CN104823966A - 一种微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法，冷冻保存载体呈长方形、方形或圆形的水平状或凹槽状，大小为可以承载1-3个0.1-10.0uL的冷冻液微滴，以透明的塑料材料或透明的玻璃材料制作。冷冻保存载体上准备好冷冻液微滴后插入盖油的精子培养皿内，用显微注射针抓取精子置入冷冻液微滴，取出冷冻保存载体并用吸水纸吸干矿物油，快速冷冻，解冻时将冷冻保存载体直接插入ICSI皿中，利用其37℃矿物油复苏精子。本发明将冷冻保存载体插入盖油的精子培养皿内抓精子冷冻，无需特殊的保湿装置，不用担心冷冻液微滴蒸发，操作极其简单，极大的提高了无精子症患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性，精子回收率可达100%，精子存活率约60%。

Description

一种微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法

技术领域

本发明涉及医学中的辅助生育领域，更具体地讲，涉及微量精子（含单个精子，如睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子、严重少精症患者的精子等）的冷冻保存方法和和冷冻保存载体。

背景技术

辅助生殖临床上，无精子症患者一般要进行附睾或睾丸的诊断性穿刺，以确保促排卵周期能够获得足够的精子用于卵细胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection , ICSI ）治疗。由于每个ICSI 治疗周期的妊娠率仅50％左右，为了获得妊娠，部分患者需要重复数次ICSI 治疗。为了尽可能地减少患者反复穿刺取精的痛苦，更好地保全男性的生精功能，医学工作者试图对无精子症患者诊断性穿刺获得的或ICSI治疗周期剩余的微量活动精子进行冷冻保存，以后在女方取卵日将复苏后存活的精子用于ICSI，这将大大提高该类患者辅助生育治疗的灵活性和可靠性。严重少精子症患者的精子不稳定，预防性冷冻该类患者的精子也非常必要，这将避免女方取卵日无精子可用而取消周期。

微量精子冷冻保存是辅助生殖领域的难题。传统的精子冷冻采用1.8mL的冷冻管(Cryovial)作为冷冻载体，冷冻/复苏过程需要对精子作2-4次离心洗涤，每一步操作都会造成精子不同程度的损失。而睾丸或附睾穿刺获得的精子一般数量少、活力差，常规冻存复苏后，往往难以找到足够的活动精子进行ICSI，所以传统的精子冷冻方法不适用于对穿刺获得的精子进行冷冻保存。

中国专利申请200510061871.5提供一种睾丸精子的冻存与复苏方法，该发明以胞浆抽空的透明带为载体，将活检的睾丸精子装入封闭的透明带内，进行精子冷冻保护剂的添加和洗脱，冻存复苏过程中精子封闭保存于透明带内，该方法中透明带精子复苏不必经过繁锁的不连续密度梯度分离及洗涤离心过程，可直接在显微操作仪下吸出精子，直接用于ICSI。但该方法需要动物(小鼠或大鼠)卵或人卵的透明带，材料来源困难(人卵透明带很难获得)，且存在伦理争议(ICSI时宿主DNA有与精子一起被注入人卵的风险)，所以该方法很难广泛应用于辅助生殖临床。

本课题组曾发明一种微量精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置（中国专利申请200810042695.4），该发明以玻璃或聚苯乙烯制成的长片状或槽状的冷冻片装载精子，精子置于冷冻片上的微滴中冷冻，在热油中解冻，精子回收率接近100％，但该方法需要制造饱和湿度条件的专用湿盒，以保证冷冻过程中微滴不蒸发，操作过程繁琐、耗时长，这极大限制了该发明在临床上的广泛使用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种操作简单快捷的微量精子（含单个精子，如睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子、严重少精症患者的精子等）冷冻保存载体。

本发明的第二个目的在于提供一种微量精子（含单个精子，如睾丸穿刺精子、附睾穿刺精子、严重少精症患者的精子等）的冷冻和解冻方法。

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种微量精子冷冻保存载体，其特征在于，所述冷冻保存载体呈长方形、方形或圆形的水平状或凹槽状，大小为可以承载1-3个0.1-10.0uL的冷冻液微滴，以透明的塑料材料或透明的玻璃材料制作。

作为一个优选方案，所述冷冻保存载体至少一端边缘设置凸起的夹持端。

作为一个优选方案，所述冷冻保存载体呈长方形，大小为长0.3—1.5cm，宽0.2—1.0cm。

作为一个优选方案，所述冷冻保存载体呈圆形，大小为直径0.2—1.0cm。

为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种微量精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，包括如下步骤：

( l ) 微量精子的冷冻：在上述冷冻保存载体上准备1-3个冷冻液微滴，并将冷冻保存载体插入覆盖有矿物油的精子培养皿中，用显微注射针将活动精子挑选出来置入冷冻液微滴中，将冷冻保存载体取出，并用无菌吸水纸吸干矿物油，置于0.5-2.0mL的冷冻管内，快速冷冻，长期保存；

( 2) 微量精子的解冻：女方取卵日，自液氮罐中取出冷冻管，用小镊子将冷冻保存载体从冷冻管内取出，并迅速插入含37℃矿物油的ICSI皿中，倒置显微镜下在冷冻液微滴内寻找精子，并用显微注射针转入mHTF 微滴中，用于ICSI。

作为一个优选方案，微量精子的冷冻中，所述快速冷冻按4℃ 20分钟→-20℃ 20分钟→液氮面上方5cm高度的液氮蒸汽5分钟→投入液氮的顺序进行。

作为一个优选方案，所述冷冻液微滴大小为0.1-10.0μL。

本发明的优点在于：（1）冷冻液与常规的精子冷冻液相同，无特别要求，可方便获得，如市售含甘油的精子冷冻液。（2）将冷冻保存载体插入盖油的精子培养皿内抓精子冷冻，无需特殊的保湿装置，不用担心冷冻液微滴蒸发，这样有足够的时间和耐心抓取尽量多的精子进行冷冻。穿刺获得的精子或严重少精子症患者的活动精子非常稀少，需要花费较多时间才能抓取足够多的活动精子进行冷冻保存。（3）将冷冻保存载体插入盖油的ICSI皿内解冻，无需离心洗涤，可直接用于卵子显微授精，精子不会丢失，精子回收率可达100%。（4）冷冻前，可将冷冻保存载体上的矿物油用吸水纸尽量吸干，这样保证了精子的复苏率不受矿物油的负面影响，复苏后精子的存活率可达60%以上。（5）整个冷冻解冻操作非常简单，只要可以开展显微授精就可以用该方法冷冻单个精子，便于在辅助生殖临床上广泛推广。( 6 ）本发明很好地解决了目前单精子冻存技术中复杂、繁琐、效率低下的难题，极大的提高了无精子症患者和严重少精子症患者接受辅助生育治疗的灵活性和可靠性。

附图说明

图1为长方形冷冻保存载体示意图。

图2为冷冻时冷冻保存载体位置示意图，在皿上半部分准备几个10%SSS- mHTF的长液滴，覆盖矿物油，将准备冷冻的穿刺精子加入该长液滴，冷冻保存载体放在长液滴下方，即皿下半部分，用显微操作注射针将精子抓取置入冷冻保存载体上的冷冻液微滴内。

图3为解冻时冷冻保存载体在ICSI皿内的位置示意图，九宫格中心的液滴是10%PVP，制动精子用，其他8个液滴是10%SSS-mHTF，待ICSI的卵子置入其中，右边小的液滴也是10%SSS-mHTF，用来润洗从冷冻保存载体上找到的精子，精子在该小液滴内润洗后，转移入中心的10%PVP滴制动用于ICSI。

图1中的标号为：

1——冷冻保存载体；11——夹持端。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1. 微量精子冷冻保存载体

请参见图1，图1为本发明的一个优选实施例，冷冻保存载体（亦称冷冻片）呈长方形，大小为可以承载1-3个0.1-10.0uL的冷冻液微滴，以透明的塑料材料（如聚苯乙烯或聚丙烯）或透明的玻璃材料制作，一端边缘设置凸起的夹持端。

作为一个优选方案，所述冷冻保存载体呈长方形，大小为长0.3—1.5cm，宽0.2—1.0cm。

冷冻保存载体的形状可为长方形、方形或圆形的水平状或凹槽状，只要方便于长期保存在液氮罐， 冷冻保存载体可存储在任意形状的容器内或支撑材料上进行后续的冷冻过程，如将冷冻保存载体置入0.5-2.0mL 的冷冻管或将冷冻保存载体连接在杆状材料上。大小只要可以承载1-3个0.1-10.0uL的冷冻液微滴，冷冻保存载体的尺寸可变，以冷冻保存载体存储在0.5-2.0mL的冷冻管内为例，其大小可为能方便的放入0.5-2.0mL的冷冻管（Vial）内的任意尺寸。

为了方便对冷冻保存载体进行操作，如放入/取出精子培养皿、ICSI皿和冷冻保存载体的存储容器（如0.5-2.0mL冷冻管）等，冷冻保存载体上设计有与冷冻保存载体片状部分呈L形的小齿或类似把持物的凸起，可供小镊子夹住。

实施例2. 微量精子的冷冻和解冻方法

冷冻时，先准备精子培养皿，即用10%SSS- mHTF制作长液滴并覆盖矿物油。将活检取出的曲细精管置入少量10%SSS- mHTF中，曲细精管经弯头镊子碾碎，直接加入精子培养皿内的长10%SSS- mHTF液滴。在冷冻保存载体上准备1个5微升的冷冻液微滴，将冷冻保存载体插入盖油的精子培养皿内，用显微注射针（ICSI Injection Pipette）抓取一定数量（5-10条精子/片）的活动精子置入冷冻保存载体上的冷冻液微滴，用小镊子取出冷冻保存载体，并用吸水纸尽量吸干冷冻保存载体上的矿物油后放入1.8mL的冷冻管（Vial），按4℃ 20分钟→-20℃ 20分钟→液氮面上方5cm高度的液氮蒸汽5分钟→投入液氮的顺序进行快速冷冻，长期保存。

复苏时，在女方取卵日，即ICSI当日，自液氮罐中取出冷冻管（Vial），用小镊子将冷冻保存载体从冷冻管内取出，并迅速插入ICSI皿中（含37℃矿物油），倒置显微镜下（100-200倍放大倍数）在冷冻液微滴内仔细寻找精子，并用显微注射针转入mHTF 微滴中，用于后续精子制动和成熟卵子ICSI。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，比如对冷冻片的形状、尺寸作适当美化和调整，或对夹持端进行适当修改，或对快速冷冻程序和时间（如4摄氏度和零下20度内的时间，液氮面上方的高度）作细微调整等应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种微量精子冷冻保存载体，其特征在于，所述冷冻保存载体呈长方形、方形或圆形的水平状或凹槽状，大小为可以承载1-3个0.1-10.0uL的冷冻液微滴，以透明的塑料材料或透明的玻璃材料制作。

2.根据权利要求1所述的一种微量精子冷冻保存载体，其特征在于，所述冷冻保存载体至少一端边缘设置凸起的夹持端。

3.根据权利要求1或2所述的一种微量精子冷冻保存载体，其特征在于，所述冷冻保存载体呈长方形，大小为长0.3—1.5cm，宽0.2—1.0cm。

4.根据权利要求1或2所述的一种微量精子冷冻保存载体，其特征在于，所述冷冻保存载体呈圆形，大小为直径0.2—1.0cm。

5.一种微量精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，包括如下步骤：

( l ) 微量精子的冷冻：在权利要求1所述冷冻保存载体上准备1-3个冷冻液微滴，并将冷冻保存载体插入覆盖有矿物油的精子培养皿中，用显微注射针将活动精子挑选出来置入冷冻液微滴中，将冷冻保存载体取出，并用无菌吸水纸吸干矿物油，置于0.5-2.0mL的冷冻管内，快速冷冻，长期保存；

( 2) 微量精子的解冻：女方取卵日，自液氮罐中取出冷冻管，用小镊子将冷冻保存载体从冷冻管内取出，并迅速插入含37℃矿物油的ICSI皿中，倒置显微镜下在冷冻液微滴内寻找精子，并用显微注射针转入mHTF 微滴中，用于ICSI。

6. 根据权利要求5所述的微量精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，微量精子的冷冻中，所述快速冷冻按4℃ 20分钟→-20℃ 20分钟→液氮面上方5cm高度的液氮蒸汽5分钟→投入液氮的顺序进行。

7.根据权利要求5所述的微量精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述冷冻液微滴大小为0.1-10.0μL。