例如，已经完成了在固定纤维素酶领域的工作，包括其共价连接或吸附在例如二氧化硅晶片、硅石、玻璃珠、藻酸钙珠和磁性纳米颗粒的底物上。参见例如，Ogeda等人,J.Biotechnol.2012,157,246-252；Lupoi等人,Biotechnol.Bioeng.2011,108,2835-2843；Mandali&Dalaly,ASTM Intern.2010,7,1-10；Andriani等人,Bioprocess.Biosyst.Eng.2012,35,29-33；Jordan等人,gala,C.J.Mol.Catal.B-Enzym.2011,68,139-146；Xu等人,Biocatal.Biotransfor.2011,29,71-76。还已经完成了在涉及可逆可溶-不可溶聚合物-纤维素酶材料的领域内的工作，最通常使用pH敏感聚合物如Eudragit L-100或甲基丙烯酸聚合物。参见例如，Taniguchi等人,Biotechnol.Bioeng.1989,34,1092-1097；Liang&Cao,X.Bioresource Technol.2012,116,140-146；Zhang等人,Biocatal.Biotransfor.2010,28,313-319。然而，这些材料将工业操作限制在相当窄的pH范围内且需要多重pH调节以回收和再利用该酶。因此，本领域还需要的是在工业规模上可行的能够通过经多轮处理以再循环酶来降低酶成本的替代方法。
发明内容
本文提供了在一种或多种底物分解(例如，水解)的过程中增加酶活性或减少酶或酶的混合物变性的方法，通过使底物与酶或酶的混合物以及至少一种本文所述聚合物接触。能够在本文所述聚合物存在下分解至少一部分底物的任何合适的酶或酶的混合物可以被用于所提供的方法中。合适的酶可以包括，例如，纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。例如，酶可以是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、或多糖单加氧酶、或者任何这些酶的混合物，且底物可以是，例如，生物质、纤维素、二糖和其他多糖。这样的酶在本文所述聚合物的存在下可以使底物水解以产生糖。
本文还提供了通过使底物与酶和至少一种本文所述聚合物接触以对底物进行预处理的方法，包括至少一种本文所述聚合物，以产生预处理的底物，其中与未经该预处理的底物的水解相比，预处理底物随后的水解引起更高的产率。
用于本文所述任何方法的聚合物可以包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中：RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
在某些实施方式中，式(I)的单体残基是N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)、或其任意组合。
在某些实施方式中，式(I)的单体残基是式(I-A1)的单体残基：
其中：
R1和RB如上对式(I)的定义；
RA1在每次出现时是未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、或者未取代或取代的-杂环基-；并且
RA2和RA3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中：RA1在每次出现时是未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂环烷基-、或者未取代或取代的-杂芳基-。
在一些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中：RA2和RA3在每次出现时独立地是未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
在某些实施方式中，式(I)的单体残基是式(I-A2)的单体残基：
其中R1和RA如上对式(I)的定义。
在某些实施方式中，式(I-A2)的单体残基具有如下结构，其中：RA是未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。在一个实施方式中，RA不为H。
在一些实施方式中，具有式(I)、(I-A1)、(I-A2)、或(I-A2a)的单体残基或者这些残基的任意组合的聚合物可以是热响应聚合物。在一个实施方式中，热响应聚合物是聚N-异丙基丙烯酰胺。在另一实施方式中，热响应聚合物是聚N-异丙基甲基丙烯酰胺。
在一个实施方式中，式(I-A2)的单体残基具有式(I-A2a)的结构：
其中R1如上对式(I)的定义。
在其他实施方式中，聚合物可以是由多个第一单体残基和多个第二单体残基组成的共聚物。这样的共聚物能够由多个具有如上所述式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的结构的第一单体残基和多个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基组成。
在某些实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基在每次出现时独立地具有式(II-B1)或(II-B2)的结构：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；
r在每次出现时独立地为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-杂环基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的C一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(II-B1)或(II-B2)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中：
R1为甲基(即，CH3)；
r在每次出现时为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的C一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，聚合物可以是热响应共聚物，其中各个第一单体残基可以独立地是N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、或其任意组合；且各个第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。在一个实施方式中，共聚物是无规共聚物。
在某些实施方式中，共聚物的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基独立地具有式(II-B1a)或(II-B2a)的结构：
其中：
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-杂环基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3(在式II-B2a的情况下)在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中：X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1。
在一些实施方式中，式(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中：R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
本文提供的方法还可以包括在酶促反应(例如，水解)之后回收至少一种聚合物。在其中至少一种聚合物被回收的实施方式中，方法还包括：使另外的底物与另外的酶或酶的混合物在所回收的聚合物的存在下接触，以及使至少一部分另外的底物分解(包括，例如，水解)。例如，在其中聚合物被回收的一个实施方式中，方法还包括：i)提供另外的生物质、另外的水解酶或水解酶的混合物、以及所回收的聚合物；ii)使生物质与另外的水解酶在所回收的聚合物的存在下接触；以及iii)使至少一部分另外的生物质水解以产生另外的糖。
本文还提供了组合物，其包括：至少一种底物、至少一种酶、以及至少一种本文所述的聚合物，该聚合物包括至少一种含有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，且任选地还含有式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的聚合物。例如，在一个实施方式中，组合物包括：生物质、水解酶、以及选自聚N-异丙基丙烯酰胺、聚N-异丙基甲基丙烯酰胺、和如上所述的共聚物的热响应聚合物。
本文还提供了残余底物组合物，其包括：至少一种残余底物、至少一种水解产物、至少一种酶、以及至少一种本文所述聚合物，该聚合物包括至少一种含有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，以及式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的聚合物。例如，在一些实施方式中，提供的是包括以下的残余生物质组合物：残余生物质、糖、水解酶、和至少一种本文所述的聚合物。在一个实施方式中，残余生物质组合物包括：残余生物质、糖、水解酶、以及选自聚N-异丙基丙烯酰胺、聚N-异丙基甲基丙烯酰胺和如上所述的共聚物的热响应聚合物。
在其他方面，提供了制备上述共聚物的方法，通过：a)提供N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)；b)提供具有氨氧基的甲基丙烯酰胺；c)使NIPAm或NIPMa与具有氨氧基的甲基丙烯酰胺共聚以产生共聚物；以及d)使共聚物与淬灭剂(quencher)反应以产生改性共聚物。
还提供了聚合物-酶结合物，其包括：水解酶，其中该水解酶具有转氨化的N端；以及聚合物，其中该聚合物与酶的转氨化的N端连接。在某些实施方式中，聚合物是由多个第一单体残基和多个第二单体残基组成的共聚物，其中第一单体残基在每次出现时可以独立地为N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、和其任意组合，并且第二单体残基在每次出现时为具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基，如上所述。在某些实施方式中，聚合物-酶结合物的聚合物是如上所述的热响应聚合物。
另一方面，提供了一种组合物，其包括生物质和如上所述的聚合物-酶结合物。其他方面，提供了残余生物质组合物，其包括残余生物质、糖、和如上所述的聚合物-酶结合物。
另一方面，提供了使生物质水解的方法，通过：a)提供生物质、和如上所述的聚合物-酶结合物；b)使生物质与聚合物-酶结合物接触，并且c)使至少一部分生物质水解以产生糖。在一些实施方式中，该方法还包括在步骤(b)中提供如上所述的另外的聚合物(以非结合的形式)，并使生物质与聚合物-酶结合物在另外的聚合物的存在下接触。
还提供了制备上述聚合物-酶结合物的方法，通过：a)提供N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)；b)提供具有氨氧基的甲基丙烯酰胺；c)使NIPAm或NIPMa与具有氨氧基的甲基丙烯酰胺共聚以产生共聚物；d)使共聚物与淬灭剂反应以产生改性共聚物；e)提供水解酶，其中该水解酶具有N端；f)使水解酶的N端转氨化；并且g)使改性共聚物与水解酶转氨化的N端结合以产生聚合物-酶结合物，其中该结合物是热响应性的。
附图说明
通过参考以下说明并与附图结合能够最好地理解本申请：
图1是示出聚合物-纤维素酶结合物的活性循环的示例性方案；
图2A是用于制备具有两种单体残基的共聚物的示例性反应方案，其中第一单体残基为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)，并且第二单体残基为具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基；
图2B提供了经小分子淬灭剂A-F改性的NIPAm和NIPMa共聚物的低临界溶解温度(LCSTs)的表格；
图2C是经小分子淬灭剂A-F改性的NIPAm和NIPMa共聚物的LCST测量图，标准化为最大吸光度的百分数；
图3A和3B分别是共聚物(1a)和(1b)的1HMR光谱，在以下实施例1中有述，其中峰B和C的积分值的比值用于评估共聚单体的比率；
图4A是用苄基烷氧基胺或5k-PEG-ONH2对EGPh进行改性的示例性反应方案；
图4B提供了未改性EGPh和通过PLP转氨化和经苄基烷氧基胺改性后的EGPh的两个质谱(MS)图，显示出+104的质量位移，且丰度低的地方，较高的质量峰未被赋值；
图4C是SDS-PAGE分析，之后是考马斯染色和密度测定，其中箭头表明与5k-PEG-ONH2单共价改性相应的5kDa质量增加；
图4D是说明检定改性和未改性蛋白质样品的水解活性的图，其中误差条表示三个重复实验的标准差；
图5A是显示结合物共聚物(1a)-EGPh和共聚物(1b)-EGPh的活性的图；
图5B是将具有和不具有添加的β-葡糖苷酶的未改性EGPh的活性进行比较的图，其中误差条表示三个重复实验的标准差；
图5C是用微晶Sigmacell作为底物的共聚物(1a)-EGPh的再循环检定的图，其中在各个循环的0小时和12小时测定可溶性还原糖；
图5D是显示经三次循环产生的总的另外的葡萄糖等同物的图，基于图5C的值的总和。
图5E是显示未改性EGPh经36小时的水解活性的图，基于0小时与12、24和36小时之间的可溶性还原糖的差异；
图6A是用芒草作为底物的共聚物(1a)-EGPh的再循环检定的图，其中在各个循环的0小时和12小时测定可溶性还原糖；
图6B是显示经三次循环产生的总的另外的葡萄糖等同物的图，基于图6A的值的总和；
图7A是示出各个改性和未改性的EGPh在加入微晶Sigmacell时的水解活性的图；
图7B是示出在12小时的时间点以0.2％存在数种不同聚合物添加剂的情况下未改性EGPh的水解活性的图；
图8A是显示在不存在添加的聚合物(样品1)和存在数种不同聚合物(样品2-11)的情况下EGPh的水解活性的图；
图8B是显示在存在甲醛淬灭的NIPAm共聚物和4-羟基-2-丁酮淬灭的NIPAm的情况下EGPh水解活性的图；
图8C是显示在Avicel底物上将在存在甘露糖淬灭的聚(氨氧基甲基丙烯酰胺-共-NIPAm)的情况下游离EGPh的活性与EGPh-共聚物生物结合物(在存在添加的游离共聚物至总聚合物为2mg/ml的情况下)的活性相比较的时间过程实验的图；
图8D是显示在蒸汽预处理的奇岗底物上将在存在甘露糖淬灭的聚(氨氧基甲基丙烯酰胺-共-NIPAm)的情况下游离EGPh的活性与EGPh-共聚物生物结合物(在存在添加的游离共聚物至总聚合物为2mg/ml的情况下)的活性相比较的时间过程实验的图；
图8E是显示NIPAm共聚物对衍生自不同有机体的纤维素酶，包括来自掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶EGPh、来自黑曲霉的内切葡聚糖酶、来自长梗木霉的CBHI、以及来自里氏木霉的Celluclast水解纤维素底物Avicel的作用的图；
图8F是显示NIPAm对以上图8E中所述的纤维素酶水解酸和蒸汽预处理的木质素纤维素底物奇岗的能力的作用的图；
图9A是含有不同量的具有氨氧基的单体残基的NIPAm和NIPMa共聚物的LCST测量图；
图9B是NIPAm和NIPMa的LCST相对于具有氨氧基的单体残基的摩尔百分数所作的图。
图10A是显示将以下条件下的EGPh酶活性进行比较的救援实验的图：将酶在不存在共聚物和底物的情况下孵育24小时(样品1)，将酶与底物和共聚物在整个24小时反应时间内孵育(样品2)，将酶首先在不存在共聚物的情况下孵育12小时且然后在存在共聚物的情况下另外孵育12小时(样品3)，以及将共聚物首先在不存在酶的情况下孵育12小时且然后与酶另外孵育12小时(样品4)。在样品1-4中在整个24小时的反应期间内提供底物。
图10B是显示在不同酶浓度下NIPAm介导的EGPh活化的效果的图。
图10C是显示NIPAm随时间对Celluclast活性的作用的图。
图10D是显示用NIPAm预处理Avicel对EGPh酶活性的时间依赖的作用的图。
图10E是显示以Avicel作为底物时聚合物装载对EGPh活性的作用的图。
图10F是显示用Avicel作为底物在其他添加剂的存在下NIPAm对EGPh活性的作用的图。
图10G是显示用酸和蒸汽处理的奇岗作为底物，在其他添加剂的存在下，NIPAm对EGPh活性的作用的图。
图10H是用酸和蒸汽预处理的奇岗作为底物，将不同聚合物，包括聚(丙烯酰胺)、NIPAm、和缺乏氨氧基共聚单体的NIPAm对EGPh活性的作用进行比较的图。
图10I是用Avicel作为底物，将不同聚合物，包括聚(丙烯酰胺)、NIPAm、和缺乏氨氧基共聚单体的NIPAm对EGPh活性的作用进行比较的图。
图10J是显示在偶氮染料-CMC(azo-CMC)检定中测量的添加剂对EGPh内切葡聚糖酶活性的作用的图。
图10K是显示在偶氮染料-CMC检定中测量的在12小时的w/Avicel和添加剂孵育之后上清液中EGPh的残余活性的图。
图11A和11B是示出包含NIPAm的聚合物分别在Avicel和芒草上对EGPh水解的作用的图。
图12A和12B是示出包含NIPAm的聚合物分别在微晶纤维素和木质纤维素上对内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及其混合物的作用的图。对于各个样品，在括号中标明相对于对照的增加程度。误差条表示标准差。
图13A是将聚(丙烯酰胺)、聚(NIPAm)和NIPAm共聚物对Avicel和芒草的作用进行比较的柱状图。
图13B是示出在各种聚合物负载下在Avicel和芒草上的水解产率的图。误差条表示标准差。
图13C是示出在用Celluclast对芒草进行水解的过程中加入NIPAm共聚物的作用的图。误差条表示标准差。
图14A和14B分别是示出在与Avicel、芒草或无底物孵育之后，对可溶性偶氮染料-CMC底物的残余EGPh活性和残余可溶性蛋白质的图。
图15是将在涉及“救援”的EGPh和“预处理”的底物的水解反应中加入NIPAm共聚物的作用进行比较的图。
图16是将NIPAm聚合物与其他添加剂如吐温、BSA和PEG进行比较的图。
图17是示出0.2％的NIPAm共聚物对不同Celluclast浓度水平下的Celluclast水解芒草的作用的图。
图18是示出在具有或不具有NIPAm共聚物的情况下在30℃下搅拌一定时间之后，褶皱念珠菌脂酶水解橄榄油的能力的柱状图。
图19A是示出不同浓度的NIPAm共聚物对通过褶皱念珠菌脂酶水解荧光底物对硝基苯基月桂酸酯的作用的图。
图19B是示出在具有或不具有NIPAm共聚物的情况下在室温下搅拌一定时间之后，褶皱念珠菌脂酶水解对硝基苯基月桂酸酯的能力的图。
图20A-C示出碱性磷酸酶随时间水解荧光底物的能力，在30℃下搅拌，具有或不具有NIPAm共聚物。
图21提供了在以下实施例22中合成的聚合物1-10的结构。
图22是将加入聚合物1-10对水解Avicel和芒草的作用进行比较的图。
具体实施方式
提供以下说明使得本领域普通技术人员能够实施并使用各个实施方式。具体方法、组合物、技术和应用的说明仅作为实例被提供。对本领域普通技术人员来说本文所述实施例的多种变形是明显的，且在不偏离各个实施方式的精神和范围下，本文限定的一般原则可以应用于其他实施例和应用。因此，各个实施方式并不意在对本文所述和显示的实施例加以限制，而是符合与权利要求一致的范围。
本文提供了通过在任何一种或多种本发明聚合物的存在下分解(包括，例如，水解)底物以增加酶活性的方法，该聚合物包括至少一种含有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还含有如在以下进一步详述的式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的聚合物。任何合适的酶可被用在本文所述的方法中，包括任何可以用于在本文所述的聚合物或聚合物-酶结合物的存在下使至少一部分提供的底物分解的合适的酶。当这样的酶与本发明的聚合物一起被使用时，可以在酶促反应过程中观察到酶活性增加，和/或该酶的变性减少。合适的酶可以，例如包括纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶、木聚糖酶、或这些酶的任何合适的混合物。
使用本文所述的聚合物在酶促反应过程中意外地增加了酶的活性，且/或减少了酶的变性。例如，意外地观察到本文所述的聚合物使酶在水解反应的气-液界面得以稳定，从而减少了酶的失活。而且，这样的聚合物能够被再循环。在某些实施方式中，聚合物是在其较低临界溶解温度(LCSTs)下显示出可逆相转变的热响应聚合物。这些聚合物还可以被进一步改性以包括能够影响聚合物LCSTs的淬灭剂。控制LCSTs使得聚合物能在特定温度下回收。
聚合物的结构和特征连同其在各个应用中的使用方法在下面进一步详述。
聚合物
可以将本文所述的聚合物加入到酶和底物的混合物中以分解该底物。例如，可以将本文所述的聚合物，包括热响应聚合物，加入到生物质和酶的水解混合物中以增加酶的活性且/或使酶稳定化且减少变性。
在一些实施方式中，聚合物是均聚物。“均聚物”是具有一种单体残基的聚合物。“单体残基”是指一类重复单元，例如，单元A、单元B等等。
在其他实施方式中，聚合物是共聚物。“共聚物”是具有两种或多种单体残基的聚合物。各个单体残基(例如，单元A、单元B等等)在共聚物中出现的次数可以变化。共聚物可以是交替共聚物、周期共聚物、无规共聚物、或嵌段共聚物。交替共聚物具有交替的单体残基(例如，-A-B-A-B-A-B-)。周期共聚物具有以重复序列排列的单体残基(例如(-A-B-A-A-A-B-)n)。无规共聚物具有排列为如下的单体残基，即在链中特定点找到给定类型单元的概率等于该单元在链中的摩尔分数。嵌段共聚物由不同的聚合的单体残基的嵌段组成(例如，[(-A-)n-(-B-)m])。应当理解到，尽管前述共聚物描述了两种单体残基A和B，但本文所述的共聚物在一些实施方式中可以具有三种或更多种单体残基。在一些实施方式中，共聚物是无规共聚物。
均聚物
在一些实施方式中，聚合物是由具有式(I)结构的重复单体残基组成的均聚物：
其中：
R1为H或烷基；并且
RA和RB独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中：RA和RB的脂肪族基团、脂环族基团、芳基、杂芳基或杂环基可以任选地被选自环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)R’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分和阴离子部分的一个或多个(例如，1-5个取代基、1-4个取代基、或1-3个取代基、或1或2个取代基)取代。
在一些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中：
R1为H或烷基；并且
RA和RB独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
在一些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中：RA和RB的烷基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基可以任选地被选自环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分和阴离子部分的一个或多个(例如，1-5个取代基、1-4个取代基、或1-3个取代基、或1或2个取代基)取代。
在一些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中：RA和RB独立地为：
H；
未取代的烷基；
被1-5个选自环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的取代基取代的烷基；
未取代的环烷基；
被1-5个选自烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的取代基取代的环烷基；
未取代的芳基；
被1-5个选自烷基、环烷基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的取代基取代的芳基；
未取代的杂环烷基；
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的取代基取代的杂环烷基；
未取代的杂芳基；或者
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的取代基取代的杂芳基；
其中各个R’和R”在每次出现时独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
在某些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中：RA和RB独立地为：
未取代的烷基；
被1-5个选自胺基、-C(O)R’和-OR’的取代基取代的烷基；
未取代的环烷基；
被1-5个选自胺基、-C(O)R’和-OR’的取代基取代的环烷基；
未取代的芳基；
被1-5个选自胺基、-C(O)R’和-OR’的取代基取代的芳基；
未取代的杂环烷基；
被1-5个选自胺基、-C(O)R’和-OR’的取代基取代的杂环烷基；
未取代的杂芳基；或者
被1-5个选自胺基、-C(O)R’和-OR’的取代基取代的杂芳基；
其中各个R’和R”在每次出现时独立地为H或烷基。
在一个实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中RA和RB独立地为H；未取代的烷基；或被1-5个-OH基取代的烷基。
在式(I)的一些实施方式中，烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、或杂芳基可以被阴离子部分或阳离子部分取代。在某些实施方式中，烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、或杂芳基可以被硫酸根部分、磷酸根部分、硝酸根部分、或羧酸根部分取代。
在一些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中RB为H。在其他实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中RA为H或烷基。RA的烷基可以是线性或支链的。
在某些实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中R1为H或烷基；RA为烷基；且RB为H。在一个实施方式中，式(I)的单体残基具有如下结构，其中R1为H或甲基；RA为甲基、乙基、丙基(包括，例如异丙基)或丁基；且RB为H。
针对式(I)的单体残基，在可与任何本文所述实施方式结合的一些实施方式中，RA和RB的至少一个不为H。在其他实施方式中，RA和RB的至少一个是烷基。
在其他实施方式中，式(I)的单体残基是式(I-A1)的单体残基：
其中：
R1和RB如上对式(I)的定义；
RA1是未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、或者未取代或取代的-杂环基-；并且
RA2和RA3独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中：
RA1是未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、或者未取代或取代的-杂环烷基-；并且
RA2和RA3独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
在某些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中RA1是未取代或取代的-烷基-。在一个实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中RA1是未取代或取代的-C1-10烷基-。在某些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中RA1是未取代的-烷基-。在某些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中RA1是未取代的-C1-10烷基-。
在某些实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中RA2和RA3独立地为H、或者未取代或取代的烷基。在一个实施方式中，式(I-A1)的单体残基具有如下结构，其中RA2为H；且RA3为未取代或取代的烷基。
在再其他实施方式中，式(I)的单体残基是式(I-A2)的单体残基：
其中R1和RB如上对式(I)的定义。
在某些实施方式中，R1为H或烷基；且RA为烷基。在一个实施方式中，R1为H或烷基；且RA为异丙基。在一个变型中，R1为H或甲基；且RA为异丙基。
在某些实施方式中，式(I-A2)的单体残基具有式(I-A2a)的结构：
其中R1如上对式(I)的定义。
在一个变型中，式(I-A2)的单体残基是N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)，且聚合物是聚N-异丙基丙烯酰胺(也称为“pNIPAm”)，其具有以下结构：
在另一变型中，式(I-A2)的单体残基是N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)，且聚合物是聚N-异丙基甲基丙烯酰胺(也称为“pNIPMa”)，其具有以下结构：
共聚物
在一些实施方式中，聚合物是由多个具有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的结构的单体残基，或者这些单体残基的任意组合组成的共聚物，如在任何上述实施方式中所述。在某些实施方式中，共聚物可以具有至少两种、至少三种、或至少四种，或者两种、三种或四种类型的单体残基。
在某些实施方式中，共聚物可以具有至少两种、至少三种、或至少四种，或者两种、三种或四种类型的式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，或者这些单体残基的任意组合，如在任何上述实施方式中所述。在一个实施方式中，共聚物可以具有至少两种、至少三种、或至少四种，或者两种、三种或四种类型的式(I-A2)的单体残基。
在一个实施方式中，共聚物由以下组成：
多个式(I-A2)的第一单体残基，其中：
R1为H或烷基；
RA为未取代的烷基；且
RB为H；以及
多个式(I-A2)的第二单体残基，其中：
R1为H或烷基；
RA为未取代的烷基、或被1-5个-OH基取代的烷基；
RB为H，
条件是第一单体残基的R1、RA和RB中的至少一个不同于第二单体残基的R1、RA和RB。在某些实施方式中，第一单体残基的RA和RB中的至少一个不同于第二单体残基的RA和RB。
这样的共聚物的实例包括：
分别具有作为第一和第二单体残基的共聚物；
分别具有作为第一和第二单体残基的共聚物；以及
分别具有作为第一和第二单体残基的共聚物。
在一些变型中，以上示例性共聚物的第一和第二单体残基可以排列成使得该共聚物是交替共聚物、周期共聚物、无规共聚物或嵌段共聚物。
在其他实施方式中，聚合物是包括以下的共聚物：多个独立地具有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的结构的单体残基，如在任何上述实施方式中所述；以及多个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在某些实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B1)或(II-B2)的结构：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；
r在每次出现时独立地为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-杂环基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
在一些实施方式中，式(II-B1)和(II-B2)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中：
R1为甲基(即，CH3)；
r为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
在式(II-B1)和(II-B2)的一些实施方式中，R1为H。在其他实施方式中，R1为甲基。
在式(II-B1)和(II-B2)的一些实施方式中，r为1-10。在式(II-B1)和(II-B2)的一个实施方式中，r为1、2、3、4或5。
在某些实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基在每次出现时独立地具有式(II-B1a)的结构：
其中X如对式(II-B1)的定义。
在其他实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基在每次出现时独立地具有式(II-B2a)的结构：
其中X、R2和R3如对式(II-B2)的定义。
在式(II-B2)和(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基中存在的R2和R3基团可以提供柄基团(handle)，经其可以通过小分子淬灭调节LCST。这允许从共聚物常见供应开始获得宽范围的LCST。淬灭还防止了氨氧基官能团与偶生的醛例如在纤维素解聚过程中产生的葡萄糖分子的醛进行反应。
在一些实施方式中，式(II-B2)和(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中R2和R3在每次出现时独立地为：
H；
未取代的C1-10烷基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10烷基；
未取代的C2-10烯基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10烯基；
未取代的C2-10炔基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10炔基；
未取代的C6-12芳基；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12杂芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12杂芳基，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12环烷基；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12杂环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12杂环烷基，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代的C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子；或者
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子，其中杂环基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代。
在式(II-B2)和(II-B2a)的某些实施方式中，R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代的C1-5烷基、或被1-5个羟基取代的C1-5烷基。
在式(II-B2)和(II-B2a)的一些实施方式中，在每次出现时独立地选自：
在一些实施方式中，式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中X在每次出现时为：
未取代的C1-10-烷基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10-烷基-；
未取代的C2-10-烯基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-烯基-；
未取代的C2-10-炔基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-炔基-；
未取代的C6-12-芳基-；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12-芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12-杂芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12-杂芳基-，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12-环烷基-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12-环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12-杂环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12-杂环烷基-，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C2-10-醚-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-醚-；
-(CH2)jNHCO-，其中j是至少为1的整数。
在一些实施方式中，式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中：X在每次出现时为-乙二醇-、-(CH2)jNHCO-。在某些实施方式中，j在每次出现时为1-10、1-8、或2-5。在一个实施方式中，X在每次出现时为-(CH2)3NHCO-。
关于式(I-A1)中的变量RA1和式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)中的变量X，应当理解“-部分-”是指具有二价的部分。例如-烷基-具有与烷基相同的残基但是具有二价。因此，-甲基-是亚甲基(-CH2-)。
在一些实施方式中，本文所述的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基可以是中性的。在其他实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基可以是带电的。在一个实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基是带正电的。在另一实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基是带负电的。应当理解，可以基于酶的电荷和生理条件选择残基的电荷。
意图的是且应该理解的是，本文所述的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基(例如，式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a))的每种和各种组合可以与任何式(I)的单体残基(例如，式(I)、(I-A1)、(I-A2)和(I-A2a)的残基)的说明结合，与单独列出每种和各种组合无异。
本文所述的聚合物可以用本领域已知的任何合适的方法合成。参考图2A，在一个示例性反应中，共聚物可以通过自由基共聚，以Boc-氨氧基甲基丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)使用偶氮二异丁腈(AIBN)作为自由基引发剂而合成。如上所述，共聚物可以经小分子淬灭剂使用本领域已知的任何合适化学过程而被进一步改性。示例性的小分子淬灭剂在图2B中示出。
如本文所用，“脂肪族”是指线性或支链的烃结构，且可以是饱和的或具有任意不饱和度。脂肪族基团包括，例如，烷基、烯基、和炔基。在一些实施方式中，本文所用的脂肪族基团，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有1-10个碳原子(即，C1-10脂肪族基团)、1-10个碳原子(即，C1-9脂肪族基团)、1-8个碳原子(即，C1-8脂肪族基团)、1-7个碳原子(即，C1-7脂肪族基团)、1-6个碳原子(即，C1-6脂肪族基团)、1-5个碳原子(即，C1-5脂肪族基团)、1-4个碳原子(即，C1-4脂肪族基团)、1-3个碳原子(即，C1-3脂肪族基团)、或1或2个碳原子(即，C1-2脂肪族基团)。
“烷基”是指线性或支链的饱和烃链。在一些实施方式中，本文所用的烷基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有1-10个碳原子(即，C1-10烷基)、1-10个碳原子(即，C1-9烷基)、1-8个碳原子(即，C1-8烷基)、1-7个碳原子(即，C1-7烷基)、1-6个碳原子(即，C1-6烷基)、1-5个碳原子(即，C1-5烷基)、1-4个碳原子(即，C1-4烷基)、1-3个碳原子(即，C1-3烷基)、或1-2个碳原子(即，C1-2烷基)、或1个碳原子(即，C1烷基)。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基和3-甲基戊基。当命名具有特定碳原子数的烷基残基时，可以包括所有具有该碳原子数的几何异构体；因此，例如，“丁基”可以包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”可以包括正丙基和异丙基。
“烯基”是指具有一个或多个双键的线性或支链烃链。在一些实施方式中，本文所用的烯基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有2-10个碳原子(即，C2-10烯基)、2-10个碳原子(即，C2-9烯基)、2-8个碳原子(即，C2-8烯基)、2-7个碳原子(即，C2-7烯基)、2-6个碳原子(即，C2-6烯基)、2-5个碳原子(即，C2-5烯基)、2-4个碳原子(即，C2-4烯基)、2或3个碳原子(即，C2-3烷基)。
“炔基”是指具有一个或多个三键的线性或支链烃链。在一些实施方式中，本文所用的炔基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有2-10个碳原子(即，C2-10炔基)、2-10个碳原子(即，C2-9炔基)、2-8个碳原子(即，C2-8炔基)、2-7个碳原子(即，C2-7炔基)、2-6个碳原子(即，C2-6炔基)、2-5个碳原子(即，C2-5炔基)、2-4个碳原子(即，C2-4炔基)、2或3个碳原子(即，C2-3炔基)。
“脂环族”是指环状脂肪族基团，包括环烷基、环烯基或环炔基。脂环族基团可以包括一个或多个环，包括稠合和桥接的基团，且可以是饱和的或具有任意的不饱和度。在一些实施方式中，本文所用的脂环族基团，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)中，具有3-10个环碳原子(即，C3-10脂环族基团)、3-9个环碳原子(即，C3-9脂环族基团)、3-8个环碳原子(即，C3-8脂环族基团)、3-7个环碳原子(即，C3-7脂环族基团)、3-6个环碳原子(即，C3-6脂环族基团)、或5个环碳原子(即，C5脂环族基团)、或6个环碳原子(即，C6脂环族基团)。
“环烷基”是指环状烷基。在一些实施方式中，本文所用的环烷基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有3-10个环碳原子(即，C3-10环烷基)、3-9个环碳原子(即，C3-9环烷基)、3-8个环碳原子(即，C3-8环烷基)、3-7个环碳原子(即，C3-7环烷基)、3-6个环碳原子(即，C3-6环烷基)、或5个环碳原子(即，C5环烷基)、或6个环碳原子(即，C6环烷基)。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
“杂环基”是指具有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的环状脂肪族基团。杂环基包括，例如，杂环烷基、杂环烯基、和杂环炔基。杂环可以是可以包括一个或多个环的基团，包括稠合和桥接的基团，且可以是饱和的或具有任意不饱和度。在一些实施方式中，本文所用的杂环基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有2-20个环碳原子(即，C2-20杂环基)、2-12个环碳原子(即，C2-12杂环基)、或2-8个环碳原子(即，C2-8杂环基)；以及1-5个环杂原子、1-4个环杂原子、1-3个环杂原子、1或2个环杂原子、或1个环杂原子，独立地选自氮、硫或氧。
“杂环烷基”是指环状烷基，具有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方式中，本文所用的杂环烷基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有2-20个环碳原子(即，C2-20杂环烷基)、2-12个环碳原子(即，C2-12杂环烷基)、或2-8个环碳原子(即，C2-8杂环烷基)；以及1-5个环杂原子、1-4个环杂原子、1-3个环杂原子、1或2个环杂原子、或1个环杂原子，杂原子独立地选自氮、硫或氧。在一个实施方式中，杂环烷基具有2-8个环碳原子，且具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子。杂环烷基的实例可以包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧杂环丁基(oxetanyl)、二氧环戊基(dioxolanyl)、氮杂环丁基(azetidinyl)、和吗啉基。杂环烷基还可以包括这些基团的带电荷形式，例如，1-甲基哌啶基-1-鎓。
“芳基”是指具有单环(例如，苯基)、多环(例如，联苯基)、或多个稠环(例如，萘基、芴基、和蒽基)的芳香族碳环基团。在某些实施方式中，本文所用的芳基，如在式(I)、(I-A1)、(I-A2)、(I-A2a)、(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的单体残基中，具有6-20个碳原子(即，C6-20芳基)，或6-12个碳原子(即，C6-12芳基)。然而，芳基不以任何方式包括以下单独定义的杂芳基或与其重叠。在某些实施方式中，如果一个或多个芳基与杂芳基环稠合，所得的环体系是杂芳基。
“杂芳基”是指具有单环、多环、或多个稠环的芳香族基团，其具有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方式中，杂芳基是包含一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的芳香族单环或双环。在某些实施方式中，本文所用的杂芳基，如在式(I)和(I-A1)的单体残基中，具有3-20个环碳原子(即，C3-20杂芳基)、3-12个环碳原子(即，C3-12杂芳基)、或3-8个环碳原子(即，C3-8杂芳基)；以及1-5个杂原子、1-4个杂原子、1-3个环杂原子、1或2个环杂原子、或1个环杂原子，杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一个实施中，杂芳基具有3-8个环碳原子，且具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子。杂芳基的实例包括吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、苯并噻唑基和吡唑基。杂芳基还可以包括这些基团的带电荷形式，例如1-甲基吡啶基-1-鎓。杂芳基不包括以上定义的芳基或与其重叠。
“胺基”是指-NRaRb，其中各个Ra和Rb独立地为H、脂肪族基团、脂环族基团、芳基、杂芳基和杂环基。在一些实施方式中，胺基具有如下结构，其中Ra和Rb独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。在特定的实施方式中，氨基还可以是带电荷形式的。
聚合物-酶结合物
聚合物-酶结合物(本文也称作“结合物”)包括热响应聚合物-酶结合物，其也可以被用在本文所述的方法中以增加酶的活性且/或使酶稳定且减少变性。例如，在一些实施方式中，聚合物-酶结合物被用来增加生物质的酶水解以产生糖。这样的聚合物-酶结合物还可以基于聚合物的LCST易于回收，且可以在一个或多个随后的水解反应中再循环。如图1所示，聚合物-酶结合物在溶液中可以是可溶的。之后，加入纤维素底物，且通过结合物降解底物。通过将上述可溶物的温度升高至结合物的LCST之上，聚合物-酶结合物可以沉淀出来，然后可以移除可溶性糖。为使聚合物-酶结合物再溶解，溶解的温度可以降低至LCST之下。
聚合物-酶结合物可以包括至少一种本文所述的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基(包括，例如，式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基)，或者这些残基的任何组合，其被改性以与酶连接。本文所述的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基可以通过使酶的N端转氨化而与酶连接。这样的生物结合策略允许在酶中的通常远离酶的活性部位的位置引入聚合物。
在一些实施方式中，聚合物-酶结合物的共聚物具有至少两种单体残基，其中至少一部分单体残基被改性以与酶连接。例如，聚合物-酶结合物的多个单体残基可以独立地具有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的结构，或者这些残基的任何组合，如本文所述；并且聚合物-酶结合物的多个单体残基可以是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基，其独立地具有式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)和(II-B2a)的结构，或者这些残基的任何组合，其中至少一部分具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基被改性以与酶连接。
在聚合物-酶结合物的某些实施方式中，至少一个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基独立地具有式(II-B1)或(II-B2)的结构：
其中X、r、R1、R2和R3各自如上文对聚合物单体残基的定义；并且
至少一个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B3)的结构：
其中：
R1和X如上文对聚合物单体残基的定义；
R4为氨基酸侧链；且
是与酶连接的点。
在聚合物-酶结合物的某些实施方式中，至少一个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基独立地具有式(II-B1a)或(II-B2a)的结构：
其中X、R2和R3各自如上文对聚合物单体残基的定义；且
多个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的至少一个具有上述式(II-B3)的结构。
在式(II-B3)的一些实施方式中，R4可以是任何合适的氨基酸侧链。合适的氨基酸侧链可以包括，例如，丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、色氨酸和脯氨酸的侧链。在式(II-B3)的一些实施方式中，R4是丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸或甲硫氨酸的侧链。在式(II-B3)的某些实施方式中，R4是丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的侧链。在式(II-B3)的一个实施方式中，R4是丙氨酸侧链(即R4是CH3)。在式(II-B3)的另一个实施方式中，R4是甘氨酸侧链(即，R4是H)。
在聚合物-酶结合物的其他实施方式中，具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基可以是单体残基的混合物，该单体残基具有式(II-B1)或(II-B1a)，和(II-B3)的结构；或者具有式(II-B2)或(II-B2a)，和(B3)的结构；或者具有式(II-B1)或(II-B1a)；(II-B2)或(II-B2a)；和(II-B3)的结构。
或者，在其他实施方式中，酶与式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的残基结合。例如，聚合物-酶结合物的多个单体残基可以独立地具有式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的结构，或者这些残基的任何组合，如本文所述，其中多个这样的残基的至少一个被改性以与酶连接。
LCST调整
在某些实施方式中，上述聚合物和聚合物-酶结合物可以是热响应性的。这样的热响应聚合物和聚合物-酶结合物使得聚合物和聚合物-酶结合物能够回收和再利用。这样的聚合物和聚合物-酶结合物的热响应性可以通过其LCST行为加以描述。
这样的热响应聚合物或结合物在低于LCST的含水溶液中变得可溶；然而，高于LCST，聚合物变得不溶，且会从含水溶液中沉淀出来。应当理解，在LCST，一些聚合物可以是部分可溶的(或者部分不溶)。在一些实施方式中，热响应聚合物或结合物在高于约15℃的温度下，或者在约20℃至约100℃之间，或者在约20℃至约70℃之间至少部分不溶于水。在某些实施方式中，热响应聚合物是至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％不溶的。
这样的聚合物和聚合物-酶结合物的LCST行为可以部分地取决于，聚合物或聚合物-酶结合物的疏水和亲水区域的平衡。因此，聚合物和聚合物-酶结合物的LCST可以基于以下而进行调整：(1)热响应单体残基如NIPAm或NIPMa的性质；(2)共聚物中具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的量；和/或(3)用于使共聚物改性的小分子。
通过改变上述一种或多种因素，聚合物和聚合物-酶结合物的LCST可以为0℃至100℃、20℃至100℃、20℃至95℃、20℃至90℃、20℃至80℃、20℃至70℃、20℃至60℃、30℃至55℃、30℃至35℃、35℃至45℃、35℃至40℃、或者35℃至55℃。
热响应单体残基的选择可以影响聚合物或聚合物-酶结合物的LCST的起点。在一些实施方式中，聚合物或聚合物-酶结合物由上述具有式(I)结构的单体残基组成，其中单体残基的LCST为至少0℃、至少20℃、至少30℃、至少40℃、或至少50℃；或者0℃至100℃、20℃至70℃、20℃至60℃、30℃至60℃、30℃至55℃、30℃至35℃、或35℃至45℃。例如，如果NIPAm或NIPMa是热响应单体残基，则LCST通常分别为约32℃或42℃。
具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基可以是亲水的。增加共聚物中存在的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的量可以提高共聚物的LCST。在一些实施方式中，热响应单体残基与具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的摩尔比在50:50至99:1之间。在一个实施方式中，NIPAm或NIPMa单体残基与具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的摩尔比在50:50至99:1之间、或70:30至90:10之间、或80:20至90:10之间。在另一实施方式中，NIPAm或NIPMa单体残基与具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的摩尔比为约92:8。
例如，共聚物分别具有作为第一和第二单体残基，以约80:20的比率存在，且该共聚物的LCST可以是约55℃至60℃。
在另一例子中，共聚物分别具有 作为第一和第二单体残基，以约85:15的比率存在，且该共聚物的LCST可以为约45℃至50℃。
在又一例子中，共聚物分别具有 作为第一和第二单体残基，以约85:15的比率存在，且该共聚物的LCST可以为约35℃至40℃。
如上所述，LCST可以通过经小分子改性而被进一步调节。小分子的性质和含量可以决定改性聚合物的最终LCST。例如，含有8.5％的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的NIPAm共聚物初始可以具有约42.5℃的LCST。当经略微疏水的3-氟异烟醛改性时，LCST可能降至约20.9℃。然而，如果含有15％的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基的NIPAm共聚物经3-氟异烟醛改性，则最终的材料可能具有低于约33.4℃的LCST，因为其会包含更多经疏水改性的单体残基，由于存在更多反应性的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基待被改性。
其他合适的小分子淬灭剂可以包括，例如，乙醛、3-羟基-2-丁酮、丙酮醛、4’-氨基苯乙酮、5-羟基-2-硝基苯甲醛、水杨醛、2-甲酰基苯磺酸、乙醛酸、2,5-羟基-1,4-苯醌、5’-磷酸吡哆醛、或丙酮酸甲酯。
在一些实施方式中，聚合物或结合物可以使用例如乙醛、3-羟基-2-丁酮、或丙酮醛作为淬灭剂而被改性以具有33-37℃的LCST。在其他实施方式中，聚合物可以使用例如4’-氨基苯乙酮、5-羟基-2-硝基苯甲醛、或水杨醛作为淬灭剂而被改性以具有低于20℃的LCST。在再其他的实施方式中，聚合物或结合物可以使用例如2-甲酰基苯磺酸、乙醛酸、2,5-羟基-1,4-苯醌、5’-磷酸吡哆醛、或丙酮酸甲酯而被改性以具有高于95℃的LCST。
例如，参考图4A，在一个示例性实施方式中，纤维素酶的N端可以通过使纤维素酶与5’-磷酸吡哆醛(PLP)进行反应，然后用苄烷氧基胺或5k-PEG-ONH2使PLP-纤维素酶改性而被转氨化。然后，可以使用任何本领域已知的合适方法将转氨化的纤维素酶与热响应聚合物结合。
聚合物和聚合物-酶结合物的其他性质
在一些实施方式中，聚合物(游离形式或作为聚合物-酶结合物的一部分)的Mw为约500Da至约1,000,000Da、约1000Da至约1,000,000Da、约5,000Da至约1,000,000Da、约5,000Da至约175,000Da、或10,000Da至90,000Da、或13,000Da至70,000Da。
在其他实施方式中，聚合物(游离形式或作为聚合物-酶结合物的一部分)的Mn为约500Da至约1,000,000Da、约1000Da至约1,000,000Da、约5,000Da至约1,000,000Da、约5,000Da至约175,000Da、或10,000Da至90,000Da、或13,000Da至70,000Da。
可以采用任何测定Mw和Mn的合适方法或技术。例如，以上列出的数值可以基于凝胶渗透色谱(GPC)加以测定，其中使用特定的溶剂和标准品，如二甲基亚砜(DMF)作为溶剂和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)作为标准品。本领域技术人员可以认识到，改变溶剂和标准品，例如变为氯仿和聚乙二醇(PEG)，可能改变Mw和Mn的数值。
在再其他的实施方式中，聚合物(游离形式或作为聚合物-酶结合物的一部分)的多分散指数(PDI)为约1至约3、约2至约3、或者约1至约2。可以采用任何测定PDI的合适方法或技术。
在某些实施方式中，上述聚合物和聚合物-酶结合物可以是非离子物质和/或非表面活性剂。如本文所用，“非离子物质”是指不具有电荷的聚合物和聚合物-酶结合物。如本文所用，“非表面活性剂”是指具有与表面活性剂类似的降低水的表面张力的能力，但是与表面活性剂结构不同的聚合物和聚合物-酶结合物。特别是，非表面活性剂不具有典型表面活性剂的疏水头和亲水尾。
在某些实施方式中，上述聚合物和聚合物-酶结合物可以增加酶促反应的产率；使酶稳定，例如，在气-液界面；且降低或防止酶的变性或失活。
在某些实施方式中，上述聚合物和聚合物-酶结合物可以降低或防止对生物质中木质素的非特异性吸附，并增加对木质纤维素底物的结合。
聚合物和/或聚合物-酶结合物的混合物
本文所述方法可以采用本文所述的一种聚合物或聚合物-酶结合物，或者该聚合物和/或聚合物-酶结合物的混合物。使用聚合物和/或聚合物-酶结合物的混合物可以允许加入两种或更多种聚合物或具有不同酶和不同LCST的聚合物-酶结合物，其可以协作以分解底物。不同的LCST可以允许混合物中使用的各个聚合物或聚合物-酶结合物的相继回收。
例如，当使用本发明的第一示例性聚合物(聚合物A)和本发明的第二示例性聚合物(聚合物B)来水解底物时，这些聚合物可以被单独地回收，通过(i)升高溶液的温度至高于聚合物A的LCST，但低于聚合物B的LCST；(ii)使用任何本领域已知的合适方法或技术回收聚合物A；(iii)升高剩下的溶液的温度至高于聚合物B的LCST；以及(iv)回收聚合物B。
或者，在另一例子中，具有一LCST的聚合物-酶结合物可以辅以具有第二LCST的聚合物，并且在酶促反应之后，各聚合物和聚合物-酶结合物可以如上所述被相继回收。在又一例子中，对于具有游离酶的反应可以加入具有不同LCST的两种聚合物，并且在酶促反应之后，各聚合物可以如上所述被相继回收。
聚合物负载
本文所述方法中使用的游离形式或结合形式的聚合物的量可以相对于底物的量描述，且该比率可以称作“聚合物负载”。在某些实施方式中，本文所述方法中使用的游离形式或结合形式的聚合物的聚合物负载，被表达为聚合物量与底物量的比率。在确定聚合物负载的过程中使用的底物可以是干底物(也称作“干物质”或“DM”)。然而应当理解，干底物(或干物质)通常是烘干的，且可以具有残余量的或痕量的水。
应当理解，聚合物负载可以取决于多种因素，包括，底物类型、底物预处理、底物负载、酶负载(在聚合物-酶生物结合物的情况下)、以及聚合物的回收愿望。在一些实施方式中，本文所述方法中的聚合物负载为至少0.0001g聚合物/g DM、至少0.001g聚合物/g DM、至少0.01g聚合物/g DM、或至少0.02g聚合物/g DM、或至少0.2g聚合物/g DM；或者在0.0001g聚合物/g DM至0.02之间、0.001g聚合物/g DM至0.02g聚合物/g DM之间、0.001g聚合物/g DM至0.2g聚合物/g DM之间、或0.001g聚合物/g DM至0.5g聚合物/g DM之间。当在本文所述的方法中以这样的聚合物负载使用游离形式或结合形式的聚合物时，相比于不存在聚合物的情况下的酶促反应的产率，酶促反应的产率增加至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％；或者在20％至90％之间、20％至80％之间、20％至70％之间、30％至90％之间、30％至80％之间、30％至70％之间、40％至90％之间、或40％至80％之间。
酶
可以在本文所述的方法和/或组合物中使用任何合适的酶或酶的混合物，包括任何能够与本文所述聚合物共事以对一种或多种底物实施酶促反应的合适的酶或酶的混合物。酶既可以在存在聚合物的情况下以未结合的形式使用，也可以与聚合物结合使用。酶可以是纯化的蛋白质，或者包含在细胞提取物中，如细菌或真菌提取物，或者包含在生物混合物中，如纯化的酶混合物。酶可以衍生自嗜热有机体或嗜温有机体。酶可以选自，例如，纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶，或其任何混合物。
针对本文所述方法提供的酶(例如，纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶)可以得自于任何市售来源或根据任何本领域已知的方法或技术被分离。此外，针对本文所述方法提供的酶(例如，纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶)可以使用任何本领域已知的方法和技术重组产生。
在一些实施方式中，酶是纤维素酶或纤维素酶的混合物。例如，酶可以是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、多糖单加氧酶、或其任意混合物。在一个实施方式中，酶是热稳定的内切葡聚糖酶，如EGPh。在另一实施方式中，酶是CBHI。在另一实施方式中，酶是复合纤维素酶混合物如例如，内切葡聚糖酶可以来自掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)。在一些实施方式中，酶可以得自黑曲霉(Aspergillus niger)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、或里氏木霉(Trichoderma reesei)。
在一些实施方式中，酶是半纤维素酶或半纤维素酶的混合物。在其他实施方式中，酶是纤维素酶和半纤维素酶的混合物。在其他实施方式中，酶是木质酶。在再其他的实施方式中，酶是两种或更多种选自纤维素酶、半纤维素酶和木质酶的酶的混合物。
在一些实施方式中，酶是脂酶或脂酶的混合物。本领域技术人员可以认识到，合适的脂酶可以来自于各种有机体，既包括真核也包括原核有机体。例如，细菌脂酶可以包括例如假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍德菌属(Burkholderia)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、杆菌属(Bacillus)、和色杆菌属(Chromobacter)的种属。例如，真菌脂酶可以包括例如念珠菌属(Candida)、腐质霉属(Humicola)、青霉菌属(Penicillium)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毛霉菌属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、和曲霉菌属(Aspergillus)的种属。在一个实施方式中，脂酶可以得自褶皱念珠菌(Candida rugosa)。在另一实施方式中，哺乳动物脂酶可以包括猪和人胃脂酶，以及来自各种有机体的重组脂酶。来自以下类乙酰胆碱酯酶、胃脂酶、真菌脂酶、细菌脂酶、胰脂酶N-端结构域和类角质酶脂酶结构组的脂酶，可以被用于本文所述的方法中。还可以使用脂酶的混合物，包括任何市售的酶混合物，如和
在一些实施方式中，酶是磷酸酶或磷酸酶的混合物。本领域技术人员可以认识到，合适的碱性磷酸酶可以得自各种有机体。例如，合适的碱性磷酸酶可以是商业可得的酶，来自牛、鸡、虾(例如，北极甜虾(Pandalus borealis))、和细菌来源(例如，大肠埃希氏菌(E.coli))。
在一些实施方式中，酶是淀粉酶或淀粉酶的混合物。在其他实施方式中，酶是木聚糖酶或木聚糖酶的混合物。
应当理解，酶在某些生理条件下可以带有电荷，例如，正电荷或负电荷。在某些实施方式中，带正电的酶可以与本文所述的带正电的聚合物接触。在其他实施方式中，带负电的酶可以与本文所述的带负电的聚合物接触。
酶负载
使用的酶的量可以根据底物的类型和量、以及在酶促反应过程中存在的游离或结合形式的聚合物的类型和量而变化。在一个实施方式中，酶与游离或结合形式的聚合物(包括热响应聚合物)的比例在0.1-5μM(酶):0.1-5wt％(聚合物)之间。在一个实施方式中，比例为约0.2μM:0.2wt％。在其他实施方式中，酶与游离或结合形式的聚合物的重量比在1:2至1:2500之间、或在1:10至1:2000之间、或在1:250之间、或在1:100之间、或在1:50之间、或在1:20之间、或约1:100、约1:200、或约1:300。应当理解，对于该酶:聚合物的比例，酶和聚合物可以是游离和/或结合形式。例如，在其中生物质与聚合物-酶结合物接触的方法中，可以将另外的以其未结合形式的聚合物加入到水解反应中。在这样的方案中，酶与聚合物的比例可以是结合物中酶的量与结合物中聚合物的量和加入的游离聚合物的量的比值。
在一些实施方式中，相比于不存在聚合物的情况，在存在聚合物的情况下反应产生至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍的产品。
底物
本文所述方法中使用的底物类型可以根据使用的酶或酶混合物的类型而变化。本领域技术人员可以认识到且能够选择合适的底物以用于给定的酶或酶混合物。针对本文所述方法提供的底物可以得自任何市售来源或使用任何本领域已知的方法或技术制备。
在其中酶是纤维素酶(例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或多糖单加氧酶)或纤维素酶混合物的一些实施方式中，底物可以选自生物质、纤维素、二糖和其他多糖。在其中酶是外切葡聚糖酶的一个实施方式中，底物可以是纤维素生物质，如Avicel。在其中酶是内切葡聚糖酶或酶混合物例如celluclast的其他实施方式中，底物可以是木质纤维素生物质，其可以衍生自例如奇岗(Miscanthus giganteus)。
本文所述方法中使用的生物质可以包含纤维素和/或半纤维素。在某些实施方式中，纤维素生物质可以是木质纤维素生物质，其除纤维素和/或半纤维素之外还包含木质素。纤维素是包括线性链的β-(1-4)-D-葡萄糖单元的多糖。半纤维素也是多糖；然而，与纤维素不同，半纤维素是通常包括较短的糖单元链的支链聚合物。合适的生物质来源包括，例如，芒草(Miscanthus)。在某些实施方式中，纤维二糖可以被用作酶促水解的起始原料。当包含纤维素和/或半纤维素的生物质被用作底物时，酶可以是纤维素酶或半纤维素酶、或纤维素酶和半纤维素酶的混合物。当生物质还包含木质素时(例如，木质纤维素生物质)，可以进一步使用木质酶。可以使用一种木质酶，或者可以使用两种或更多种木质酶的混合物，或者木质酶可以与纤维素酶和/或半纤维素酶组合使用。
本文所述方法中使用的生物质可以在与酶或聚合物-酶结合物接触之前进行处理。生物质可以经化学、物理或生物预处理。还可以使用预处理的组合。本领域已知的合适的预处理可以包括，例如，稀酸预处理、石灰预处理、湿式氧化、氨纤维/冷冻爆裂(AFEX)、氨渗透(AFR)、以及有机溶剂预处理、蒸汽预处理、碾制、磨制、或者施用溶解木质素的微生物。
在其中酶是脂酶或脂酶混合物的一些实施方式中，底物可以是任何具有至少一种酯官能团的底物。在某些实施方式中，底物是脂类。例如，底物可以是植物油或藻类脂，其中脂酶可以分解底物以产生生物燃料。在另一实施方式中，底物可以是油渍，其中洗衣剂中的脂酶可以分解并移除，或者至少部分地移除该油渍。在又一例子中，底物可以是包含酯的小分子或药物，其中脂酶可以对映选择性地水解该分子或药物以产生某个手性化合物。由于脂酶还可以催化酯交换反应和酯化反应(作为例子给出的水解反应的逆向)，在其他实施方式中，其他合适的底物可以包括醇、羧酸、和/或酯，目的是得到新的酯键。
在其中酶是磷酸酶或磷酸酶的混合物的一些实施方式中，底物可以是任何由至少一种磷酸酯基团组成的分子。这样的分子可以包括，例如，合适的底物可以包括蛋白质、DNA、RNA、和三磷酸脱氧-或核糖核酸。
酶促反应的条件
本领域技术人员能够认识到，合适的处理时间、温度和pH条件可以根据所使用的底物、酶、聚合物或聚合物-酶结合物以及溶剂的类型和量而变化。
酶促反应(例如，水解)可以进行，例如，数秒钟或数分钟至数小时。在一些实施方式中，酶促反应可以进行5分钟至96小时、10分钟至96小时、15分钟至96小时、1至96小时、12至72小时、或者12至48小时。在一些实施方式中，酶促反应(例如，水解)在20℃至70℃之间、20℃至60℃之间、30℃至55℃之间、30℃至35℃之间、或者35℃至45℃之间的温度实施。在一些实施方式中，酶促反应(例如，水解)在0-6的pH、或者3-5的pH实施。
在一些实施方式中，在加入酶之前，底物可以与至少一种本发明的聚合物(包括至少一种热响应聚合物)预孵育。例如，在加入水解酶(例如，纤维素酶)之前，生物质可以与聚合物(包括热响应聚合物)预孵育。在某些实施方式中，该预孵育期为至少12小时、24小时、或36小时。
本领域技术人员可以认识到测定酶促反应的速率和产率的合适方法和技术。合适的方法和技术包括，例如，使用HPLC；或者使用酶配对检定，其可以提供以光谱仪器(例如，紫外-可见光分光光度计或者光学读板器)可量化的颜色或荧光输出。
酶促反应的产物
根据本文所述方法产生的产物类型可以根据所使用的底物类型和酶类型而变化。本领域技术人员可以认识到由涉及某种底物和/或某种酶的给定酶促反应形成的产物。
例如，在其中底物是生物质、纤维素、二糖和其他多糖的实施方式中，本文所述的方法可以将这些底物分解为糖。例如，可以使生物质中的纤维素组分水解以形成单糖、二糖或寡糖。在一个实施方式中，糖是葡萄糖。根据本文所述的方法使用聚合物或聚合物-酶结合物由生物质的水解产生的糖，可以被用于多种下游产物。例如，糖随后可以发酵以产生生物燃料、生物化学品、或其他生物制品。
在另一实例中，通过脂酶的脂类水解可以用于分解脂类本身(例如，在衣物上的油渍的情况下)或用于可能产生的水解产物(例如，水解植物油以产生生物柴油)。通过脂酶的底物酯化和酯交换可以产生小分子或药物的对映异构体。
在又一实例中，通过碱性磷酸酶的显色或荧光小分子底物的脱磷酸化提供了一种测定来自人或其他动物的组织或血液样品中的碱性磷酸酶水平的方法，其可以用作为各个器官功能或整体健康的度量。
聚合物或聚合物-酶结合物的再循环能力
如上所讨论的，聚合物(以游离形式或作为聚合物-酶结合物的一部分)可以通过升高温度至高于聚合物的LCST而得以回收。所回收的聚合物或结合物可以在一个或多个随后的酶促反应中被再循环和再次使用。
在一些实施方式中，本文提供的方法还可以包括：i)提供另外的底物、另外的酶、以及所回收的聚合物；ii)使另外的底物在所回收的聚合物的存在下与另外的酶接触；以及iii)使至少一部分另外的底物水解以产生另外的水解产物。例如，本文提供的方法还可以包括：i)提供另外的生物质、另外的水解酶、以及所回收的聚合物；ii)使另外的生物质在所回收的聚合物的存在下与另外的水解酶接触；以及iii)使至少一部分另外的生物质水解以产生另外的糖。
聚合物或结合物可以从该第二酶促反应中被再次回收，且进一步再循环。聚合物或结合物可以被回收至少一次。在一些实施方式中，聚合物或结合物可以被再循环一、二、三或四次。在某些实施方式中，该方法中使用的聚合物是热响应聚合物。
在一些实施方式中，再循环的聚合物或结合物保持了与初始聚合物或结合物一样的活性。在某些实施方式中，经三轮使用，再循环的聚合物或结合物的使用使酶促产物的量增加了至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍。
聚合物或聚合物-酶结合物组合物
本文还提供了包括至少一种底物、至少一种酶、和至少一种本文所述聚合物(包括至少一种热响应聚合物)的组合物。本文还提供了包括至少一种底物和至少一种如本文所述的聚合物-酶结合物(包括至少一种热响应聚合物-酶结合物)的组合物。在一些实施方式中，组合物还可以包括另外的游离(未结合)形式的酶。
例如，在一个实施方式中，组合物包括纤维素酶或纤维素酶的混合物(如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、多糖单加氧酶、或其任意混合物)；合适的底物(如生物质、纤维素、二糖和/或其他多糖)；以及至少一种如上所述的聚合物(其可以包括，例如，至少一种热响应聚合物)。在另一实施方式中，组合物包括如上所述的聚合物-酶结合物(包括热响应聚合物-酶结合物)，其中酶是纤维素酶或纤维素酶的混合物(如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、多糖单加氧酶、或其任意混合物)；以及合适的底物(如生物质、纤维素、二糖和/或其他多糖)。
本文还提供了包括残余底物、酶促反应产物、酶或酶的混合物、以及至少一种如上所述的聚合物(包括至少一种热响应聚合物)的残余生物质组合物。残余底物是指在酶促反应后残留的任何底物。本文还提供了包括残余底物、酶促反应产物、以及至少一种如上所述的聚合物-酶结合物(包括至少一种热响应聚合物)的残余生物质组合物。在一些实施方式中，残余生物质组合物还可以包括另外的游离(非结合)形式的酶。
例如，在一个实施方式中，本文提供了包括残余生物质、一种或多种糖、水解酶或水解酶的混合物、以及如上所述的聚合物(包括热响应聚合物)的残余生物质组合物。残余生物质是指在水解反应后残留的任何生物质，且可以包括未消化的纤维素、半纤维素和/或木质素，以及盐和其他碎片。
在某些实施方式中，组合物包括：
至少一种选自纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶的酶；
至少一种合适的底物；以及
至少一种聚合物，包括式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还包括式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在一个变型中，组合物包括：
至少一种选自纤维素酶、半纤维素酶和木质酶的酶；
至少一种合适的底物；以及
至少一种聚合物，包括式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还包括式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在另一变型中，组合物包括：
至少一种选自脂酶的酶；
至少一种合适的底物；以及
至少一种聚合物，包括式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还包括式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在另一变型中，组合物包括：
至少一种选自淀粉酶的酶；
至少一种合适的底物；以及
至少一种聚合物，包括式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还包括式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在另一变型中，组合物包括：
至少一种选自磷酸酶的酶；
至少一种合适的底物；以及
至少一种聚合物，包括式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还包括式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在另一变型中，组合物包括：
至少一种选自木聚糖酶的酶；
至少一种合适的底物；以及
至少一种聚合物，包括式(I)、(I-A1)、(I-A2)或(I-A2a)的单体残基，并且任选地还包括式(II-B1)、(II-B2)、(II-B1a)或(II-B2a)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
在其他实施方式，组合物包括：至少一种如本文提供的聚合物-酶结合物(包括至少一种热响应聚合物-酶结合物)，其中酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶；以及合适的底物。
具体实施方式
以下列举的实施方式代表了本发明的某些方面。
1.一种水解生物质的方法，包括：
a)提供生物质、水解酶、和热响应聚合物；
b)使生物质与水解酶在热响应聚合物的存在下接触，
其中热响应聚合物是：
聚N-异丙基丙烯酰胺，
聚N-异丙基甲基丙烯酰胺，或者
包括多个第一单体残基和多个第二单体残基的共聚物，其中各个第一单体残基独立地选自N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、及其任意组合，且各个第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基；以及
c)使至少一部分生物质水解以产生糖。
2.根据实施方式1所述的方法，其中热响应聚合物是包括多个第一单体残基和多个第二单体残基的共聚物，
其中各个第一单体残基独立地选自N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、及其任意组合，且
其中各个第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
3.根据实施方式2所述的方法，其中共聚物的各个第一单体残基独立地具有式(I-A2)的结构：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基。
4.根据实施方式2所述的方法，其中共聚物的各个第二单体残基独立地具有式(II-B1a)或(II-B2a)的结构：
其中：
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
5.根据实施方式4所述的方法，其中X在每次出现时是：
未取代的C1-10-烷基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10-烷基-；
未取代的C2-10-烯基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-烯基-；
未取代的C2-10-炔基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-炔基-；
未取代的C6-12-芳基-；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12-芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12-杂芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12-杂芳基-，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12-环烷基-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12-环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12-杂环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12-杂环烷基-，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C2-10-醚-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-醚-；或者
-(CH2)jNHCO-。
6.根据实施方式5所述的方法，其中X在每次出现时为-(CH2)3NHCO-。
7.根据实施方式4所述的方法，其中R2和R3在每次出现时独立地为：
H；
未取代的C1-10烷基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10烷基；
未取代的C2-10烯基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10烯基；
未取代的C2-10炔基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10炔基；
未取代的C6-12芳基；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12杂芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12杂芳基，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12环烷基；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12杂环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12杂环烷基，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代的C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子；或者
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子，其中杂环基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代。
8.根据实施方式7所述的方法，其中R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代的C1-5烷基、或被1-5个羟基取代的C1-5烷基。
9.根据实施方式4所述的方法，其中在每次出现时独立地选自：
10.根据实施方式2所述的方法，其中多个第一单体残基和多个第二单体残基以50:50至99:1的摩尔比存在。
11.根据实施方式1所述的方法，其中热响应聚合物在高于约15℃的温度至少部分不溶于水。
12.根据实施方式11所述的方法，其中热响应聚合物是至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％不溶的。
13.根据实施方式11所述的方法，其中热响应聚合物在约20℃至约70℃之间的温度至少部分不溶于水。
14.根据实施方式13所述的方法，其中热响应聚合物是至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％不溶的。
15.根据实施方式1所述的方法，其中热响应聚合物具有约5,000Da至约1,000,000Da的分子量。
16.根据实施方式1所述的方法，其中热响应聚合物具有约1.0至约2.0的多分散指数(PDI)。
17.一种水解生物质的方法，包括：
a)提供生物质、水解酶和聚合物，其中聚合物包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或未取代或取代的杂芳基；
c)使至少一部分生物质水解以产生糖；
b)使生物质与水解酶和聚合物接触；以及
c)使至少一部分生物质水解以产生糖。
18.根据实施方式17所述的方法，其中式(I)的单体残基具有如下结构，其中RA和RB在每次出现时独立地为：
H；
未取代或取代的烷基；
被1-5个选自环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的烷基；
未取代的环烷基；
被1-5个选自烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的环烷基；
未取代的芳基；
被1-5个选自烷基、环烷基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的芳基；
未取代的杂环烷基；
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的杂环烷基；
未取代的杂芳基；或者
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的杂芳基；
其中各个R’和R”在每次出现时独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
19.根据实施方式17所述的方法，其中式(I)的单体残基具有如下结构，其中RA在每次出现时独立地为未取代的烷基；且RB为氢。
20.根据实施方式17所述的方法，其中聚合物还包括多个第二单体残基，其中第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
21.根据实施方式17所述的方法，其中具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基在每次出现时独立地具有式(II-B1)或(II-B2)的结构：
其中：
r在每次出现时为大于1或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
22.根据实施方式21所述的方法，其中r为1-5。
23.根据实施方式21所述的方法，其中具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中X在每次出现时为：
未取代的C1-10-烷基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10-烷基-；
未取代的C2-10-烯基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-烯基-；
未取代的C2-10-炔基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-炔基-；
未取代的C6-12-芳基-；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12-芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12-芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12-杂芳基-，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12-环烷基-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12-环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12-杂环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12-杂环烷基-，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C2-10-醚-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-醚-；或者
-(CH2)jNHCO-。
24.根据实施方式21至23中任一项所述的方法，其中具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有如下结构，其中R2和R3在每次出现时独立地为：
H；
未取代的C1-10烷基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10烷基；
未取代的C2-10烯基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10烯基；
未取代的C2-10炔基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10炔基；
未取代的C6-12芳基；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12杂芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12杂芳基，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12环烷基；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12杂环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12杂环烷基，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代的C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子；或者
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子，其中杂环基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代。
25.根据实施方式1-24中任一项所述的方法，其中水解酶是纯化的蛋白质。
26.根据实施方式25所述的方法，其中水解酶是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、多糖单加氧酶、或CBHI。
27.根据实施方式1-26中任一项所述的方法，其中水解酶是酶混合物。
28.根据实施方式27所述的方法，其中水解酶是celluclast。
29.根据实施方式1-28中任一项所述的方法，其中水解酶衍生自嗜热有机体。
30.根据实施方式29所述的方法，其中水解酶衍生自掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、或里氏木霉(Trichoderma reesei)。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的方法，其中水解酶衍生自嗜温有机体。
32.根据实施方式1所述的方法，还包括在步骤(d)中在水解之后回收热响应聚合物。
33.根据实施方式32所述的方法，还包括：
i)提供第二生物质、第二水解酶、以及所回收的热响应聚合物；
ii)使生物质与第二水解酶在所回收的热响应聚合物的存在下接触；以及
iii)使至少一部分第二生物质水解以产生第二糖。
34.一种组合物，包括：
生物质；
水解酶；以及
选自以下的热响应聚合物：
聚N-异丙基丙烯酰胺，
聚N-异丙基甲基丙烯酰胺，以及
包括多个第一单体残基和多个第二单体残基的共聚物，其中各个第一单体残基独立地选自N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺及其任意组合，并且第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
35.一种残余生物质组合物，包括：
残余生物质；
糖；
水解酶；以及
选自以下的热响应聚合物：
聚N-异丙基丙烯酰胺，
聚N-异丙基甲基丙烯酰胺，以及
包括多个第一单体残基和多个第二单体残基的共聚物，其中各个第一单体残基独立地选自N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺及其任意组合，并且第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
36.根据实施方式1所述的方法，其中首先使生物质与热响应聚合物接触，然后与水解酶接触。
37.根据实施方式36所述的方法，其中使生物质与热响应聚合物接触至少12小时、24小时、或36小时。
38.根据实施方式1所述的方法，其中相比于不存在热响应聚合物的情况，在存在热响应聚合物的情况下产生至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的糖。
39.根据实施方式1-38中任一项所述的方法，其中生物质是纤维素生物质且水解酶是外切葡聚糖酶。
40.根据实施方式39所述的方法，其中生物质是Avicel。
41.根据实施方式38所述的方法，其中生物质是木质纤维素生物质且水解酶是内切葡聚糖酶。
42.根据实施方式41所述的方法，其中生物质衍生自奇岗(Miscanthus giganteus)。
43.根据实施方式38所述的方法，其中生物质是木质纤维素生物质且水解酶是celluclast。
44.一种方法，包括使至少一种底物与至少一种聚合物接触，该聚合物包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或未取代或取代的杂环基；
条件是RA和RB中的至少一个不为H。
45.根据实施方式44所述的方法，还包括酶促分解至少一种底物的至少一部分以产生至少一种产物。
46.根据实施方式44所述的方法，还包括酶促水解至少一种底物的至少一部分以产生至少一种产物。
47.根据实施方式45或46所述的方法，还包括回收至少一种聚合物。
48.根据实施方式47所述的方法，还包括通过将至少一种聚合物从至少一种产物中分离来回收至少一种聚合物。
49.根据实施方式47所述的方法，还包括：
i)提供另外的底物、另外的酶或酶的混合物、以及至少一种回收的聚合物；
ii)使另外的底物与另外的酶在至少一种回收的聚合物的存在下接触；以及
iii)酶促分解至少一部分另外的生物质。
50.根据实施方式44-49中任一项所述的方法，其中各个RA和RB在每次出现时独立地为：
H；
未取代的烷基；
被1-5个选自环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的烷基；
未取代的环烷基；
被1-5个选自烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的环烷基；
未取代的芳基；
被1-5个选自烷基、环烷基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的芳基；
未取代的杂环烷基；
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的杂环烷基；
未取代的杂芳基；或者
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的杂芳基；
其中各个R’和R”在每次出现时独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
51.根据实施方式44-49中任一项所述的方法，其中RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代的烷基、或者被1-5个-OH基取代的烷基。
52.根据实施方式44-51中任一项所述的方法，其中RA在每次出现时独立地为烷基；且RB为H。
53.根据实施方式44-52中任一项所述的方法，其中R1在每次出现时为H或烷基。
54.根据实施方式44-49中任一项所述的方法，其中具有式(I)结构的单体残基是式(I-A1)的单体残基：
其中：
RA1在每次出现时是未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、或者未取代或取代的-杂环基-；并且
RA2和RA3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
55.根据实施方式54所述的方法，其中：
RA1在每次出现时是未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、或者未取代或取代的-杂环烷基-；并且
RA2和RA3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
56.根据实施方式54所述的方法，其中RA1在每次出现时是未取代或取代的-烷基-。
57.根据实施方式54-56中任一项所述的方法，其中RA2和RA3在每次出现时独立地为H、或者未取代或取代的烷基。
58.根据实施方式54-57中任一项所述的方法，其中RA2和RA3中的至少一个不是H。
59.根据实施方式54所述的方法，其中：
RA2在每次出现时是H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；并且
RA3在每次出现时是未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
60.根据实施方式54所述的方法，其中：
RA2在每次出现时是H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基；并且
RA3在每次出现时是未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
61.根据实施方式44-60中任一项所述的方法，其中具有式(I)结构的单体残基是式(I-A2)的单体残基：
62.根据实施方式61所述的方法，其中式(I-A2)的单体残基是式(I-A2a)的单体残基：
63.根据实施方式61所述的方法，其中式(I-A2)的单体残基为：
64.根据实施方式44-63中任一项所述的方法，其中至少一种聚合物是均聚物。
65.根据实施方式44-63中任一项所述的方法，其中至少一种聚合物是共聚物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中共聚物是无规共聚物。
67.根据实施方式65或66所述的方法，其中共聚物包括：
多个式(I-A2)的第一单体残基：
其中：
R1是H或烷基；
RA是未取代的烷基；且
RB是H；以及
多个式(I-A2)的第二单体残基，
其中：
R1是H或烷基；
RA是未取代的烷基、或被1-5个-OH基取代的烷基；
RB是H，
条件是第一单体残基的R1、RA和RB中的至少一个不同于第二单体残基的R1、RA和RB。
68.根据实施方式67所述的方法，其中：
多个第一单体残基是且多个第二单体残基选自
69.根据实施方式65或66所述的方法，其中共聚物还包括多个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
70.根据实施方式69所述的方法，其中具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B1)或(II-B2)的结构：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；
r在每次出现时独立地为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-杂环基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
71.根据实施方式70所述的方法，其中：
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
72.根据实施方式70或71所述的方法，其中R2和R3中的至少一个不是H。
73.根据实施方式70所述的方法，其中：
R2在每次出现时是H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；并且
R3在每次出现时是未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
74.根据实施方式71所述的方法，其中：
R2在每次出现时是H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基；并且
R3在每次出现时是未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
75.根据实施方式70-74中任一项所述的方法，其中r是1-10。
76.根据实施方式75所述的方法，其中r是1、2、3、4或5。
77.根据实施方式70所述的方法，其中式(II-B1)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B1a)的结构：
78.根据实施方式70所述的方法，其中式(II-B1)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B2a)的结构：
79.根据实施方式70-76和78中任一项所述的方法，其中R2和R3在每次出现时独立地为：
H；
未取代的C1-10烷基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10烷基；
未取代的C2-10烯基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10烯基；
未取代的C2-10炔基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10炔基；
未取代的C6-12芳基；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12杂芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12杂芳基，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12环烷基；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12杂环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12杂环烷基，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代的C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子；或者
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子，其中杂环基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代。
80.根据实施方式70-76和78中任一项所述的方法，其中R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代的C1-5烷基、或者被1-5个羟基取代的C1-5烷基。
81.根据实施方式78所述的方法，其中在每次出现时独立地选自：
82.根据实施方式70-81中任一项所述的方法，其中X在每次出现时是：
未取代的C1-10-烷基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10-烷基-；
未取代的C2-10-烯基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-烯基-；
未取代的C2-10-炔基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-炔基-；
未取代的C6-12-芳基-；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12-芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12-杂芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12-杂芳基-，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12-环烷基-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12-环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12-杂环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12-杂环烷基-，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C2-10-醚-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-醚-；或者
-(CH2)jNHCO-，且j是至少为1的整数。
83.根据实施方式82所述的方法，其中X在每次出现时是-乙二醇-、或-(CH2)jNHCO-。
84.根据实施方式83所述的方法，其中X是-(CH2)jNHCO-，且j在每次出现时是1-10。
85.根据实施方式44-84中任一项所述的方法，其中至少一种聚合物是热响应性的。
86.根据实施方式85所述的方法，其中至少一种聚合物具有至少10℃的LCST。
87.根据实施方式85所述的方法，热响应聚合物在高于约15℃的温度至少部分不溶于水。
88.根据实施方式85所述的方法，其中热响应聚合物在约20℃至约70℃之间的温度至少部分不溶于水。
89.根据实施方式87或88所述的方法，其中热响应聚合物是至少1％不溶的。
90.根据实施方式44-89中任一项所述的方法，其中至少一种聚合物具有约5,000Da至约1,000,000Da的分子量。
91.根据实施方式44-90中任一项所述的方法，其中至少一种聚合物具有约1.0至约2.0的多分散指数(PDI)。
92.根据实施方式44-91中任一项所述的方法，其中至少一种聚合物是非离子物质、非表面活性剂、或其组合。
93.根据实施方式44-92中任一项所述的方法，其中至少一种酶是纤维素酶、或纤维素酶的混合物。
94.根据实施方式93所述的方法，其中底物是生物质、纤维素、二糖或其他多糖。
95.根据实施方式93所述的方法，其中底物是Avicel或芒草(Miscanthus)。
96.根据实施方式44-86中任一项所述的方法，其中至少一种酶是纤维素酶、半纤维素酶、或木质酶，或者两种或更多种纤维素酶、半纤维素酶和木质酶的混合物。
97.根据实施方式44-86中任一项所述的方法，至少一种酶是脂酶、或者脂酶的混合物。
98.根据实施方式44-86中任一项所述的方法，其中至少一种酶是淀粉酶、或者淀粉酶的混合物。
99.根据实施方式44-86中任一项所述的方法，其中至少一种酶是磷酸酶、或者磷酸酶的混合物。
100.根据实施方式44-86中任一项所述的方法，其中至少一种酶是木聚糖酶、或者木聚糖酶的混合物。
101.一种组合物，包括：
至少一种底物；
至少一种酶；和
至少一种聚合物，其包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；
条件是RA和RB的至少一个不是H。
102.一种组合物，包括：
至少一种残余底物；
至少一种产物；
至少一种酶；以及
至少一种聚合物，其包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；
条件是RA和RB的至少一个不是H。
103.根据实施方式101或102所述的组合物，其中各个RA和RB在每次出现时独立地为：
H；
未取代的烷基；
被1-5个选自环烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的烷基；
未取代的环烷基；
被1-5个选自烷基、芳基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的环烷基；
未取代的芳基；
被1-5个选自烷基、环烷基、杂环烷基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的芳基；
未取代的杂环烷基；
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的杂环烷基；
未取代的杂芳基；或者
被1-5个选自烷基、环烷基、芳基、杂环烷基、胺基、-C(O)NR’R”、-C(O)R’、-C(O)OR’、-OR’、阳离子部分或阴离子部分的基团取代的杂芳基；
其中各个R’和R”在每次出现时独立地为H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。
104.根据实施方式101或102所述的组合物，其中RA和RB在每次出现时独立地为H；未取代的烷基；或被1-5个-OH基取代的烷基。
105.根据实施方式101-104中任一项所述的组合物，其中RA在每次出现时是烷基；且RB是H。
106.根据实施方式101-105中任一项所述的组合物，其中R1在每次出现时是H或烷基。
107.根据实施方式101或102所述的组合物，其中具有式(I)结构的单体残基是式(I-A1)的单体残基：
其中：
RA1在每次出现时是未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、或者未取代或取代的-杂环基-；并且
RA2和RA3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
108.根据实施方式107所述的组合物，其中：
RA1在每次出现时是未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、或者未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、或者未取代或取代的-杂环烷基-；并且
RA2和RA3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂环烷基、或者未取代或取代的杂芳基。
109.根据实施方式107所述的组合物，其中RA1在每次出现时是未取代或取代的-烷基-。
110.根据实施方式107或109所述的组合物，其中RA2和RA3在每次出现时独立地为H、或者未取代或取代的烷基。
111.根据实施方式101或102所述的组合物，其中具有式(I)结构的单体残基是式(I-A2)的单体残基：
112.根据实施方式111所述的组合物，其中式(I-A2)的单体残基是式(I-A2a)的单体残基：
113.根据实施方式111所述的组合物，其中式(I-A2)的单体残基是：
114.根据实施方式101-113中任一项所述的组合物，其中至少一种聚合物是均聚物。
115.根据实施方式101-113中任一项所述的组合物，其中至少一种聚合物是共聚物。
116.根据实施方式115所述的组合物，其中共聚物是无规共聚物。
117.根据实施方式115或116所述的组合物，其中共聚物包括：
多个式(I-A2)的第一单体残基：
其中：
R1是H或烷基；
RA是未取代的烷基；且
RB是H；以及
多个式(I-A2)的第二单体残基，
其中：
R1是H或烷基；
RA是未取代的烷基、或被1-5个-OH基取代的烷基；
RB是H，
条件是第一单体残基的R1、RA和RB中的至少一个不同于第二单体残基的R1、RA和RB。
118.根据实施方式117所述的组合物，其中：
多个第一单体残基是且
多个第二单体残基选自
119.根据实施方式115或116所述的组合物，其中共聚物还包括多个具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基。
120.根据实施方式119所述的组合物，其中具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B1)或(II-B2)的结构：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；
r在每次出现时独立地为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-杂环基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
121.根据实施方式120所述的组合物，其中：
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-烷基-、未取代或取代的-烯基-、未取代或取代的-炔基-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-环烷基-、未取代或取代的-杂环烷基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的烷基、未取代或取代的烯基、未取代或取代的炔基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的环烷基、未取代或取代的杂环烷基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
122.根据实施方式120或121所述的组合物，其中r为1-10。
123.根据实施方式122所述的组合物，其中r为1、2、3、4或5。
124.根据实施方式120所述的组合物，其中式(II-B1)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B1a)的结构：
125.根据实施方式120所述的组合物，其中式(II-B1)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B2a)的结构：
126.根据实施方式120-123和125中任一项所述的组合物，其中R2和R3在每次出现时独立地为：
H；
未取代的C1-10烷基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10烷基；
未取代的C2-10烯基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10烯基；
未取代的C2-10炔基；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10炔基；
未取代的C6-12芳基；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12杂芳基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12杂芳基，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12环烷基；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12杂环烷基；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12杂环烷基，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代的C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子；或者
R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元C4-12杂环基，其具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子，其中杂环基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代。
127.根据实施方式120-123和125中任一项所述的组合物，其中R2和R3在每次出现时独立地为H、C1-5烷基、或被1-5个羟基取代的C1-5烷基。
128.根据实施方式120或125中任一项所述的组合物，其中在每次出现时独立地选自：
129.根据实施方式120-128中任一项所述的组合物，其中X在每次出现时为：
未取代的C1-10-烷基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C1-10-烷基-；
未取代的C2-10-烯基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-烯基-；
未取代的C2-10-炔基-；
被一个或多个独立地选自羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-炔基-；
未取代的C6-12-芳基-；
被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C6-12-芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C4-12-杂芳基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C4-12-杂芳基-，其中杂芳基被一个或多个独立地选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C3-12-环烷基-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C3-12-环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的未取代C3-12-杂环烷基-；
具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的C3-12-杂环烷基-，其中杂环烷基被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代；
未取代的C2-10-醚-；
被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、硝酸根、磷酸根和硫酸根的基团取代的C2-10-醚-；或者
-(CH2)jNHCO-，且j是至少为1的整数。
130.根据实施方式129所述的组合物，其中X在每次出现时是-乙二醇-、或-(CH2)jNHCO-。
131.根据实施方式130所述的组合物，其中X是-(CH2)jNHCO-，且j在每次出现时为1-10。
132.根据实施方式101-131中任一项所述的组合物，其中至少一种聚合物是热响应性的。
133.根据实施方式132所述的组合物，其中至少一种聚合物具有至少10℃的LCST。
134.根据实施方式101-133中任一项所述的组合物，其中至少一种酶是纤维素酶、或纤维素酶的混合物。
135.根据实施方式134所述的组合物，其中底物是生物质、纤维素、二糖或其他多糖。
136.根据实施方式135所述的组合物，其中底物是Avicel或芒草(Miscanthus)。
137.根据实施方式101-133中任一项所述的组合物，其中至少一种酶是纤维素酶、半纤维素酶、或木质酶，或两种或更多种纤维素酶、半纤维素酶和木质酶的混合物。
138.根据实施方式101-133中任一项所述的组合物，其中至少一种酶是脂酶、或脂酶的混合物。
139.根据实施方式101-133中任一项所述的组合物，其中至少一种酶是淀粉酶、或淀粉酶的混合物。
140.根据实施方式101-133中任一项所述的组合物，其中至少一种酶是磷酸酶、或磷酸酶的混合物。
141.根据实施方式101-133中任一项所述的组合物，其中至少一种酶是木聚糖酶、或木聚糖酶的混合物。
实施例
以下实施例仅是示意性的，并不意在以任何方式限制本公开内容的任何方面。
实施例1-11的一般步骤和材料
材料：除非另有注明，所有用于以下实施例中的化学品和溶剂是分析级的，且得自商业来源。薄层色谱分析(TLC)在EM试剂0.25mm的硅胶60-F254板上实施，通过254nm紫外(UV)照射、茚三酮或高锰酸钾着色可视化。使用EM硅胶60(230-440目)进行快速色谱纯化。用于纯化的洗脱体系通过TLC测定。对于大于50mL的样品使用Sorvall RC 5C(Sorvall，USA)Plus，或者对于1-50mL的样品使用SorvallLEGEND Mach 1.6R，或者对于小于1mL的样品使用Eppendorf MiniSpin Plus(Eppendorf，USA)进行室温和4℃的离心。高于室温的离心在Hettich Rotofix 46H(GMI，Ramsey，MN)上进行。使用LAB CONCOFreezone 4.5(Lab Conco，USA)对样品进行冻干。紫外-可见光分光测量在Varian Cary 50分光光度计(Agilent，USA)中进行。96孔板中的样品的荧光测量得自SpectraMax M2(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。色氨酸荧光测量使用50μL石英杯在Photon TechnologyInternational Quanta Master 4L式扫描分光荧光计(Lawrenceville，NJ)上得到，该扫描分光荧光计装配有LPS-220B 75-W氙灯和电源、具有集成点火器的A-101013灯箱、可切换814光子计数/模拟光电倍增管检测单元和MD5021电机驱动器。
凝胶渗透色谱(GPC)：GPC在Waters系统上实施，该Waters系统包括Waters 515泵、Waters 717自动进样器、和Waters 2414示差折射率(RI)检测器。SEC以1.0mL/min按顺序在PLgel Mixed B(10μm)和PLgel Mixed C(5μm)柱(Polymer Laboratories，均为300×7.5mm)中实施，使用具有0.2％LiBr的DMF流动相和作为校准标准品的线性PMMA(690-194,400MW)。柱保持在70℃。
NMR：1H和13C光谱用Bruker AVB-400(400Hz)分光计测量。化学位移提供为δ，相对于氯仿-d(δ7.26，s)或甲醇-d(δ3.31，p)以百万分率(ppm)为单位。多样性提供为如下：s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、dd(双二重峰)、p(五重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)或者app(明显)。耦合常数提供为以赫兹(Hz)计的J值。对于给定的共振的质子数量标为nH，且基于光谱积分值。
SDS-PAGE分析：对于蛋白质分析，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在来自Bio-Rad(Hercules，CA)的Mini-Protein设备上进行，遵循Laemmli的一般操作方案。参见Laemmli,Nature 1970,227,680。所有蛋白质电泳样品在100℃在1,4-二硫苏糖醇(DTT)的存在下加热至少10分钟，以保证任何二硫键的还原。凝胶在120V下运行70-90分钟以使条带较好地分离。将市售标记物(Bio-Rad)施用于各个凝胶的至少一个泳道以指配表观分子质量。凝胶成像在EpiChem3Darkroom系统(UVP，USA)上实施。在用考马斯亮蓝R-250(Bio-Rad)着色后，使用ImageJ软件(NIH，rsb.info.nih.gov/ij/)根据观察到的凝胶条带的标准光密度测量来估测蛋白质转化。
实施例1
LCST共聚物(1a)和(1b)的合成
N-Boc-O-(羧甲基)-羟基胺(S6)的合成
向500mL的圆底烧瓶中装入氨氧基乙酸(4g，36.6mmol)在CH2Cl2(100mL)中的混悬液。将溶液冷却至0℃且在搅拌时逐滴加入三乙胺(16mL，114mmol)以溶解所有的固体。向该混合物中加入二碳酸二叔丁酯(12g，55mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。将反应在0℃搅拌30分钟，然后在室温下继续1小时。将溶液用3份100mL的水洗涤。将含水部分合并并用两份100mL的EtOAc萃取；丢弃该EtOAc。用1M HCl将含水部分的pH调整至3.5，然后用五份50mL的EtOAc萃取，按需调整至保持pH 3.5。将合并的EtOAc经Na2SO4干燥，过滤，且在真空中除去溶剂以得到白色结晶粉末(5.8g，83％)。TLC：(MeOH:CH2Cl2，1:9)Rf＝0.08。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ1.48(s，9H)，4.47(s，2H)，7.94(s，1H)。13C NMR(100MHz，CDOD)：δ，27.1，47.0，72.3，81.4，157.8，171.3。
2-(3-(2-甲基丙-2-烯酰氨基)丙基氨基)-2-氧代乙氧基碳酸叔丁酯(MEPO)(S7)的合成
该单体的合成改自之前公开的步骤。参见Esser-Kahn&Francis,Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,3751-3754。向250mL的圆底烧瓶装入S6(32g，16.68mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.3g，19.98mmol)在CH2Cl2(100mL)中的混合物。对混合物进行超声以溶解固体。在搅拌时直接向溶液中加入N,N’-二环己基碳二亚胺(4.15g，20.11mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后冷却至0℃达10分钟以沉淀出尿素副产物。将混合物通过硅藻土过滤，将沉淀物用CH2Cl2(50mL)洗涤，且将滤液直接进行下一步骤。向500mL圆底烧瓶装入滤液并冷却至0℃。直接向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(1.5g，8.39mmol)(Polysciences Inc.；Warrington,PA,www.polysciences.com)，接着在搅拌下逐滴加入N,N’-二异丙基乙胺(6.1mL，35mmol)。使反应混合物在1小时内到达室温，然后在室温下继续3小时。将溶液用50mL CH2Cl2稀释并用三份150mL的水、接着用100mL盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。使用EtOAc:MeOH19:1进行快速色谱纯化，得到了澄清的粘性油(1.65g，62.4％)。TLC:(EtOAc)Rf＝0.2。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ，1.48(s，9H)，1.76(p，2H，J＝6.8)，1.95(s，3H)，3.31(q，4H，J＝6.9)，4.27(s，2H)，5.38(s，1H),5.73(s，1H)。13C NMR(100MHz，CD3OD):δ，17.5，27.2，28.7，36.0，36.5，75.0，81.7，119.2，139.9，158.3，169.8，170.2。
聚(MEPO-共-NIPAm)(1a)的合成
偶氮二异丁腈(AIBN)在使用前从纯MeOH中重结晶。N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)在使用前从己烷和甲苯中重结晶两次。使用摩尔比为1:9的S7:NIPAm和重量百分比为11.1:0.6:88.3的单体:AIBN:CH3OH实施聚合。将S7(378.5mg，1.2mmol)、NIPAm(1.22g，10.78mmol)和AIBN(80mg，0.49mmol)加入干净的闪烁瓶。将该瓶用N2净化并进行再填充。加入已被N2喷洒1小时的MeOH(12.67g，395.4mmol)，且各组分在N2下溶解。将混合物分至六个干净的闪烁瓶中，使N2流在各个瓶中通过溶液鼓泡10分钟，且将该瓶在N2下密封并置于60℃油浴中6小时。通过将聚合物从MeOH一次沉淀到冷乙醚中，随后离心，而从反应混合物中回收聚合物。将样品在1:1的CH2Cl2:三氟乙酸中溶解1小时，在真空中浓缩，然后用5MNaOH中和。将样品用Amicon Ultra 15mL 10kDa MWCO(Millipore)离心超滤膜纯化并冻干以得到最终聚合物。1H-NMR光谱分析显示出峰B:C的积分为1.00:5.25(图3A)，根据其计算出S7:NIPAm的摩尔比为1:10.5，或引入8.5％的S7。使用PMMA标准品的GPC分析表明Mn＝85,127，MW＝155,321，且PDI＝1.82。
聚(MEPO-共-NIPMa)(1b)的合成
遵循与共聚物(1a)相同的一般步骤。1H-NMR光谱分析显示出峰B:C的积分为1.00:5.18(图3B)，根据其计算出S7:NIPMa的摩尔比为1:10.36，或引入8.8％的S7。使用PMMA标准品的GPC分析表明Mn＝11,144，MW＝14,037，且PDI＝1.26。
共聚物(1a)和(1b)的聚合物尺寸通过尺寸排阻色谱(SEC)使用聚(甲基丙烯酸甲酯)标准品加以测定，共聚物(1a)和(1b)分别具有85,127和11,144Da的数均分子量(Mn)以及1.82和1.26的多分散指数(PDI)。
实施例2
共聚物(1a)和(1b)的小分子改性
在pH 4.5的缓冲液中制备20mg/mL的共聚物(1a)储备液。在pH 4.5的缓冲液中制备一系列1mL的120mM的甲醛、丙酮、3-氟异烟醛(具有10％的DMSO)和4-羟基-2-丁酮的储备液，以及1.2M的D-(+)-甘露糖和D-(+)-右旋糖的储备液。将750μL的聚合物溶液与各种小分子溶液以1:1在4ml的玻璃小瓶中混合。将反应在室温下孵育24小时，然后将过量的小分子除去且聚合物缓冲液在4℃通过8轮超滤(10kDa MWCO)交换为纯水。将其冻干，通过NMR光谱分析以确认改性，且根据以下步骤测定LCST。对聚合物(1b)的小分子改性遵循相同的步骤。
实施例3
LCST测量
将根据以上实施例2的步骤制备的改性共聚物(1a)和(1b)的聚合物样品以1mg/mL的浓度溶解于pH 4.5的缓冲液中且混合30分钟以保证完全溶解。将其转移至具有有搅拌子的小池(cuvette)中，并且在由LFI37515A数字温度控制仪器(Wavelength Electronics，Bozeman，MT)控制的Horiba Scientific F-3004Peltier装置(Kyoto，Japan)中在搅拌下以0.5℃/分钟的速率温热。每0.5℃快速移开小池并测量600nm处的吸光度，然后将小池返回到Peltier装置中。该实施例中的LCST对各个样品是最大吸光度的10％处的温度。
如图2B中所示，引入亲水的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基将NIPAm共聚物的LCST从均聚物的32℃增加到42.5℃，并且将NIPMa共聚物的LCST从43℃增加到58.1℃。
而且，该实施例的数据表明氨氧基也提供了柄基团，经其可以通过小分子淬灭调节LCST。如图2C中所示，共聚物(1a)和(1b)被改性至具有20.9℃至60.5℃范围内的LCST。
实施例4
EGPh质粒的构建、表达和纯化
得到了包含EGPh-pet24b质粒的BL21starDE3大肠埃希氏菌细胞。质粒最初既包含N端也包含C端His6标记(tags)，因此使用定点的诱变和限制性消化来除去N端His6标记并在N端组装AKT序列以使转氨化产率最大化。
N端正向引物：
5’GTGATGCCATATGGCTAAAACCCTGTTTGGTCAGGTCGTTCCGGTC TACGC-3’
C端反向引物：
5’-GGTGGTGCTCGAGTTTCTTGGACGTATTGC-3’
将纯化的质粒用Ndel和Xhol限制酶双重消化，然后在1％的琼脂糖凝胶上运行，以从原始EGPh基因中分离线性质粒。将与所需载体(vector)相应的条带切除并用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化。将PCR产物也用Ndel和Xhol限制酶双重消化。然后以1:3摩尔比的PCR插入物:载体而进行质粒连接(ligation)，将产物转化到XL1-蓝感受态大肠埃希氏菌细胞(Invitrogen)中，且将细胞铺在包含卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂板上。群落在4mL过夜培养基中生长，且将得到的质粒用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)纯化。通过测序(Sequetech,Mountain View,CA)证实所需突变的引入。将AKT-EGPh质粒通过热激转化到OneBL21(DE3)大肠埃希氏菌细胞(Invitrogen)中并铺在包含卡那霉素(50μg/mL)的Luria肉汤(LB)琼脂板上。使培养物在1L包含卡那霉素(50μg/mL)的LB中在37℃下生长，直到在600nm处观测到0.5的光密度(OD)。AKT-EGPh的表达通过加入0.1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)而诱导。使培养物在25℃生长12小时，然后在7,000rcf、4℃快速离心40分钟以使细胞团粒化。将细胞重悬于8mL细胞裂解缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)中，通过超声使用钝尖裂解20分钟，且将细胞碎片通过在4℃下在4,700rpm离心40分钟而除去。将澄清的细胞裂解物经2mL漂洗过的镍-次氮基三乙酸树脂(Ni-NTA)在15mL筒(cartridge)中在4℃洗涤1小时。将树脂结合的蛋白质用两份11mL的洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗涤，然后用四份1mL的洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱。
实施例5
EGPh的小分子改性
EGPh N端的转氨化遵循之前报道的方法实施。参见Witus等人，J.Am.Chem.Soc.2010,132,16812-16817。将在pH 4.5的缓冲液中浓度为50-60μM的EGPh与200mM 5’-磷酸吡哆醛(PLP)的pH 4.5溶液以1:1混合(图4A)。将样品在37℃反应1小时，然后将过量的PLP通过4℃下的8轮超滤(30kDa MWCO)除去。对照遵循相同的步骤进行但是没有PLP。
为使转氨化的蛋白质经苄基烷氧基胺(BnONH2)改性，将125μL250mM的BnONH2溶液(pH调节至5.5)加入625μL在pH 4.5缓冲液中的转氨化的EGPh(30μM)，且在室温下孵育42小时。将过量的BnONH2通过超滤(30kDa MWCO)除去。对照遵循相同的步骤进行但是使用未转氨化的EGPh。
为使转氨化的蛋白质经PEG改性，将1mM 5kDa的烷氧基氨-聚乙二醇(PEG)在pH 4.5缓冲液中的储备液与50μM转氨化的EGPh以1:1混合，且在室温下孵育42小时。将过量的PEG通过超滤(30kDaMWCO)除去。对照遵循相同的步骤进行但是使用未转氨化的EGPh。
为确定酶改性位点或所使用的条件是否对其催化活性有负面影响，检定了苄基烷氧基胺和5kDa-PEG-烷氧基胺改性的EGPh，以及其中蛋白质未被转氨化的两个对照。对照通过LC-MS和SDS-PAGE显示没有改性(分别为图4B和4C)。
此外，包括了未改性的、未转氨化的对照，以及已与甘露糖(600mM)孵育24小时的EGPh样品，以保证蛋白质活性不会受到用于LCST聚合物的淬灭步骤的影响。在40℃水浴下检定各蛋白质反应且在2、4、6、8和12小时移除100μL的等分试样。使用葡萄糖氧化酶-过氧化酶检定以OxiRed作为荧光底物分析上清液的可溶性糖的释放量。
分析可溶性还原糖的步骤遵循之前报道的方法实施，其使用葡萄糖氧化酶-过氧化酶检定以OxiRed作为底物。参见Kim等人，Biotechnol.Bioeng.2010,107,601-610。在透明底塑料96孔板中进行分析，各个样品以一式三份分析。在各个板中包括于pH 4.5缓冲液中的300、200、100、50、25和0μM的葡萄糖，以及150、100、50、25和12.5μM的纤维二糖的内标。将来自活性检定的冷冻等分试样在冰上解冻，然后用冷的缓冲液稀释0至20倍，然后将8μL的溶液与8μL的β-葡糖苷酶(10mM NaOAc中的5mg/mL，pH 4.6)在37℃孵育60分钟，以将所有纤维二糖转化为葡萄糖。然后测定存在的葡萄糖的量，通过加入65μL葡萄糖氧化酶(1.25U/mL)、辣根过氧化物酶(1.25U/mL)和磷酸盐缓冲液(pH 7.45)中的OxiRed(60μM)并在室温下在黑暗中孵育10分钟。形成的试卤灵(Resorufin)的量在光学读板器上在535nm处激发且在590nm处发射检测而被测量。形成的试卤灵的量与存在的葡萄糖的量相应。根据各板中的内标制作线性标准曲线(所有的r2＞0.97)，然后将其用于计算存在于各个活性检定样品中的葡萄糖等同物的量。对各个上清液的一式三份的测量求平均，然后将一式三份的活性检定样品的测量求平均以计算各个数据点。
如图4D所示，两种改性内切葡聚糖酶的活性相对于未被改性的对照略有降低，但是差值通常在检定的标准差之内。已暴露于苄基烷氧基胺、PEG-烷氧基胺和甘露糖的未被改性的酶样品的活性也略微较低，但在各个时间点在未被改性的对照的活性的一个标准差内。根据该实施例，观察到无论N-端改性本身还是所使用的反应条件都对内切纤维素酶活性没有显著影响。
实施例6
EGPh-聚合物结合物的构建
将1mL共聚物(1a)在pH 4.5缓冲液中的40mg/mL储备液与1mL50μM转氨化的EGPh在4mL玻璃小瓶中合并，并用力地吸取以混合。将溶液在室温下孵育24小时，然后加入2mL于pH 4.5缓冲液中的1.2M D-(+)-甘露糖，通过吸取混合，且将新的混合物在室温下另外孵育24小时。将溶液转移至15mL Falcon管中且在55℃水浴中加热10分钟以沉淀出聚合物，然后在55℃和2000rpm离心5分钟。除去上清液且将团粒化的聚合物重悬于相同体积的室温缓冲液中(pH 4.5)。将该步骤再重复三次以达到总计4次沉淀循环，然后将任何过量的甘露糖通过三个4℃的超滤循环除去(10kDa MWCO)。将浓缩的聚合物-EGPh结合物转移至Eppendorf管中且在4℃储存。将小部分纯化的结合物的缓冲液使用超滤(30kDa MWCO)交换为纯水，冻干，并用色氨酸荧光分析蛋白质浓度。使用相似的步骤进行共聚物(1b)的连接。共聚物(1a)的对照遵循相似的步骤进行但使用未转氨化的EGPh。
蛋白质定量：使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测量未改性的、转氨化的、PEG化的和BnONH2改性的EGPh浓度，具有139,020M-1cm-1的消光系数和49,023Da的分子量。使用色氨酸荧光测定聚合物结合物的蛋白质浓度。一式三份地制备pH 4.5的缓冲标准品，包含5mg/mL甘露糖淬灭的共聚物和7.06、5.01、3.0、1.0和0μM的EGPh。在pH 4.5的缓冲液中制备一式三份的5mg/mL的冻干聚合物-EGPh结合物样品。收集各个标准品和实验样品从290nm至400nm的荧光光谱，在280nm处激发。将各个标准组的最大荧光强度相对于蛋白质浓度作图，并对数据点施用线性拟合(所有R2＞0.99)。使用该线性拟合，用荧光最大值计算冻干样品中的蛋白质浓度。制备保留的、未冻干的蛋白质-聚合物结合物的连续稀释物，并测量其荧光强度以确定与5mg/mL的冻干样品相匹配的稀释水平。根据这些数据，确定保留的聚合物-EGPh结合物的蛋白质和聚合物浓度。以μMEGPh/mg材料计的蛋白质浓度对共聚物(1a)-EGPh来说是0.520μM/mg，对共聚物(1b)-EGPh来说是0.177μM/mg，且对组合未转氨化的EGPh的共聚物(1a)对照来说是0.066μM/mg。
实施例7
改性EGPh、聚合物-EGPh结合物、和再循环的聚合物-EGPh结合物的活性
改性EGPh的活性：为测量酶活性，一式三份地检定各个蛋白质样品。将1.3mL部分的Sigmacell纤维素粉末(Sigma-Aldrich)在50mMNaOAc缓冲液(pH 4.5)中的1％(w/v)混悬液加入至包含搅拌子的1.5mL Eppendorf管中。各个蛋白质样品的储备液在21.4～26.6M的范围内制备，且将9.85～12.23μL的这些储备液加入至合适的Eppendorf管中以得到0.2μM的最终蛋白质浓度。从各个反应管中取出t＝0小时样品，之后将其置于处于搅拌盘上的40℃水浴中。在2、4、6、8和12小时后取出样品以便分析。为测量反应，用力摇晃各个管以确保底物和蛋白质的均匀分布，且将100μL的等分试样立即移出并转移至干净的空Eppendorf管中。将该等分试样以13.3k rpm离心1分钟，然后将澄清的上清液转移至0.6mL的Eppendorf管中且在干冰中立即冷冻。将上清液等分试样储存在20℃直到分析可溶性还原糖的量。
聚合物-EGPh结合物的活性：一式三份地同时检定了NIPAm和NIPMa共聚物-蛋白质结合物以及游离的未改性EGPh对照。将900μLSigmacell纤维素粉末(Sigma-Aldrich)在50mM NaOAc缓冲溶液(pH4.5)中的1.1％(w/v)的混悬液加入至Eppendorf管中，该Eppendorf管包含搅拌子和1.6mg甘露糖淬灭的共聚物(1a)或者1.1mg甘露糖淬灭的共聚物(1b)和搅拌子。将溶液在室温强力地混合30分钟以确保聚合物的溶解。不向对照样品中加入聚合物。将两种聚合物-蛋白质结合物和EGPh对照的100μL储备液加入至合适的Eppendorf管中，以使所有样品的最终蛋白质浓度为0.2μM，并且两种聚合物-EGPh结合物样品的聚合物均为2mg/mL。从各个管中取出100μL的等分试样以测量还原糖的初始量，然后将各管置于搅拌盘上的40℃水浴中。遵循与改性EGPh活性检定中所使用相同的步骤在2、4、6、8和12小时取出随后的等分试样。
参考图5A，在2小时后观测到，共聚物(1a)-EGPh和共聚物(1b)-EGPh均显示出游离EGPh约一半的内切葡聚糖酶活性，但是在之后的时间点观测到样品中的酶活性在收敛。12小时后，任何活性的初始差异减弱，且还原糖的总浓度的差异在统计学上不显著。
未改性EGPh在β-葡糖苷酶存在下的活性：同时以一式三份检定具有和不具有添加的β-葡糖苷酶的未改性EGPh，遵循之前活性检定相似的步骤。各个反应的总体积为在Eppendorf管中0.5mL Sigmacell纤维素粉末在50mM NaOAc缓冲液(pH 4.5)中的1％(w/v)的混悬液。所有反应的EGPh浓度为0.2μM，在6个反应的3个中加入β-葡糖苷酶至0.2μM的浓度。将其置于搅拌盘上的40℃水浴中且使其反应12小时，在该点可溶性还原糖的水平遵循与所有其他检定相同的步骤加以测量。结果显示可溶性还原糖没有增加。
参考图5B，观察到加入的β-葡糖苷酶没有增加未改性酶的整体活性。这表明因纤维二糖的产物抑制不太可能是活性损失的原因。
再循环聚合物-EGPh结合物的活性：同时以一式三份检定聚合物-蛋白质结合物和游离的未改性EGPh对照。将1.0mL Sigmacell纤维素粉末(Sigma-Aldrich)在50mM NaOAc缓冲液(pH 4.5)中的1％(w/v)混悬液加入至Eppendorf管中，该Eppendorf管包含1.6mg甘露醇淬灭的共聚物(1a)和搅拌子。将溶液在室温强力地混合30分钟以确保聚合物的溶解。不向对照样品中加入聚合物。将两种蛋白质样品的储备液加入合适的Eppendorf管中，以使所有样品的最终蛋白质浓度为0.2μM，并且聚合物-EGPh结合物样品的聚合物为0.2mg/mL。从各个管中取出100μL的等分试样以测量还原糖的初始量，然后将管置于搅拌盘上的40℃水浴中并使其反应12小时。12小时结束时移出50μL等分试样以测量还原糖的量。除去搅拌子且将包含聚合物的管在55℃加热5分钟以使聚合物沉淀，然后在2k rpm在55℃离心10分钟以使聚合物团粒化。然后将所有管在13.2k rpm在室温下离心1分钟以使底物团粒化。将澄清的上清液移除且用冰冷的50mM NaOAc缓冲液(pH4.5)替换，加入干净的搅拌子，并用力摇晃各管3分钟以确保底物和聚合物的均匀混悬。然后再重复两次检定步骤，以移出100μL等分试样以测量初始还原糖开始，总计两次沉淀和三个12小时的检定期。为取各反应的等分试样，将各个管用力地摇晃以确保底物和蛋白质的均匀分布，且立即将等分试样移出并转移至干净的空Eppendorf管中。将该等分试样在13.3k rpm离心1分钟，然后将澄清的上清液转移至0.6mL的Eppendorf管中并在干冰中立即冷冻。将样品储存在-20℃直到进行对可溶性还原糖的量的分析。
参考图5C，在初始反应12小时后，共聚物(1a)-EGPh结合物产生的还原糖的水平为对照的86％。然而，其在两次材料的沉淀和回收循环后保持了其初始活性的68％和63％。相反，游离酶仅保持了其初始活性的11％和4％。当从所有样品中取出上清液时，只有聚合物结合物样品的多数蛋白质沉淀在底物团粒中。对游离对照来说任何随后的活性是由于团粒化的不溶性纤维素中携带的酶。经三次循环，聚合物-酶结合物能够产生的游离还原糖的量比对照产生的游离还原糖的量增加了1.7倍(图5D)。
尽管该实施例的结果表明聚合物-酶结合物能够再循环，但仍将经三次12小时反应循环的结合物活性与经一次36小时反应的游离蛋白质活性相比较，以确定相对于简单地使游离酶反应延长的时间段，使酶再循环是否实际提供了任何益处。使游离的未改性EGPh与Sigmacell在40℃反应36小时，在0、12、24和36小时测量游离的还原糖。与以上结果一致，游离酶在12小时达到最大活性限制，在接下来的24小时还原糖仅不多地增长(图5E)。在12小时处，聚合物-酶结合物的活性是游离对照的91％；然而，通过使酶再循环，经36小时后，相比于使游离酶进行反应的情况，产生的还原糖更多78％。
实施例8
共聚物(1a)-EGPh结合物对芒草的水解活性
得到了酸预处理的芒草(奇岗)。将该底物切成约1英寸的片，然后在190℃经受1.5％(w/w)硫酸、25％生物质负载(w/w)约1分钟。处理后，将生物质磨成更小的片。然后将其用去离子水全面地洗涤直到滤液具有中性pH且没有可检测的葡萄糖。将材料在104℃干燥24小时，然后用研钵和杵磨成细粉。然后根据以上实施例7的步骤评价共聚物(1a)-EGPh结合物的活性和再循环能力。
如图6所示，未改性酶对照对于芒草的活性显著低于以上实施例7中对于Sigmacell的活性。结合物对于该底物的活性也降低，但降低到比对照更低的程度。在相同的酶负载下，结合物在第一循环后产生了显著更多的还原糖。
在随后的再利用循环中，观察到结合物的活性降低，可能是由于某些蛋白质可能仍已吸附到生物质上且最终失活。然而，在循环2和3中结合物保持的活性是初始对照的104％和83％。回收结合物的能力，与因表面活性剂作用引起的增加的活性相结合，经三轮后使还原糖的量增加了2.8倍。
实施例9
改性和未改性EGPh的催化活性
提供了未改性EGPh、以及BnONH2结合物、5k PEG结合物、NIPAM+甘露糖结合物和NIPMA+甘露糖结合物。对各个样品，将1％w/v的Sigmacell混悬液在40℃暴露于在50mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的0.2μM蛋白质。在各个时间点，收集上清液并使其进行量热检定以测定游离葡萄糖和纤维二糖。参见图7A。
参考图7B，未改性EGPh的活性在存在0.1％的数种不同的聚合物添加剂的情况下加以评价。当将未改性EGPh在存在未连接的pNIPAm的情况下加入微晶Sigmacell中时，意外地观察到酶活性增加。观察到未连接的pNIPAm使酶活性增加了2-3倍，在12小时的时间内提供了多达3倍量的可用纤维二糖/葡萄糖。对于pNIPAm更显著地观察到该效果，但是对于pNIPMa也观察到该效果。
实施例10
纤维素酶活性的聚合物增强
对于该实施例中的所有活性检定，在50mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中使用0.2μM EGPh和以1％w/v负载的不溶性纤维素底物Sigmacell一式三份地评价各个样品。以2mg/mL(0.2％w/v)包括添加剂。体积范围在0.5-1.3mL。各检定取决于聚合物在28℃、30℃或40℃进行，且进行12小时，除另有说明外。具体地，用于聚(丙烯酰胺)、聚(NIPAm)(均聚物)的温度为28℃。对于所有淬灭的NIPAm共聚物，包括甘露糖、PEG、聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)、聚(丙烯酸-共-马来酸)的温度是30℃。对于甘露糖淬灭的NIPMa的温度为40℃。在各个检定中包括采用相同条件但是不具有添加剂的对照。
此外，该实施例中使用的聚合物具有以下尺寸：
PEG：Mw 20k
聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)：Mw/Mn 520/150k，80wt％丙烯酰胺
聚(丙烯酸-共-马来酸)：Mw 70k，丙烯酸:马来酸2.2:1
聚(PNIPAm)：Mw 155k
聚(丙烯酰胺)：Mw 1,000k
NIPAm共聚物：通常Mw 130-160k*
NIPMa共聚物：Mw 14k
*基于凝胶渗透色谱(GPC)使用DMF作为溶剂和PMMA标准品测定。
为测量活性，从各个反应中取出等分试样，将其离心以使底物团粒化，且使用葡萄糖氧化酶-过氧化酶检定以OxiRed作为荧光底物测定上清液中可溶性还原糖的量。为比较数据，将葡萄糖等同物的浓度相对于各组的对照标准化。对于时间过程检定，在各个标明的时间点取出等分试样，然后使反应返回至水浴。将数据相对于各个时间点的对照的活性标准化。
为研究某个小分子淬灭剂的作用，用以下三种具有不同官能团的小分子淬灭NIPAm共聚物样品：丙酮、甲醛和4-羟基-2-丁酮(分别为样品6、7和8)。参考图8A，观察到不同的小分子淬灭剂没有改变关于甘露糖淬灭的聚合物所观察到的聚合物作用。
还测试了其他聚合物以确定活性的增加是否大体是由于可溶性聚合物。再次参考图8A，在存在聚(乙二醇)(样品2)的情况下未观察到聚合物作用，且在加入聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和聚(丙烯酸-共-马来酸)(分别为样品10和11)时观察到活性的降低。最显著地，在加入聚(丙烯酰胺)(样品3)时不存在聚合物作用，但在存在聚(NIPAm)的情况下活性增加，聚(NIPAm)是仅由NIPAm组成而没有任何具有氨氧基的单体残基的聚合物(样品4)。结构上，聚(丙烯酰胺)与聚(NIPAm)的区别仅在于在NIPAm的氮上存在异丙基。
时间过程
以甲醛或4-羟基-2-丁酮淬灭的NIPAm共聚物进行时间过程。参考图8B，该时间过程研究显示出，上清液中可溶性还原糖随时间逐渐增加。
进行另外的时间过程，以将在存在游离NIPAm共聚物(12％甘露糖淬灭的氨氧基共聚单体)的情况下掘越氏热球菌内切葡聚糖酶(EGHPh)的活性与EGPh-共聚物生物结合物(在存在添加的游离共聚物以使聚合物总计2mg/ml的情况下)的活性进行比较，其中使用Avicel(图8C)或者酸和蒸汽预处理的奇岗(图8D)底物。参考图8C和8D两者，时间过程研究显示，当使用Avicel(图8C)或芒草底物(图8D)时，相对于生物结合物，游离酶和共聚物的组合使还原糖更快地产生且坪值更高。
对各种来源且具有不同活性的纤维素酶的聚合物作用的宽度(breadth)
在源自一系列不同有机体的纤维素酶以及通过不同作用产生纤维素的酶上测试NIPAm共聚物的作用，所述酶包括来自掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶EGPh、来自黑曲霉的内切葡聚糖酶、来自长梗木霉的CBHI、以及来自里氏木霉的celluclast。参考图8E和8F，该测试显示出，关于纤维素底物(图8E)和木质纤维素底物(图8F)，NIPAm共聚物均持续地改善这些纤维素酶的还原糖产率。在这些测试中，共聚物由8％的氨氧基共聚单体组成并经甘露糖淬灭。以0.2μM包括来自掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶(EGPh)、来自黑曲霉的纯化内切葡聚糖酶、或者来自长梗木霉的纯化CBHI；以0.02mg/mL包括来自里氏木霉的商业纤维素酶混合物Celluclast 1.5L。
救援检定
实施一系列救援检定，以确定针对酶-共聚物组合观察到的活性增强是通过酶-共聚物相互作用还是底物-共聚物相互作用介导。
在这些救援实验中，将各组样品(600μL)在40℃孵育12小时，在此时取出等分试样(100μL)以测定还原糖。接着，向一些反应中加入酶或共聚物并且使其都再孵育12小时。对于各样品的实验条件为：1)蛋白质对照，在整个24小时孵育期间仅0.2μM的EGPh；2)共聚物作用对照，在整个24小时孵育期间0.2μM的EGPh和0.2％的共聚物；3)在整个24小时孵育期间0.2μM的EGPh，在t＝12小时加入0.2％的共聚物以确定酶的活性是否能够被“救援”；以及4)在整个24小时孵育期间0.2％的共聚物，在t＝12小时加入0.2μM的EGPh以确定是否仅是共聚物和底物的相互作用增加了有效蛋白质活性。
参考图10A，在贯穿整个孵育时间存在共聚物的条件下救援检定使游离共聚物的酶活性增强作用再生(将样品2与样品1相比较)。仅在12小时的时间点加入共聚物没有救援酶活性(参见样品3)。在将共聚物预孵育12小时后加入酶，在另外12小时孵育期后引起还原糖的大量产生。
对较高EGPh负载的聚合物作用
为确定共聚物的酶活性增强作用是否依赖于蛋白质浓度，在不同的蛋白质浓度测试酶活化。
参考图10B，该研究显示出，共聚物介导的酶活性增强在酶浓度为0.2μM时是3.9倍，在1μM的酶时是3.0倍，在2μM的酶时是2.5倍。
随时间对Celluclast的聚合物作用
为确定时间依赖的聚合物作用是否在使用商业纤维素酶混合物时被观察到，用Celluclast在Avicel底物上进行时间过程研究。
参考图10C，在12小时和24小时的孵育期之后，观察到Celluclast的1.3倍的共聚物活化，而在36小时的孵育期之后，观察到1.4倍的共聚物活化。
用共聚物预处理Avicel
为确定增加用共聚物“预处理”Avicel的时间是否对表观酶活性产生了时间依赖性的增加，进行了另外的时间过程研究。
在该研究中，将Avicel与共聚物在40℃孵育0、12、24或36小时并保持搅拌；然后加入EGPh至0.2μM，并在12小时后测定游离的还原糖。作为对照，在加入EGPh之前，在不存在聚合物的情况下将Avicel在40℃孵育36小时。
参考图10D，该图显示，随着预孵育时间从0小时增加至12小时、24小时和36小时，酶活性逐渐增加。
聚合物电荷对EGPh活性的作用
为确定聚合物电荷如何影响酶活化，将带负电聚合物、带正电聚合物以及中性聚合物的作用进行比较。
为此，带电聚合物由以下共聚物基制备，该共聚物基与用于其他检定的甘露糖淬灭的聚合物相同，但是该共聚物基用2-甲酰基苯磺酸(CAS 1008-72-6)或Rappoport’s盐(4-甲酰基-1-甲基吡啶苯磺酸酯，CAS 82228-89-5)淬灭以制备分别带负电和正电的共聚物。重复该检定以确认结果。重复的检定包括中性共聚物对照(甘露糖淬灭的共聚物)。EGPh的pI估计为约5.85；在pH 4.5，其是带正电的。
参考图10E，该图显示加入带负电的共聚物相比于对照得到了更低的酶活性，然而加入带正电或中性的共聚物得到了与对照反应相比较更高的酶活性。
在其他添加剂存在下共聚物的作用
为确定来自共聚物的活性增强是通过与针对其他添加剂观察到的相同的机理，还是通过不同的机理发生，在存在共聚物、包括BSA和吐温的其他添加剂的情况下，或者在存在共聚物和其他添加剂的组合的情况下比较酶活性。
检定在标准条件下进行，但不是加入聚合物，而是以2mg/mL的终浓度加入牛血清白蛋白(BSA，使用前脱盐)和表面活性剂吐温20。为确定共聚物是否通过不同机理起作用，还以1mg/mL的BSA或吐温20以及1mg/mL的共聚物制备样品，总的添加剂负载为2mg/mL。总负载对所有样品来说保持在2mg/mL，以确保任何活性的增加不是由于总添加剂的增加。用Avicel或芒草作为底物来实施系列实验。
参考图10F，该图显示当用Avicel作为底物时，单独加入吐温和BSA相对于对照反应增加了酶活性。添加剂与共聚物的组合相比于单独加入添加剂进一步增加了酶活性。
参考图10G，该图显示当用芒草作为底物时，向酶反应加入BSA和吐温20增加了酶活性。添加剂与共聚物的组合相对于单独的添加剂并未引起酶活性的进一步增加。
相似聚合物的作用
为确定与NIPAm共聚物具有相似结构的聚合物是否对木质纤维素底物介导相似的增强作用，以及为帮助确定NIPAm共聚物的何种官能团对活性增强是必需的，用一系列不同的聚合物进行该研究。
在该研究中，包括了与标准NIPAm共聚物具有非常相似的结构的两种聚合物。包括了聚(NIPAm)，其不包含任何氨氧基共聚单体。包括了聚(丙烯酰胺)，其与NIPAm相同但不包含N-异丙基。聚(NIPAm)在与用于制备NIPAm共聚物相同的条件下合成；Mn 49,575Da；Mw155,535；PDI 3.14。聚(丙烯酰胺)来自Polysciences,Inc.，～Mw 1,000,000Da；PDI～2.5；其在使用前用水洗涤。底物是酸和蒸汽预处理的芒草；检定温度降低至28℃以保持所有添加剂可溶(pNIPAm的LCST为32℃)。用Avicel作为底物重复该实验；在该实验中检定温度降低至28℃。
参考图10H，该图显示当用芒草作为底物时，聚(丙烯酰胺)相比于对照反应未介导酶活性的增加，而加入标准NIPAm共聚物或者缺乏氨氧基共聚单体的NIPAm聚合物引起了酶活化水平的增加。
参考图10I，该图显示当使用Avicel作为底物时，聚(丙烯酰胺)相比于对照反应未介导酶活性的增加，而加入标准NIPAm共聚物或者缺乏氨氧基共聚单体的NIPAm聚合物引起了酶活性的可比较的增加。
添加剂对EGPh内切葡聚糖酶活性的作用
为确定添加剂如BSA、吐温20或者NIPAm共聚物是否对EGPh的内切葡聚糖酶活性具有直接的作用(例如，通过改变酶的底物周转率)，或者共聚物是否通过不同的机理增加活性(例如，降低非特异性结合，增加向无定形区域的通道等等)，进行了一系列偶氮染料-CMC实验。
偶氮染料-CMC检定涉及使用染料浸渍的羧甲基纤维素(CMC)作为底物。CMC是内切葡聚糖酶的特异性可溶底物。当与内切葡聚糖酶孵育时，释放出低分子量的染料碎片。加入沉淀剂溶液，通过离心从溶液中清除所有的高MW碎片，用紫外-可见光(UV-Vis)分光光度计测量上清液的颜色，且通过与标准曲线进行比较确定酶活性。对以下数据组，用已知量的EGPh以一式三份制备标准曲线。根据该标准曲线，各个实验样品的EGPh活性以uM计算。
CMC检定根据厂商说明书(Megazyme，Inc.)进行，但将检定体积降低至100μL。1mg/mL偶氮染料-CMC，75mM乙酸钠pH4.5，标准曲线由四种EGPh浓度和0μM值组成。通常，向50μL的各个实验样品中加入50μL 2x偶氮染料-CMC溶液，且使其在40℃反应60-90分钟(来自同一数据组的所有样品/标准品(std)反应相同的时间量)。在加入250μL的沉淀剂溶液(80％乙醇、一些锌、乙酸钠，pH 5)且离心后，将200μL上清液转移至96孔板且用读板器测定所有样品在590nm处的吸光度。
在100μL偶氮染料-CMC连同0.2μM EGPh的孵育过程中包括添加剂。使BSA在4.7mg/mL脱盐且仅显示了两次复制；2mg/mL的PEG20K、吐温20以及甘露糖淬灭的NIPAm共聚物具有三次复制。数据中参考的对照与标准曲线的0.2μM复制相对应。
参考图10J，该图显示了BSA并未显著地影响酶活性，而加入PEG将酶活性降低了＞20％，而吐温20和NIPAm共聚物将酶活性降低了约15％。
在12小时w/Avicel和添加剂之后上清液中EGPh的残余活性
进行了确定在存在或不存在添加剂的情况下在Avicel检定的澄清上清液中EGPh的残余活性的研究。进一步进行该研究以确定多少EGPh与Avicel底物非特异性地结合，或者在标准检定条件下没有活性。
遵循之前概述的标准Avicel条件，使用0.8μM的EGPh(而不是0.2μM)。在这些检定中以2mg/mL的浓度包括添加剂；使用PEG 20k、吐温20、脱盐的BSA、以及甘露糖淬灭的NIPAm共聚物。在40℃孵育12小时后，将50μL来自各个实验复制的澄清上清液加入50μL 2x偶氮染料-CMC且遵循偶氮染料-CMC步骤以测量残余活性。数据中参考的对照是来自Avicel检定的仅0.8μL EGPh的对照。各个Avicel实验复制用一偶氮染料-CMC读取测定。
参考图10K，该图显示在PEG存在下进行的检定中没有保留残余酶活性，然而如果在BSA、吐温20或NIPAm共聚物的存在下进行检定则保留了基本的酶活性。
实施例11
NIPAm或NIPMa共聚物的LCST调整
本实施例中使用的共聚物由8-9％具有氨氧基的单体残基和剩余N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)组成。这些共聚物根据以上实施例1中提到的步骤合成。采用这两种共聚物和六种不同的小分子(丙酮、甲醛、甘露糖、右旋糖、4-羟基-2-丁酮、3-氟异烟醛)，根据以上实施例2的步骤使聚合物改性以得到LCST在20℃至60℃范围内的材料。
以NIPAm与6.7、11.3、16.6和21.7％的氨氧基甲基丙烯酰胺，以及以NIPMa与5.8和11.4％的氨氧基甲基丙烯酰胺制备共聚物。这些共聚物的LCST如以上实施例3中所述加以测量。通过引入增加量的具有氨氧基的单体残基，得到了LCST高达53.1℃的NIPAm共聚物。对于NIPMa共聚物，得到了高达56.9℃的LCST(图9A)。当将这些共聚物的LCST相对于所包括的具有氨氧基的单体残基的摩尔百分数作图时，数据密切地遵循线性拟合(图9B)。
实施例12-18的一般步骤和材料
材料：除非另有注明，所有使用的化学品和溶剂是分析级的，且得自商业来源。薄层色谱分析(TLC)在EM试剂0.25mm硅胶60-F254板上实施，通过254nm紫外(UV)照射、茚三酮或高锰酸钾着色可视化。使用EM硅胶60(230-440目)进行快速色谱纯化。用于纯化的洗脱体系通过TLC测定。对于大于50mL的样品使用Sorvall RC 5C(Sorvall，USA)Plus，或者对于1-50mL的样品使用Sorvall LEGENDMach 1.6R，或者对于小于1mL的样品使用Eppendorf Mini Spin Plus(Eppendorf，USA)进行室温和4℃的离心。高于室温的离心在HettichRotofix 46H(GMI，Ramsey，MN)上进行。使用LAB CONCO Freezone4.5(Lab Conco，USA)对样品进行冻干。常规规模的紫外-可见光分光测量在Varian Cary 50分光光度计(Agilent，USA)中进行。96孔板中的样品的吸光度和荧光测量得自SpectraMax M2(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。
凝胶渗透色谱(GPC)：GPC在Waters系统上实施，该Waters系统包括Waters 515泵、Waters 717自动进样器、和Waters 2414示差折射率(RI)检测器。SEC以1.0mL/min按顺序在PLgel Mixed B(10μm)和PLgel Mixed C(5μm)柱(Polymer Laboratories，均为300×7.5mm)中实施，使用具有0.2％LiBr的DMF流动相和作为校准标准品的线性PMMA(690-194，400MW)。柱保持在70℃。
聚(NIPAm-共-MEPO)(S1)的合成：其以2g的规模遵循之前报道的步骤多次合成。1H-NMR光谱分析显示MEPO:NIPAm的摩尔比取决于批次为1:10.2至1:11.3，或者8.1-8.9％的MEPO引入。用PMMA标准品的GPC分析显示，各批次具有相似的质量分布，大约Mn＝68,300，Mw＝163,000，且PDI＝2.4。
(S1)的小分子改性：10mg/mL(S1)溶液以及50mM于NaOAc(pH 4.5)中的60mM丙酮、甲醛、或4-羟基丁酮，或者600mM甘露糖的溶液在室温下反应24小时。移除未反应的小分子且将改性聚合物的缓冲液通过8轮超滤(10kDa MWCO)交换为纯水。将聚合物冻干并通过NMR光谱加以分析以确认所有氨氧基团的改性。
EGPh的表达和纯化：使来自掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶(EGPh)根据以上实施例4所示的步骤表达和纯化。
芒草的制备：将奇岗切成大约1英寸的片，然后在190℃在25％生物质负载以1.5％(w/w)的硫酸进行酸预处理约1分钟。在随后的蒸汽爆破步骤后，压制固体以除去液体，然后将其用去离子水全面地洗涤直到滤液具有中性的pH且不具有可检测的葡聚糖。将固体在104℃干燥24小时，用研钵和杵磨成细粉，然后在室温下储存直到使用。
其他添加剂：遵循以上所示的步骤制备NIPAm的均聚物，以1/5的规模且不具有MEPO。采用PMMA标准品的GPC分析表明Mn＝49,575，Mw＝155,535，PDI＝3.1。使牛血清白蛋白(BSA)在使用前脱盐。将聚(乙二醇)(PEG)(Mn＝20k；Sigma-Aldrich)和聚(丙烯酰胺)(Mw＝1,000k；Polysciences,Inc.)在使用前用去离子水全面地洗涤。吐温20以得到的使用。
其他酶：Celluclast得自Sigma-Aldrich且在使用前脱盐。来自黑曲霉的内切葡聚糖酶和来自长梗木霉的纤维二糖水解酶I(CBHI)得自Megazyme International(Bray,Ireland)且以得到的使用。
EGPh活性检定：所有检定一式三份地进行。除非另有说明，各检定在1.3mL的Eppendorf管中以0.5mL的规模实施，在50mM NaOAc(pH 4.5)中，使用1％(w/v)的Avicel pH 101微晶纤维素(Sigma-Aldrich)或者酸预处理和蒸汽爆破的芒草，0.2μM的EGPh，在40℃水浴中进行12小时。除非另外说明，以2mg/mL包括甘露糖改性的(S1)，且使其在加入酶之前与底物彻底地混合。对照不包含添加剂。12小时后，将管在13.2k rpm离心两个5分钟，其间旋转180°。将等份的澄清上清液转移至0.6mL的Eppendorf管中并在干冰上冷冻，然后在-20℃储存直到对可溶性还原糖进行定量。对时间点实验，各个样品的总体积为1.3mL，浓度与以上所示的相同。在各个标示的时间点，将反应管从水浴中移出，摇晃以确保内容物的均匀分布，将100μL的等分试样转移至干净的空Eppendorf管中，并将反应管返回水浴中。将移出的等分试样在13.3k rpm离心10分钟且将澄清的上清液转移至新的管中并冷冻直到之后的分析。
可溶性还原糖分析：底物的水解通过遵循之前报道的方法测量可溶性还原糖而被确定，其中使用配对的葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶检定以OxiRed作为荧光底物。所有样品用透明底塑料96孔板以一式三份测定，具有250、200、150、100、50和0μM葡萄糖的内标曲线。还包括100和50μM的纤维二糖样品以确定完全水解为葡萄糖。来自活性检定的冷冻等分试样在冰上解冻且用pH 4.5缓冲液稀释，然后将8uL的等分试样与8uLβ-葡糖苷酶(5mg/mL，在10mM的NaOAc中，pH 4.6)在96孔板中混合，并在37℃孵育60分钟，以完全水解任何可溶性寡糖。然后通过在125mM磷酸盐缓冲液(pH 7.45)中加入65μL葡萄糖氧化酶(1.25U/mL)、辣根过氧化物酶(1.25U/mL)和OxiRed(60μM)，并在室温下在黑暗中孵育15分钟，而对葡萄糖进行定量。形成的试卤灵的量在光学读板器上进行测量，在535nm处激发且在590nm处发射检测，且该值与存在的葡萄糖的量相应。使用内标来对各个板制作线性标准曲线(r2＞0.98)，该线性标准曲线被用于计算各个孔中存在的葡萄糖等同物。对各个上清液样品一式三份的测量求平均，然后对一式三份检定样品的值求平均以计算各个数据点。
HPLC：对一系列在Avicel上检定的酶实施葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的分析。将澄清的上清液样品通过0.45μM的PTFE过滤器进行过滤，然后注射到具有相同材料的保护柱(3×50mm)的3×250mm的PA200柱(Dionex，现为Thermo Fisher Scientific)中，并使用ICS-3000色谱系统(Dionex)进行分析。将化合物在30℃洗脱，流速0.4mL/min，流动相缓冲液A(0.1M NaOH)和缓冲液B(0.1M NaOH，1M NaOAc)，梯度如下：在25分钟内从0％的B至13.4％的B，然后在0.1分钟内至30％的B，2.9分钟等度，然后0％的B保持7分钟。使用脉冲安培检测以糖类标准4-电位波形检测化合物。将葡萄糖、纤维二糖(Sigma)和纤维三糖(Seikagaku Biobusiness,Tokyo,Japan)标准品用于校准。该分析结果显示在下表1中。
表1 在Avicel上检定的酶的HPLC分析
残余EGPh活性测定：澄清上清液中EGPh的残余内切葡聚糖酶活性用偶氮染料-羧甲基纤维素(偶氮染料-CMC)(Megazyme International,Ireland)测量，通常遵循供应商的说明书。为测量与空气接触孵育后的残余活性，遵循如上所示EGPh检定的一般步骤来以一式三份准备水解反应，用0.8μM的EGPh和Avicel、芒草或无底物。为测量隔绝空气孵育后的残余活性，反应建立在包含搅拌子的1mL HPLC小瓶中，使用950μL的总体积且使用与空气接触反应相同的浓度，其恰好装满小瓶。使用塑料HPLC盖来密封各个反应。各盖与溶液表面直接接触且足够透明以视觉确定在各个样品中隔绝几乎所有的空气。将两组样品均在40℃搅拌12小时，然后将反应物在13.2k rpm离心10分钟以使底物团粒化。为测量残余活性，将60μL澄清的上清液与60μL偶氮染料-CMC混悬液(根据供应商说明书制备)在0.6mL的Eppendorf管中混合且在40℃孵育75分钟。加入300μL的停止液，混合内容物，使反应在室温下静置10分钟，然后将管在13.2k rpm下离心10分钟以使未反应的底物团粒化。将300μL上清液转移至透明底96孔板中且使用光学读板器在590nm测定吸光度。包含0.8μM的酶但没有任何底物或在先孵育的对照也包括进来。相比于1.2、0.8、0.4、0.2和0μM的EGPh的标准曲线，测量酶活性；将包含聚合物的样品与包括2mg/mL甘露糖改性的(S1)的标准曲线相比较。
残余EGPh浓度的测定：水解后残余EGPh的浓度用改良的Bradford检定(Bio-Rad)测定。在将EGPh与如上所述的用于测定残余活性的各种底物孵育12小时之后，将20μL等份的澄清上清液与200μL稀释的试剂在透明底96孔板中混合，且使其在室温下放置40分钟。溶液在595nm的吸光度用光学读板器测量。将酶含量与1.2、0.8、0.4、0.2和0μM的EGPh标准曲线相比较；将包含聚合物的样品与包括2mg/mL甘露糖改性的(S1)的标准曲线相比较。
底物体积测定：对于Avicel测定，向六个具有搅拌子的2mL玻璃瓶中的各个加入4.970～5.007mg的底物。向三个作为对照的小瓶中加入490μL缓冲液。向其他三个小瓶中加入480μL缓冲液和10μL 100mg/mL的甘露糖改性的(S1)以使聚合物总浓度为2mg/mL。将各小瓶封盖且使其在40℃水浴中搅拌12小时。然后移除搅拌子且使小瓶在室温静置30分钟以使底物沉淀，然后对所有六个小瓶拍摄照片。在Adobe Photoshop中调整该照片的对比度和亮度以使该图像锐化。为测定底物体积，使用Adobe Illustrator用闭合路径勾勒底物边缘和总反应体积，然后通过软件计算各个形状的面积。在具有所有六个小瓶的一张图片上进行分析，以确保对所有样品采用了相同的观察角度。重复该步骤以测定芒草体积。
实施例12
NIPAm共聚物对内切葡聚糖酶活性的作用
本实施例阐明了NIPAm共聚物对内切葡聚糖酶活性的作用。为确定聚合物对EGPh随时间最大程度的增强，在1.3mL的规模实施水解，且在标示的时间点取出等分试样以测量还原糖。
在不加入共聚物的情况下，发现Avicel的水解在12小时后稳定，在80小时达到葡萄糖等同物的最大产率1.03mM。在存在共聚物的情况下，在56小时之前观察到明显的产物浓度线性增加，在80小时达到最大7.5mM的葡萄糖等同物。这相当于对照活性的7.3倍(图11A)。该曲线的正斜率表明，在包括共聚物的样品中仍存在活性酶，但在没有共聚物的样品中仅在24小时之后EGPh几乎全部失活。
在芒草上，在不存在共聚物的情况下，EGPh活性在56小时减慢，在72小时达到最大0.26mM的葡萄糖等同物。共聚物的加入引起了在40小时后达到最大水解，在该时间点观察到产率增加2.4倍(图11B)。
因此，本实施例阐明了共聚物在Avicel和芒草上均增加水解产率的能力。
实施例13
NIPAm共聚物对不同酶类型的作用
本实施例阐明了NIPAm共聚物对各种类型的纤维素酶的作用。
除Celluclast之外，在Avicel和芒草两者上在共聚物存在下还对来自黑曲霉和来自长梗木霉的电泳同质的内切葡聚糖酶检定了12小时。使用类似的蛋白质浓度以允许与EGPh相比较。如图12A和12B所示，在被检定的两个底物上对所有纤维素酶均观察到增加的水解产率。最重要的是，共聚物对Celluclast活性的作用在芒草上比在Avicel上更大，使得木质纤维素水解能够达到与在单独的纯化纤维素上观察到的相似的水平。
在Avicel上检定的样品还通过HPLC加以分析，以对葡萄糖、纤维二糖、和纤维三糖的浓度进行定量。根据HPLC分析计算出的葡萄糖等同物证实了OxiRed检定的精确度，并显示出三种水解产物的比率对于任何被检定的酶在具有和不具有共聚物的样品之间并未有明显改变。
实施例14
聚合物结构的作用和聚合物负载的作用
本实施例研究了NIPAm共聚物的作用和聚合物负载的作用。EGPh对两种底物的水解在聚(NIPAm)以及聚(丙烯酰胺)的存在下进行测试，聚(丙烯酰胺)具有与聚(NIPAm)相同的骨架但缺少N-异丙基。
如图13A所示，聚(丙烯酰胺)对水解没有影响。相比之下，聚(NIPAm)在Avicel和芒草上均将糖化产率增加至稍高于在共聚物存在下观察到的水平。这表明NIPAm单体本身即是底物水解增加的基础，且N-异丙基是特别需要的结构元素。然而，氨氧基单体提供了必要的柄基团，经其将材料的LCST调整至可用的范围，使得增强作用的任何相应的降低如果不是理想的折衷也是可容忍的折衷。还测试了以甘露糖之外的小分子封端的共聚物，揭示了小分子的结构对观察到的整体增强几乎没有作用(图13C)。
还研究了共聚物浓度与12小时后水解产率之间的相关性(图13B)。在共聚物负载低至0.001g/g DM时，Avicel水解的68％增加是明显的，在高于0.02g/g DM时获得的额外产率是可以忽略的。芒草需要更大的聚合物负载，0.001g/g DM仅对水解产生21％的增加。由此，产率增加与聚合物负载持续正相关。有趣的是，水解产率在0.01g/g DM显示出局部最大值，然后在0.02g/g DM降低。该结果在多个实验中观察到且与底物类型无关。这表明共聚物表现出浓度依赖的聚集(aggregation)行为，或者具有在该浓度范围内切换的多个作用模式。我们当前在正进行的实验中评价这些可能性。
实施例15
NIPAm共聚物对EGPh吸附和稳定性的作用
本实施例研究了NIPAm共聚物对EGPh吸附和稳定性的作用。为测定在不存在底物(Avicel或芒草)的情况下共聚物在界面处对蛋白质稳定性的作用，将0.8μM的EGPh在具有或不具有2g/L共聚物的情况下搅拌12小时。作为第二变量，在这些反应中包括或者排除空气。
在离心除去变性蛋白质后，用偶氮染料-羧甲基纤维素(偶氮染料-CMC)对澄清上清液中的活性内切葡聚糖酶的量进行定量，偶氮染料-CMC是在降解时释放染料的可溶性内切葡聚糖酶底物。如图14A所示，共聚物的存在使得无论是否排除空气，活性保留超过80％。然而，在不存在共聚物的情况下，如果在与空气接触下搅拌，观察到的酶活性是可以忽略的，并且如果隔绝空气，酶活性保留了低于50％。观察到来自搅拌的剪切应力以及与溶液表面处的疏水-亲水界面接触均是在纤维素酶失活过程中的重要因素。这两个因素通过加入NIPAm共聚物得以改善。使用与活性结果相关的Bradford检定评估可溶性蛋白质浓度(图14B)。
为测量NIPAm可能如何影响蛋白质吸附，在将1％的Avicel或芒草混悬液与4mg/g DM的EGPh和0.2g/g DM的共聚物搅拌12小时后，测量残余内切葡聚糖酶的活性。该实验还在存在或不存在空气的情况下进行，以使非制备性底物结合的作用与空气-水界面的作用分离。如图14A所示，关于Avicel的结果如果略低于那些不具有任何底物的结果，则非常相似。关于芒草的结果显示，在任何测试的情况下上清液中的酶活性是可以忽略的，无论是否包括空气或共聚物。使用Bradford检定进行定量的残余蛋白质浓度在所有芒草的情况下也非常低。
实施例16
NIPAm共聚物与纤维素底物的相互作用
本实施例研究了NIPAm共聚物与Avicel和芒草底物的相互作用。为确定NIPAm共聚物是否能够“救援”非制备性地吸附在底物表面上的酶，首先将EGPh与Avicel或芒草在不存在聚合物的情况下孵育12小时。在这之后，加入共聚物且继续水解反应另外12小时。在两种底物上，在24小时水解期间的中途加入NIPAm共聚物对产率没有积极影响，表明共聚物对酶解吸附没有影响或者酶已经被变性(图15)。
为确定NIPAm共聚物是否与酶无关地改变了底物结构，将NIPAm共聚物与Avicel或芒草孵育12小时以对纤维素进行预处理。然后加入EGPh，且在另外的12小时后测量水解活性。在该点的产率清楚地显示，用共聚物预处理Avicel相比于同时加入酶和聚合物的情况引起了明显更高的糖化作用。预处理的Avicel的水解在12小时后相比于仅包含纤维素酶和底物的对照达到了6.0倍的产率。同时组合包含共聚物、纤维素酶和Avicel的反应在12小时和24小时分别获得了3.9和7.3倍的产率。观察到共聚物本身没有催化底物水解，如在没有酶的情况下在12小时后可以忽略水平的还原糖所表明的。观察到该预处理作用对于芒草更微小。与同时组合所有元素的对照相比，在加入EGPh之前用共聚物预处理芒草12小时仅引起了12小时水解产率的微小增加。
这些发现有力地支持了纤维素-共聚物相互作用与酶无关，其中NIPAm以有利于水解活性的方式改变了纤维素。芒草中木质素的存在可能是通过阻断大部分纤维素表面并防止共聚物的接近，阻止了这种相互作用，或者共聚物优选与疏水的木质素相互作用且因此不易于与纤维素本身相互作用。
为进一步探查纤维素-共聚物关联，将1％DM的Avicel混悬液与0.2g/g DM的NIPAm共聚物孵育0、12、24或36小时。然后加入EGPh并在另外的12小时结束时测定水解产率。如下表2所示，用共聚物进行较长的Avicel预处理与较高的糖化水平相关。将Avicel在缓冲液中在不具有共聚物的情况下孵育36小时也对产率略有改善，最可能的是底物的膨胀，但是该增加不能解释在延长的共聚物预处理情况下所观察到的增强。
表2.用NIPAm共聚物预处理Avicel的数据汇总
在水解实验执行过程中，定性地观察到，即使在不添加酶的情况下，NIPAm共聚物对孵育后的底物体积也具有很大的影响。该影响通过将Avicel或芒草与共聚物在40℃搅拌12小时，且然后使底物在室温下沉淀30分钟而被定量。两种底物体积均增加约40％，如下表3中的数据所示。
表3.NIPAm对底物膨胀的影响
实施例17
比较NIPAm共聚物与其他添加剂对Celluclast活性的影响
本实施例比较了NIPAm共聚物与其他添加剂例如聚(乙二醇)(PEG)、吐温、和牛血清白蛋白(BSA)的作用。通过在存在2mg/gDM的Celluclast并补充0.4mg/g DMβ-葡糖苷酶的情况下使用0.2g/gDM的添加剂负载将1％DM的芒草混悬液水解12小时，比较四种添加剂的作用。所有四种添加剂均导致水解的增强，但是NIPAm共聚物引起了最高的产率增加，水解产物的产率比其他添加剂高出14～30％的范围(图16)。
另外，为研究NIPAm与另一添加剂之间的潜在协同效应，在除0.1g/g DM的NIPAm共聚物(总的添加剂负载为0.2g/g DM)之外还存在0.1g/g DM的BSA、吐温或PEG的情况下，通过Celluclast水解芒草。将这些水解产率与在单独存在各种添加剂的情况下获得的水解产率相比较，向其他添加剂添加NIPAm共聚物将纤维素转化率增加至仅存在共聚物的情况下测定的水平，但是未观察到产率的进一步增加(图16)。
实施例18
NIPAm共聚物对酶负载的影响
本实施例阐明了NIPAm共聚物的各种酶负载的影响。为研究使用更多典型的酶浓度的共聚物增强，在2～100mg/g DM的Celluclast负载范围内研究NIPAm共聚物对芒草的12小时水解产率的影响。这些反应还补充Celluclast水平20％的β-葡糖苷酶。如图17所示，通过加入NIPAm共聚物，仅在25mg/g DM的酶负载下即达到最大的底物水解，与没有添加剂的情况下所需的65mg/g DM相比降低了62.5％。即使在最高的酶负载下，包括的NIPAm共聚物引起了6-9％的产率增长，从而进一步表明共聚物具有比防止蛋白质吸附更大的效果。
实施例19
以橄榄油作为底物时NIPAm共聚物对脂酶的影响
本实施例阐明了用橄榄油作为底物时NIPAm共聚物对脂酶的影响。向12个1.5mL的Eppendorf管中加入0.5mL的于100mM Tris缓冲液pH 7.7中的1mg/mL褶皱念珠菌脂酶。向这些管中的六个中以2mg/mL的总浓度加入NIPAm共聚物。三个没有共聚物的管(对照)和三个具有共聚物的管(对照+共聚物)保持在4℃不搅拌。向另外三个没有共聚物的管(-聚合物)和另外三个具有共聚物的管(+聚合物)中添加搅拌子，且将其在30℃下搅拌。在标示的时间点，使用橄榄油作为底物检定所有12个蛋白质样品的脂酶活性。
为检定活性，将350μL 100mM Tris缓冲液pH7.7、25μL蛋白质样品、和75μL橄榄油加入2mL有搅拌的Eppendorf管中。使混合物在37℃搅拌30分钟。为停止反应，加入300μL具有0.5％w/v百里酚酞pH指示剂的100％乙醇且颠倒各管以混合。然后用50mM氢氧化钠滴定各混合物，直到达到相同的淡蓝色。通过将350μL缓冲液和25μL蛋白质样品组合还对各个蛋白质样品制备了空白组。使该溶液在室温下静置直到活性样品停止，在该点一起加入300μL具有指示剂的乙醇和75μL以防止任何底物水解。也滴定这些空白，且从活性蛋白质值中减去空白值，以得到中和任何新产生的酸所需的氢氧化钠的体积。
相对于对照测定的酶活性汇总于图18和下表4中。观察到在通过脂酶水解橄榄油的过程中包括NIPAm共聚物大体增加了水解产率，如通过“对照+聚合物”样品的较高活性所表明的。观察到脂酶在30℃搅拌时活性随时间逐渐变低，如通过在标示的时间点“-聚合物”样品的活性降低所显示的。通过在30℃搅拌的样品中包括NIPAm共聚物，该随时间的活性损失得到防止(“+聚合物”样品)。由此，观察到共聚物针对蛋白质失活具有保护作用，否则观察到蛋白质失活。
表4
相对于对照的活性
实施例20
以p-NPD作为底物时NIPAm共聚物对脂酶的影响
NIPAm共聚物对发色底物对硝基苯基月桂酸酯(p-NPD)的脂酶水解速率的作用在透明底96孔板中对各聚合物浓度以一式三份测定。向各个孔加入10μL 0.2mg/mL褶皱念珠菌脂酶。然后，加入10μL 0、0.1、0.5、1、2、4、6或10mg/mL的标准NIPAm共聚物且通过移液管混合。然后使用多通道移液管，将80μL于100mM Tris pH7.7中的500μM p-NPD加入各个孔中且用读板器每30秒监测405nm处的吸光度，进行42分钟。在检定过程中各个孔的终浓度为0.02mg/mL褶皱念珠菌脂酶；400μM的p-NPD；0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6或1mg/mL的NIPAm共聚物；100mM的Tris HCl缓冲液，pH7.7。
脂酶的动力学汇总在图19A中。当用发色底物对硝基月桂酸酯进行检定时，观察到脂酶活性的速率随着NIPAm共聚物浓度的增加而降低。无论共聚物浓度怎样，达到了相同总水平的底物水解，但是观察到较大的共聚物浓度需要脂酶较长的反应时间以完全水解存在的底物。然而，当用橄榄油作为底物检定脂酶时，没有观察到该对活性的不利影响(参见图18)。不希望限于任何理论，据信聚合物不直接作用于脂酶本身，而是聚合物单独与底物相互作用或者介导脂酶-底物的相互作用。
向12个1.5mL的Eppendorf管中加入0.3mL于100mM Tris缓冲液pH 7.7中的0.2mg/mL的褶皱念珠菌脂酶。向这些管中的6个中加入NIPAm共聚物至2mg/mL的总浓度。三个没有共聚物的管(对照)和三个具有共聚物的管(对照+共聚物)保持在4℃不搅拌。向另外三个没有共聚物的管(-聚合物)和另外三个具有共聚物的管(+聚合物)中添加搅拌子，且将其在室温下搅拌。在标示的时间点，使用p-NPD作为底物检定所有12个蛋白质样品的脂酶活性。
在透明底96孔板中检定酶活性。向各个孔中加入10μL蛋白质样品。然后使用多通道移液管，向各个孔中加入90μL于具有5％v/v乙醇的100mM Tris pH 7.7中的500μM p-NPD。使板在室温下静置12.5分钟，然后用读板器测定各个孔在405nm处的吸光度。在检定过程中各个孔的终浓度为0.02mg/mL褶皱念珠菌脂酶；450μM的p-NPD；0或0.2mg/mL的NIPAm共聚物；100mM的Tris缓冲液，pH 7.7；以及5％v/v的乙醇。
相对于对照测量的酶活性汇总于图19B和下表5中。观察到在通过脂酶水解对硝基月桂酸酯的过程中包括NIPAm共聚物略微降低了水解产率，如通过“对照+聚合物”样品与“对照”相比较低的活性所表明的。观察到室温下搅拌的脂酶的活性随时间迅速损失，如通过“-聚合物”样品所显示的。在该延长的搅拌过程中包括NIPAm共聚物有助于防止某些活性损失，如通过“+聚合物”样品所显示的。当将该数据与图18和19A中所示的数据结合时，不希望限于任何理论，据信NIPAm共聚物由于随时间的搅拌可以有助于防止脂酶失活。
表5
相对于对照的活性
实施例21
用4-MUP作为底物时NIPAm共聚物对碱性磷酸酶的影响
向12个1.5mL的Eppendorf管中加入0.5mL于100mM MOPS缓冲液pH 8中的0.001mg/mL的碱性磷酸酶(AP)。向这些管中的6个中加入NIPAm共聚物至2mg/mL的总浓度。三个没有共聚物的管(对照)和三个具有共聚物的管(对照+共聚物)保持在4℃不搅拌。向另外三个没有共聚物的管(-聚合物)和另外三个具有共聚物的管(+聚合物)中添加搅拌子，且将其在30℃下搅拌。在标示的时间点，使用荧光底物4-甲基伞花基磷酸酶(4-MUP)检定所有12个蛋白质样品的碱性磷酸酶活性。
在透明底96孔板中检定碱性磷酸酶的活性。向各个孔中加入10μL蛋白质样品。然后使用多通道移液管，向各个孔中加入190μL于100mM MOPS pH8中的的100μM 4-MUP。每20秒通过读板器在360nm处激发且在449nm处射来监测荧光，进行10分钟。在检定过程中各个孔的终浓度为0.0001mg/mL的AP，90μM的4-MUP，0或0.2mg/mL的NIPAm共聚物，以及100mM的MOPS缓冲液pH 8。
如图20A-C所示，未观察到包括NIPAm共聚物对碱性磷酸酶使底物4-MUP去磷酸化的能力具有显著的影响。当在30℃搅拌延长的时间时，如在图20B和20C中通过“-聚合物”样品所示，碱性磷酸酶逐渐失去活性。27小时后，观察到搅拌的酶的活性为在4℃保持不搅拌的对照的约一半；在52小时的搅拌下，检测到可忽略的活性。通过包括NIPAm共聚物，当在30℃下搅拌时观察到酶随时间保留了全部的活性，如通过样品“+聚合物”所示。
实施例22
另外的共聚物的合成
本实施例描述了数种另外的共聚物的合成。
一般聚合步骤：偶氮二异丁腈(AIBN)在使用前从纯甲醇中重结晶。N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)在使用前从己烷和甲苯中重结晶。2-(3-(2-甲基丙-2-烯酰氨)丙基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(MEPO)根据以上实施例1所示的步骤合成。其他单体以得到的使用。通常，以1.2g总单体重量的规模实施聚合。将单体和AIBN加入到干净的闪烁瓶中。将该瓶用N2净化并进行再填充。加入之前已被N2喷洒1小时的甲醇，且各组分在N2下溶解。使N2流在各个瓶中通过溶液鼓泡10分钟，且将该瓶在N2下密封并置于60℃油浴中5-6小时。通过将聚合物从甲醇一次沉淀到冷乙醚中，随后离心，而从反应混合物中回收聚合物。共聚单体的比例通过1H-NMR测定。
LCST测量：对下述的聚合物1-10，通过将1mL 1mg/mL的各聚合物在50mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的溶液以2℃/分钟的速率在水浴中加热来测定LCST。给出的LCST值是从澄清无色的溶液开始转变为略不透明时的温度，通过视觉测定。
各聚合物的合成在以下进一步详述。结构和相应的LCST(如果测定)汇总在图21中。
聚合物1：使用1:9的MEPO:NIPAm摩尔比以及11.1:0.6:88.3的单体:AIBN:CH3OH重量百分比进行聚合。以1.2g的规模实施聚合，且在所有组分溶解之后将反应混合物分到6个小瓶。氮通过内容物鼓泡且将小瓶如上所述密封。在聚合物在乙醚中沉淀之后，将干燥的样品溶解在1:1的CH2Cl2:三氟乙酸中1小时以切裂保护基团，在真空中浓缩，然后用5M的NaOH中和。将样品用Amicon Ultra 15ml 10kDaMWCO(Millipore)离心超滤膜纯化且冻干以提供干燥的聚合物。然后通过将10mg/mL脱保护的聚合物溶液与于50mM乙酸钠缓冲液pH4.5中的600mM甘露糖在室温下孵育24小时，而用甘露糖对氨氧基侧基进行改性。通过将改性的聚合物通过8轮超滤(10kDa MWCO)交换为纯水而除去未反应的小分子。将聚合物冻干且通过NMR光谱加以分析以确定所有氨氧基的改性。
聚合物2：遵循一般的聚合步骤，用1.2mmol的NIPAm、0.3mmol的2-(甲基丙烯酰氧基)乙基三甲基苄基硫酸铵、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物3：遵循与聚合物1相同的步骤，用4.93mmol的NIPMa、0.55mmol的MEPO、40mg的AIBN和8.2ml的甲醇，且将反应分至4个小瓶中。遵循对聚合物1的步骤将该聚合物回收、脱保护并经甘露糖改性。
聚合物4：遵循一般的聚合步骤，用1.53mmol的NIPMa、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物5：遵循一般的聚合步骤，用1.26mmol的NIPMa、0.2mmol的N-羟甲基丙烯酰胺、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物6：遵循一般的聚合步骤，用1.27mmol的NIPMa、0.22mmol的N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物7：遵循一般的聚合步骤，用1.26mmol的NIPMa、0.25mmol的N-叔丁基丙烯酰胺、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物8：遵循一般的聚合步骤，用0.75mmol的NIPMa、0.74mmol的N-羟甲基丙烯酰胺、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物9：遵循一般的聚合步骤，用0.74mmol的NIPMa、0.74mmol的N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
聚合物10：遵循一般的聚合步骤，用1.00mmol的丙烯酰胺、0.51mmol的N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺、10mg的AIBN和2ml甲醇。通过将该聚合物沉淀到冷乙醚中而进行分离。
实施例23
实施例22的共聚物的作用的比较
本实施例将以上实施例22中合成的热响应共聚物对Avicel和芒草的水解的作用进行比较。
检定在1.5mL的Eppendorf管中以0.5mL的规模一式三份地实施，在50mM的NaOAc(pH 4.5)中，具有1％(w/v)的Avicel pH101微晶纤维素(Sigma-Aldrich)或酸预处理和蒸汽爆破的芒草，0.2μM的EGPh(0.01mg/g的干物质底物)，在30℃水浴中经过标示的时间长度。除非另外指明，以2mg/mL(0.2g/g DM)包括聚合物，且在加入酶之前使其与底物彻底混合。对照不含添加剂。通过磁力搅拌盘在足以完全混悬底物但不至于强力到引起涡旋的速度下搅拌样品。12小时后，将管在13.2k rpm下离心两个5分钟，其间旋转180°。将等份的澄清上清液转移至0.6mL的Eppendorf管中且在干冰上冷冻，然后在-20℃储存直到对可溶性还原糖进行定量。
如图22所示，聚合物1-10的加入相对于对照增加了酶活性。在所有测试的聚合物中，观察到由NIPAm和甘露糖封端的氨氧基甲基丙烯酰胺组成的共聚物在除了一种情况的所有情况下具有最大的酶活性增加。观察到聚合物7，即NIPAm和N-(叔丁基)丙烯酰胺的共聚物，在12小时将Avicel的EGPh水解增强至略高于聚合物1的水平，但该差异在统计学上不显著。观察到包含NIPAm的共聚物比包含NIPMa的共聚物(聚合物1相比于聚合物3)更加有效。比较共聚物中包括的非热响应单体，观察到单体结构与NIPAm(聚合物7)的结构越相似，活性增强水平与标准共聚物的活性增强水平越相似。该通过一系列结构相似的共聚物进行的活性增强比较说明，在增加纤维素和木质纤维素底物的酶水解的该实施例中，NIPAm共聚物是所测试聚合物中最有效的。

Claims (20)

1.一种方法，包括使至少一种底物与至少一种酶和至少一种聚合物接触，所述聚合物包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；
条件是RA和RB中的至少一个不是H。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括酶促分解至少一部分的所述底物以产生至少一种产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括通过将至少一种所述聚合物从所述至少一种产物中分离而回收至少一种所述聚合物。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括：
i)提供另外的底物、另外的酶或酶的混合物、以及至少一种所回收的聚合物；
ii)使所述另外的底物与所述另外的酶或酶的混合物在至少一种所回收的聚合物的存在下接触；以及
iii)酶促分解至少一部分的另外的生物质。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中具有式(I)结构的单体残基是式(I-A1)的单体残基：
其中：
RA1在每次出现时是未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、或者未取代或取代的-杂环基-；并且
RA2和RA3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中具有式(I)结构的单体残基是式(I-A2)的单体残基：
7.根据权利要求6所述的方法，其中式(I-A2)的单体残基是：
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中至少一种所述聚合物是均聚物或共聚物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述共聚物包括：
多个式(I-A2)的第一单体残基：
其中：
R1为H或烷基；
RA为未取代的烷基；且
RB为H；以及
多个式(I-A2)的第二单体残基，
其中：
R1为H或烷基；
RA为未取代的烷基、或被1-5个-OH基取代的烷基；
RB为H，
条件是所述第一单体残基的R1、RA和RB中的至少一个不同于所述第二单体残基的R1、RA和RB。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
所述多个第一单体残基为并且
所述多个第二单体残基选自
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述共聚物还包括多个独立地具有式(II-B1)或(II-B2)结构的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；
r在每次出现时独立地为大于或等于1的整数；
X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、未取代或取代的-芳基-、未取代或取代的-杂芳基-、未取代或取代的-杂环基-、未取代或取代的-醚-、或-(CH2)jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1；并且
R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra，其中Ra为H、烷基或羟基；或者R2和R3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取代的杂环基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中式(II-B1)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基具有式(II-B1a)或(II-B2a)的结构：
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中X在每次出现时是-乙二醇-或-(CH2)jNHCO-。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中至少一种所述聚合物是热响应性的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中至少一种所述聚合物具有至少10℃的LCST。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。
17.一种水解生物质的方法，包括：
a)提供生物质、水解酶和热响应聚合物；
b)使所述生物质与所述水解酶在所述热响应聚合物的存在下接触，
其中所述热响应聚合物为：
聚N-异丙基丙烯酰胺，
聚N-异丙基甲基丙烯酰胺，或者
包括多个第一单体残基和多个第二单体残基的共聚物，其中各个所述第一单体残基独立地选自N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺及其任意组合，且各个所述第二单体残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基；以及
c)水解至少一部分的所述生物质以产生糖。
18.一种组合物，包括：
至少一种底物；
至少一种酶；以及
至少一种聚合物，所述聚合物包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；
条件是RA和RB中的至少一个不是H。
19.一种组合物，包括：
至少一种残余底物；
至少一种产物；
至少一种酶；以及
至少一种聚合物，所述聚合物包括多个具有式(I)结构的单体残基：
其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且
RA和RB在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基；
条件是RA和RB中的至少一个不是H。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述至少一种酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。
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