CN104822843B - 使用人干细胞样细胞和代谢组学比率预测药物的人发育毒性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供针对化合物的发育毒性测试的快速的、可再现的、基于生物标记物的筛选方法。这些方法被设计为以预测发育毒性的方式鉴定如下暴露水平，在此暴露水平下一种测试化合物扰乱代谢。具体而言，测量了两种代谢物即鸟氨酸和胱氨酸的扰动，其中鸟氨酸的倍数改变与胱氨酸的倍数改变少于或等于约0.88的比率指示了一种测试化合物的致畸性。

Description

使用人干细胞样细胞和代谢组学比率预测药物的人发育毒性
继续申请数据
本申请要求2012年11月2日提交的美国临时申请序列号 61/721,746和2013年5月24日提交的序列号61/827,407的权益，每 份申请通过引用结合在此。
政府资助
本发明是由美国国家科学基金会(National Science Foundation) 资助的在批准号IIP-1058355下由政府支持进行的。政府在本发明中 享有某些权利。
背景
出生缺陷在所有人类出生的大约3％中有报导，并且是美国婴儿 死亡率的最大起因(霍耶特(Hoyert)等人，2006，小儿科(Pediatrics)； 117:168-183)。暴露于有毒化学品和物理药剂被认为对所有出生缺陷 的大约3％负责(国家研究委员会(National ResearchCouncil)，2000， “发育毒理学和风险评估科学前沿(Scientific frontiers indevelopmental toxicology and risk assessment)”，华盛顿，DC：美国学术出版社(TheNational Academies Press))。
理解的是，发育毒性可引起出生缺陷，并且可产生胚胎致死现象、 子宫内的生长限制(IUGR)、形态发育异常(例如骨骼畸形)和功能 性毒性，这可导致认知障碍例如孤独症。化学品暴露在这些障碍的发 作中可发挥的作用受到越来越多关注。确实，估计所有出生缺陷的5％ 至10％是由在子宫中暴露于诱导胎儿发育异常的已知致畸剂引起(贝 克曼(Beckman)和布伦特(Brent)，1984，药理学年度评论(Annu Rev Pharmacol)；24:483-500)。对化学品暴露可在产生出生缺陷中发挥 的显著和可预防的作用存在关注(克劳迪奥(Claudio)等人，2001， 环境卫生展望(Environm Health Perspect)；109:A254-A261)。
然而，这个关注难以评价，归因于缺少用于测试市场上超过 80,000种化学品加上每年引进的新的2,000种化合物的发育毒性的稳 健和高效的模型(总审计局(GeneralAccounting Office)(GAO)， 1994，有毒物质控制法案：对使TSCA更有效的立法变化的初步观察 (Toxic Substances Control Act:Preliminary Observations on LegislativeChanges to Make TSCA More Effective)，证言，1994年7月13日， GAO/T-RCED-94-263)。已经对这些化合物中少于5％进行了生殖结 局的测试，并且对甚至更少的进行了发育毒性测试(环境保护办事处 (Environmental Protective Agency)(EPA)，1998，化学危害性数据可用性研究(Chemical Hazard Data Availability Study)，污染预防 和毒素办公室(Office of Pollution Prevention and Toxins))。尽管已 经在使用动物模型系统以评估毒性上进行了一些尝试(皮尔斯玛 (Piersma)，2004，毒物学通讯(ToxicologyLetters)；149:147-53)， 在子宫中人的敏感度的内在差异已限制了此种模型的预测有用性。
毒性，具体地发育毒性，通过药物发育过程在化合物演进中也是 一个主要障碍。当前，毒性测试是在动物模型上进行的，作为预测化 合物暴露的不利影响，具体地对人胚胎和胎儿中的发育和器官发生的 不利影响的一个手段。有助于FDA批准调查中的新的药物的大部分 流行模型是在兔和大鼠上的整体动物研究(皮尔斯玛(Piersma)，2004， 毒物学通讯(Toxicology Letters)；149:147-53)。体内研究依赖于在 孕期和胚胎/胎儿发育的不同阶段(妊娠的第一周、器官发生阶段和整 个妊娠期)将化合物给予至怀孕的动物。然而，归因于生化途径上的 不同，这些体内动物模型受在发育过程中对化学品化合物的响应上缺 少动物和人之间生物相关性的限制。在趋势例如剂量敏感性和化合物 的药代动力学加工上常显现物种不同。根据报导的文献，动物模型在 预测人对化合物的发育响应上大约60％是生效的(格里夫斯(Greaves) 等人，2004，自然评论：药物发现(Nat Rev DrugDiscov)；3:226-36)。 因此，存在对人的直接预测体外模型的需要。
在1960年代的萨力多胺(thalidomide)悲剧强调了临床前发育毒 性测试的重要性、物种间在对可能致畸化合物的响应上的显著不同、 以及此类化合物可如何影响发育中的胎儿。萨力多胺在啮齿动物模型 上的发育毒性测试未指示该化合物在人类中的致畸可能性。超过 10,000个在子宫暴露后出生的儿童具有严重的出生缺陷。当前用于检 测发育毒性的临床前模型在人、大鼠和兔(针对发育毒性测试的最常 用物种)上具有不同的观察到的发育毒性一致性程度，对已知人致畸 剂具有大约70％-80％一致性(达斯顿(Daston)GP和努森(Knudsen) TB，2010，“基本概念、当前调控设计和解释(Fundamental concepts，current regulatory design and interpretation)”，于：努森(Knudsen) TB，达斯顿(Daston)GP，编辑，综合毒物学(Comprehensive Toxicology)，第12卷，第2版，纽约：爱思唯尔(Elsevier)，第 3-9页)。数十年来这些体内动物模型需要大数目的动物、公斤数量 的测试化合物，并且既耗时又花钱。归因于这些模型的成本和复杂性， 对于开发者来说在该化合物的生活周期中对一个阳性发育毒性信号 产生反应的安全性评估常发生太晚，并且可导致该化合物或化合物系 列的研发终止。尽管这些动物模型是并且长久以来被认为是调控黄金 标准，多个物种对一种化合物的响应的不同可导致漏失发育毒性的信 号和生物误解。同样地，需要开发新一代工具，使用人细胞用于评估 与化学品暴露相关的可能的发育毒性风险。适当的测试也将减少产物 发育时间，控制成本，并且积极地响应降低动物使用的要求。
因此，需要相关的、预测的、准确的低成本以及快速的人体外测 试，用于可靠地测定药剂和其他化学品化合物的发育毒性。
发明概述
本发明包括一种将测试化合物分类为致畸剂或非致畸剂的方法， 该方法包括：在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物 的情况下培养未分化的人干细胞样细胞(hSLC)；测定在存在该测试 化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片段、 加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情 况下培养的hSLC中的情况进行比较；测定胱氨酸或其片段、加合物、 减去物或损失物的倍数改变，在未分化的hSLC的培养基中在存在该 测试化合物的情况下培养，与在hSLC中在不存在该测试化合物的情 况下培养进行比较；并且测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损 失物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数 改变的比率，其中少于或等于约0.88的比率指示了该测试化合物的致 畸性并且大于约0.88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
本发明包括预测一种测试化合物的致畸性的方法，该方法包括： 在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培 养未分化的人干细胞样细胞(hSLC)；测定在存在该测试化合物的情 况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片段、加合物、减 去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的 hSLC中的情况进行比较；测定胱氨酸或其片段、加合物、减去物或 损失物的倍数改变，在未分化的hSLC的培养基中在存在该测试化合 物的情况下培养，与在hSLC中在不存在该测试化合物的情况下培养 进行比较；并且测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍 数改变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的比 率，其中少于或等于约0.88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并 且大于约0.88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
本发明包括用于将一种测试化合物确认为一种致畸剂的方法，该 方法包括：在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的 情况下培养未分化的人干细胞样细胞(hSLC)；测定在存在该测试化 合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片段、加 合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况 下培养的hSLC中的情况进行比较；测定胱氨酸或其片段、加合物、 减去物或损失物的倍数改变，在未分化的hSLC的培养基中在存在该 测试化合物的情况下培养，与在hSLC中在不存在该测试化合物的情 况下培养进行比较；并且测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损 失物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数 改变的比率，其中少于或等于约0.88的比率指示了该测试化合物的致 畸性；并且大于约0.88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
本发明包括用于测定以下暴露浓度的方法，在该暴露浓度下一种 测试化合物是致畸的，该方法包括在一系列浓度的该测试化合物中和 在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细胞 (hSLC)；测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的hSLC 的培养基中鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变， 与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC中的情况进行比较； 测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的hSLC的培养基中 胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在 该测试化合物的情况下培养的hSLC中的情况进行比较；并且针对每 个浓度的测试化合物，测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失 物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改 变的比率，其中在一个给定浓度的该测试化合物情况下少于或等于约 0.88的比率指示了该测试化合物在该给定浓度下的致畸性；并且在一个给定浓度的该测试化合物情况下大于约0.88的比率指示了该测试 化合物在该给定浓度下的非致畸性。
在本发明的方法的一些方面，使用一种物理分离方法鉴定该胱氨 酸或其片段、加合物、减去物或损失物，和/或鸟氨酸或其片段、加合 物、减去物或损失物。在一些方面，一种物理分离方法包括质谱法。 在一些方面，质谱法包括液相色谱法/电喷射离子化质谱法。
在本发明的方法的一些方面，使用一种比色或免疫学测定测量该 胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物，和/或鸟氨酸或其片段、 加合物、减去物或损失物。
在本发明的方法的一些方面，hSLC包括人诱导多能性（iPS）细胞。
在本发明的方法的一些方面，在一个浓度的如下测试化合物中培 养该hSLC，所述测试化合物包括测试化合物的人治疗Cmax。
在本发明的方法的一些方面，在一系列浓度的该测试化合物中培 养该hSLC。在一些方面，该系列浓度包括连续稀释。在一些方面， 该系列浓度包括九个三倍稀释。在一些方面，该系列浓度包括从约0.04 μM至约300μM、约4μM至约30,000μM、和约0.0001μM至约10μM。在一些方面，该系列浓度的该测试化合物包括测试化合物的人治疗 Cmax。
在本发明的方法的一些方面，该方法进一步包括检测一种或多种 与在存在该测试化合物的情况下培养的hSLC相关的额外的代谢物， 与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC的情况进行比较。在 一些方面，一种或多种额外的代谢物包括精氨酸、ADMA、胱硫醚， 和/或其一个片段、加合物、减去物或损失物。在一些方面，使用一种 物理分离方法鉴定一种或多种额外的代谢物。在一些方面，一种物理 分离方法包括质谱法。在一些方面，质谱法包括液相色谱法/电喷射离 子化质谱法。在一些方面，使用一种比色或免疫学测定测量一种或多 种额外的代谢物。
在本发明的方法的一些方面，该方法进一步包括测定精氨酸或其 片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变与ADMA或其片段、加 合物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中少于至少约0.9或大 于至少约1.1的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且大于至少约 0.9和少于至少约1.1的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的 任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指本发明的在某些情况下可以提供某 些益处的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是 优选的。此外，一个或多个优选实施例的叙述不意味着其他实施例是 无用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。所述的 一个或多个实施例和说明书中对“一个实施例(one embodiment)”、“本 发明的一个实施例”、“一个实施例(an embodiment)”、“一个实例实 施例”等的提及意指所述的一个或多个实施例可包括一个具体的特点、 结构或特征，但每个实施例可以不必须包括该具体的特点、结构或特 征。此外，此类短语不必须参考相同的实施例。进一步，当一个具体的特点、结构或特征是与一个实施例相关地描述的，应理解它在本领 域的普通技术人员的知识范围内影响与其他实施例相关的此类特点、 结构或特征，无论是否明确描述。
术语“包含”及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求中出现 的情况下，不具有限制性含义。应当理解，当用语言“包含”来说明实 施例时，还提供了就“由……组成”和/或“主要由……组成”而言所说明 的其他类似实施例。
除非另外说明，“一个(或一种)”、“该(the)”、和“至少一个 (或一种)”可互换地使用并且意指一个(或一种)或多于一个(或一 种)。
在以下说明中，为了解释的目的，列出特定数目、参数和试剂是 为了提供对本发明的深入了解。然而，应理解，可以在没有这些具体 细节的情况下实践本发明。在一些情况下，可省略或简化众所周知的 特点以使本发明明显。
而且在此，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包括的所有 数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表达组分的量、 分子量等等的所有数值应被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。因 此，除非另外相反地指明，在本说明书和权利要求书中列出的数值参 数是近似值，这些近似值可以取决于本发明所寻求获得的所希望的特 性而不同。
对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任 何可行的顺序来进行这些步骤。并且，在适当时，可以同时进行两个 或更多个步骤的任何组合。
本发明的以上概述不旨在说明本发明的每个披露的实施例或每 个实现方式。下面的说明更具体地举例说明示意性实施例。在本申请 全文的几处，通过实例的列举提供了指导，这些实例能以不同组合使 用。在每个例子中，所叙述的列表仅作为代表性组并且不应被解释为 排他性列表。
附图简要说明
图1A和1B.针对以下项的板设计：在1期实验使用的单个暴露 水平处理的非靶向的代谢组学(图1A)和在2期实验使用的多个暴 露水平处理的靶向生物标记物实验(图1B)。两个板都合并有一种参 照设计，其中实验对照或参照处理(0.1％DMSO)存在于每个板上。使用仅有培养基(缺少细胞)的对照以评估该测试化合物对样本基质 的影响。将每个孔作为一个个体样本进行分析。实心圆表示细胞样本， 并且实心正方形描述了培养基对照样本。
图2.靶向生物标记物测定的图形表示。将人胚胎干(hES)细胞 暴露于跨距四个对数单位的九个浓度的一种测试化合物。鸟氨酸/胱氨 酸比率(o/c比率；灰色曲线)和细胞活力(黑色曲线)的剂量响应 曲线是使用一种四参数对数逻辑模型拟合的。通过其中o/c比率的剂 量响应曲线与致畸阈值(0.88；灰色线)相交的内插点预测的浓度表 示如下的暴露水平，在该暴露水平处一种代谢扰动具有致畸可能性 (即，致畸性可能性：o/c比率，空心圆)。来自细胞活力(实心圆) 的致畸性可能浓度是如下内插点，在该内插点处该细胞活力剂量响应 曲线超过该致畸性阈值。该致畸性可能性创建了一个基于暴露的双面 毒性模型：一个中暴露未以与致畸性相关方式扰乱代谢(浅阴影框)， 并且另一个中暴露可在代谢中引起一个可能地致畸转变(深阴影框)。 x轴是该化合物的浓度(μM)。细胞活力测量和o/c比率测量两者都 以由y轴上的Δ表示的相同比例存在。o/c比率的y轴值是参照处理 标准化(倍数改变)值的比率(鸟氨酸/胱氨酸)。活力测量的y轴值 是标准化为参照处理细胞活力RFU的处理细胞活力RFU。
图3A和3B.针对已知的人致畸剂和非致畸剂的分类方案的图形 表示，利用治疗Cmax浓度来设置该分类窗。针对o/c比率(灰色曲线) 的剂量响应曲线是使用一种四参数对数逻辑模型拟合的，并且被用以 插入如下浓度，在此浓度处o/c比率与该致畸性阈值(致畸性可能性， 空心圆)相交。当该致畸性可能浓度高于该人治疗Cmax时，一种测试 化合物被预测为一种非致畸剂(图3A)。当该致畸性可能浓度低于 该人治疗Cmax时，一种测试化合物被预测为一种致畸剂(图3B)。 此处概述的相同逻辑也适用于活力测量。x轴是该化合物的浓度 (μM)。o/c比率的y轴值是参照处理标准化(倍数改变)值的比率 (鸟氨酸/胱氨酸)。
图4A、4B、和4C.在实验1期时测量的鸟氨酸(图4A)、胱氨 酸(图4B)的代谢扰动和o/c比率(图4C)。每个点表示这9个独 立实验区组的平均值。实心点指示致畸剂，并且空心点指示非致畸剂。 误差条是平均值的标准差。垂直灰色线表示该致畸性阈值。x轴是每 个代谢物(图A和4B)的参照标准化倍数改变或鸟氨酸/胱氨酸参照 标准化值(图4C)的比率。y轴是按非致畸剂和致畸剂排序的处理。 空心箭头指示如下的范围，在此范围处一种化合物将被分类为一种非 致畸剂。实心箭头指示如下的范围，在此范围处一种化合物将被分类为一种致畸剂。
图5A和5B.化合物针对在2期中测定的o/c比率(TP)的致畸性 可能浓度和来自靶向生物标记物测定的针对训练集(training set，图 5A)和测试集(test set，图5B)的Cmax值之间的差异的可视化。实 心点对应于致畸剂，并且空心点对应于非致畸剂。TP和Cmax之间的 差异少于0的处理被分类为致畸剂，并且TP和Cmax之间的差异大于 0的处理被分类为非致畸剂。x轴是对数底10转化的致畸剂可能性浓 度值减去对数底10转化的Cmax浓度值(参见表6和7)。y轴是按非 致畸剂和致畸剂排序的处理。空心箭头指示如下的范围，在此范围处一种化合物将被分类为一种非致畸剂。实心箭头指示如下的范围，在 此范围处一种化合物将被分类为一种致畸剂。1依维莫司(everolimus) 的Cmax低于该测定中使用的最低暴露水平，这种化合物的o/c比率以 低于该致畸性阈值起始，所以它被分类为一种致畸剂。
图6A至6F.训练集化合物的代表性子集的靶向生物标记物测定 结果(表6)。显示了针对4种已知的人致畸剂：萨力多胺(图6A)、 全反式视黄酸(图6B)、丙戊酸(图6C)、5-氟尿嘧啶(图6D)以 及2种非致畸剂：视黄醇(图6E)和糖精(图6F)的活力分析(黑 色曲线)和o/c比率(灰色曲线)的剂量响应曲线。x轴是该化合物 的浓度(μM)。细胞活力测量和o/c比率测量两者都以由y轴上的Δ 表示的相同比例存在。o/c比率的y轴值是参照处理标准化(倍数改 变)值的比率(鸟氨酸/胱氨酸)。针对活力测量的y轴值是标准化为 参照处理细胞活力RFU的处理细胞活力RFU。垂直黑色虚线指示化 合物特异性Cmax，并且水平灰色线指示致畸性阈值(0.88)。空心圆 表示针对o/c比率的致畸剂可能性浓度(TP)。浅色和深色阴影区表 示如下浓度，在此浓度处该化合物分别被预测为非致畸或致畸。这些 点是平均值，并且误差条是平均值的标准差。这些图的解释概述在图 2和3中。
图7A和7B.针对两种测试集化合物(表7)：洛伐他汀(图7A) 和拉帕替尼(图7B)，靶向生物标记物测定结果与大鼠体内发育毒性 结果的比较。显示了靶向生物标记物测定针对活力分析(黑色线)和 o/c比率(灰色线)的剂量响应曲线。x轴是该化合物的浓度(μM)。细胞活力测量和o/c比率测量两者都以由y轴上的Δ表示的相同比例 存在。o/c比率的y轴值是参照处理标准化(倍数改变)值的比率(鸟 氨酸/胱氨酸)。针对活力测量的y轴值是标准化为参照处理细胞活力 RFU的处理细胞活力RFU。垂直黑色虚线指示化合物特异性Cmax，并 且水平灰色线指示致畸性阈值(0.88)。空心圆表示针对o/c比率的 致畸剂可能性浓度(TP)。浅色和深色阴影区表示如下浓度，在此浓 度处该化合物分别被预测为非致畸或致畸。灰色虚线表示如下浓度， 在此浓度处在该大鼠体内发育毒性测试中观察到一个阳性结果。这些 点是平均值，并且误差条是平均值的标准差。这些图的解释概述在图 2和3中。
图8.概述了该靶向生物标记物测定的发育的图形，与使用未知化 合物时相比较。
图9显示针对每种训练集药剂，ADMA和胱氨酸的参照处理标准 化比率的比率。
图10显示针对每种训练集药剂，胱硫醚和胱氨酸的参照处理标 准化比率的比率。
示意性实施方式的详细说明
本发明提供人-特异性体外测定毒性的方法，特别是使用人干细 胞样细胞(hSLC)测定发育毒性以及药物和其他非-药物化合物致畸 性的方法。本发明利用hSLC和代谢组学以提供一种预测的、定量的、 所有-人的体外筛选以预测化合物的人发育毒性的方法。本方法克服了 与种间动物模型相关的限制，并提供了创新和稳健的替代体外模型系 统以预测化学品的发育毒性。更多预测性发育毒性筛选的应用会减少 出生缺陷的流行并增加药物和化学品安全性。
通过在培养基中测量代谢扰动，本发明提供了基于暴露的体外测 定，该代谢扰动可被用作针对发育毒性的可能性的早期信号。
在本发明的这些方法的情况下，可以使用多种人干细胞样细胞（hSLC）中的任何一种，以预测化学品实体的发育毒性。人干细胞样细胞包括但不限制于多能性人诱导多能性（iPS）细胞和hSLC衍生的谱系特异性细胞。
谱系特异性前体细胞衍生自hESC，并已进入一个特定的细胞谱系，但相对于该特异性谱系内的细胞类型仍保留了多能性。例如，神经前体细胞已定向神经分化，但就其神经细胞类型而言仍保留不受限性。如此处使用的，术语“人胚胎干细胞（hESC）”指多能性未分化的人干细胞及其部分分化的细胞类型（例如，正分化的hESC的下游祖细胞）。如此处提供的，hESC的体外培养是多能性的并且未被永生化，并且使用本领域中良好建立的方法可被诱导以产生谱系特异性细胞和分化的细胞类型。当前在US和UK干细胞库中可获得多个hESC系。使用的hESC可包括三个hES细胞系，即WA01、WA07、和WA09中任一个。先前的工作已经建立以下，对暴露于具有已知人致畸性结果的化合物之后hES细胞消耗的培养基的非靶向的基于代谢组学的评价产生了如下预测性特征，这些特征可被用作发育毒性筛选（克莱因斯特瑞乌尔（Kleinstreuer）等人，2011，毒理学与应用药理学（Toxicol Appl Pharmacol）；257:111-121；和韦斯特（West）等人，2010，毒理学与应用药理学（Toxicol Appl Pharmacol）；247:18-27，将其每个以其全部内容结合在此）。
人诱导多能性干细胞(iPS)细胞是通过诱导某些基因的强制表 达而人工地衍生自一种非多能性细胞(典型地一种成年体细胞)的多 能性干细胞的一个类型。在许多方面例如某些干细胞基因和蛋白的表 达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、有生 活力的嵌合体的形成、以及效能和可分化性，iPS细胞被认为与天然 多能性干细胞(例如胚胎干细胞)是一致的。iPS细胞可获得自例如 成年组织(例如，如获得自骨髓的细胞)和通过孤雌生殖获得(参见， 例如，弗罗纳(Vrana)等人，2003，讨论会(Colloquium)；100， 增刊1:11911-11916)。
细胞聚集是通过悬滴、非组织培养处理板或转瓶上的铺板强加的；任一方法都防止细胞免于附着至一个表面以形成典型的菌落生长。在聚集时，分化起始，并且该细胞开始（至一个受限的程度）重演胚胎发育。
本发明的这些细胞可包括hSLC衍生的谱系特异性细胞。如此处 使用的术语“hSLC衍生的谱系特异性细胞”、“干细胞祖先”、“谱系特 异性细胞”、“hSLC衍生的细胞”和“分化的细胞”意在囊括从hSLC分 化的谱系特异性细胞，以使得该细胞定向分化为一个具有减弱的多能 性的特异性谱系。例如，hSLC衍生的谱系特异性细胞衍生自hSLC， 并已进入一个特异性的细胞谱系，但相对于该特异性谱系内的细胞类 型仍保留了多能性。该hSLC衍生的谱系特异性细胞可包括例如，神 经干细胞、神经前体细胞、神经细胞、心脏干细胞、心脏前体细胞、 心肌细胞等。在一些实施例中，这些hSLC衍生的谱系特异性细胞相 对于最终细胞类型保留未分化。例如，神经元干细胞衍生自hSLC， 并且已分化足以定向为神经元谱系。然而，该神经元前体保留“干性”， 其中它保留了发育至任何类型的神经元细胞的可能性。额外的细胞类 型包括末端分化的细胞，这些末端分化的细胞衍生自hESC或谱系特 异性前体细胞，例如神经细胞。
在本发明的这些方法的情况下，可以使用本领域中众所周知的细 胞培养方法培养hSLC，这些方法包括例如在以下各项中披露的方法： 路德维格(Ludwig)等人(2006，自然方法(NatMethods)；3:637-46)、 美国专利申请序列号11/733,677(“用于使用人胚胎干细胞对药物化合 物和其他化合物的毒性进行评估的试剂和方法(Reagents and Methodsfor Using Human Embryonic Stem Cells to Evaluate Toxicity of PharmaceuticalCompounds and other Compounds)”)、PCT/US 2011/029471和美国专利申请序列号13/069,326(“使用人干细胞样细 胞和代谢组学预测药品的人发育毒性(Predicting HumanDevelopmental Toxicity of Pharmaceuticals Using Human Stem-Like Cells andMetabolomics)”)以及此处所述的那些中的任一个。
在本发明的一些方面，在暴露于一种测试化合物之前和/或在过程 中，hSLC维持在未分化的状态。在本发明的一些方面，可在不存在 一种饲养细胞层的情况下在暴露于一种测试化合物过程中培养hSLC 和/或在此类暴露之前将其培养于饲养细胞层上。
本发明的方法描述了在细胞代谢上的改变，这是在化合物暴露之 后在来自hSLC的消耗的细胞培养基中测量的。该培养基的代谢足迹 是对细胞代谢(被称为“分泌蛋白质组”)的功能性测量。该分泌蛋白 质组是指在细胞培养之后存在于该消耗的培养基(此处其也可被称作 “细胞培养上清”、“培养上清”、“上清”、“细胞上清”、“细胞培养基”、 “培养基(culture media)”、“细胞培养基”、“培养基(media)”、或“培 养基(medium)”)上的代谢物。该分泌蛋白质组包括培养基组分、 代谢物跨质膜被动和主动运输、溶胞时细胞内代谢产物释放、以及通 过酶的细胞外代谢产生的那些。相对于未处理的培养物，通过测试化 合物暴露引出的该分泌蛋白质组的改变产生毒性的一个代谢特征。由 于如下用于描述细胞培养基的若干独特的品质，测量该分泌蛋白质 组：非常容易可再现性地采样，需要最小的处理以平息代谢，该处理 未毁坏细胞，这些细胞可以然后被用于其他测定，它能经得起高-通量评价，以及归因于代谢物随着时间的推移而积累可测量强信号。在化 合物暴露之后测量代谢改变的能力已鉴定与人发育的破坏相关的新 生物标记物，并且提供机会以开发基于这些改变的发育毒性的高预测 性模型。
代谢物包括但不限于糖、有机酸、氨基酸、脂肪酸、激素、维生 素、寡肽(少于约100个氨基酸的长度)、及其离子片段。在一些方 面，代谢物在分子量上少于约3000道尔顿，并且具体地从约50至约 3000道尔顿。
在本发明的情况下，可测定在存在一种测试化合物的情况下培养 的hSLC中代谢物的倍数改变，与在不存在该致畸化合物的情况下培 养的hSLC的情况进行比较。一种致畸化合物的代谢影响是指在存在 该致畸化合物的情况下培养的hSLC中一种或多种代谢物与在不存在 该致畸化合物的情况下培养的hSLC的情况(或在一些方面，在存在 一种已知非致畸化合物的情况下培养的hSLC)进行比较的差异。一 种代谢物可被有差异地表达，例如，当暴露于一种致畸化合物时一种 代谢物的表达可被增加或降低。
在一些方面，可测定在存在一种测试化合物的情况下培养的 hSLC中两种代谢物的倍数改变的比率，与在不存在该致畸化合物的 情况下培养的hSLC的情况进行比较。例如，在本发明的情况下，已 确定，鸟氨酸与胱氨酸、不对称二甲基精氨酸(ADMA)与胱氨酸、和/或胱硫醚与胱氨酸的倍数改变的变化比率可预测一种测试化合物 的发育毒性/致畸性。在确定一种化合物的发育毒性时可利用这些比率 中的任一个、两个或所有三个。
在本发明的情况下，相对于未处理的培养，通过测试化合物暴露 引出的该分泌蛋白质组的改变产生一个代谢特征，可使用该代谢特征 用于测量细胞活力。如在细胞培养之后在消耗的培养基中测量的细胞 代谢的改变是细胞健康的一个功能性测量。相对于未处理的培养物， 通过暴露于一种测试药剂引出的该分泌蛋白质组的改变产生一个代 谢特征，可使用该代谢特征来推断一种细胞培养物内存在的代谢上有 生活力细胞的数目。此处所述的分泌代谢物中的一种或多种可被用于 推断有生活力细胞的数目，相对于在一种参照培养物“对照组”中的细 胞数目。这些代谢物可被用于确定一种细胞培养物内有生活力的细胞 的数目而不需要毁坏或影响该细胞。这些代谢物可被用作对活力的新 的测量，该测量不需要破坏生长中的细胞。
在本发明的情况下，相对于未处理的培养物，通过暴露于一系列 浓度的一种测试化合物引出的分泌蛋白质组的改变可被用于确定一 种测试化合物为致畸性时所处的浓度。一种化合物的致畸可能性与暴 露于该胎儿的水平相关。因此，取决于该暴露水平，一种化合物可被 认为是致畸和非致畸性的。例如，以美国食品和药物管理局(FDA) 最大推荐每日限额(RDA；8,000IU)或更低摄取视黄醇(维生素A) 对发育中的胎儿不具有不利影响。然而，高剂量的视黄醇(>25,000 IU/day)已显示引起畸形，这与在实验动物和人两者中13-顺视黄酸暴 露之后看到的那些相似(畸形学学会(Teratology Society)，1987，“畸 形学学会意见书：对孕期维生素A使用的建议(Teratology Society position paper:recommendations for vitamin A use during pregnancy)”， 畸形学(Teratology)；35:269-275)。
在一些方面，可在对应于其IC50或EC50剂量水平的浓度、在对 应于其循环剂量的浓度、在对应于母体循环中情况的浓度和/或在对应 于该测试化合物的人治疗Cmax的浓度测试一种化合物的致畸性。此种 给药概括了对体内发育中的人胚胎的暴露水平和给予化合物对人发 育的有毒或致畸影响。
在一些方面，一种化合物的致畸性可经一系列浓度的该测试化合 物进行测试。这样一个范围可包括，例如，约0.04μM至约300μM、 约4μM至约30,000μM、和约0.0001μM至约10μM。这样一个范围 可包括例如，一个连续稀释，例如，五、六、七、八、九、十、或更 多次稀释。此类稀释可以是，例如，二倍、三倍、四倍、五倍、十倍、 或更多。
在本发明的情况下，可依照细胞活力数据，利用个体代谢物和/ 或倍数改变的比率用于预测发育毒性。此处所述的快速预测 (quickPredict)方法将九点剂量曲线的基于细胞培养的评价与一个代 谢指数组合，以预测一种测试药剂可在七天时间框架内展现发育毒性 和细胞毒性的剂量。这个测定工作流表示通量超过传统的基于‘组学’ 计算途径的显著五倍增加。在之前所述的devTox测定(参见，例如， PCT/US 2011/029471和美国专利申请序列号13/069,326(“使用人干细 胞样细胞和代谢组学预测药物的人发育毒性(Predicting Human Developmental Toxicity of Pharmaceuticals Using Human Stem-Like Cells and Metabolomics)”，韦斯特(West)等人，2010，毒理学与应 用药理学(Toxicol Appl Pharmacol)；247(1):18-27，和克莱因斯特瑞 乌尔(Kleinstreuer)等人，2011，毒理学与应用药理学(Toxicol Appl Pharmacol)；257(1):111-121)中，将干细胞以两步给予一种测试化 合物，(1)在针对细胞活力测量的多个浓度，确定针对代谢组学研 究的最佳剂量水平，其提供最大代谢响应与最小细胞死亡，以及(2) 然后在确定最好浓度后，将新一批的细胞以衍生自该最佳浓度和IC50的3个浓度进行给药，收集该培养基用于LC-MS分析(使用ESI阳 性和ESI阴性离子化极性两者)。在本发明的快速预测方法中，从包 含在多种浓度给药的细胞的第一步96孔板收集培养基，并直接在质 谱仪上使用短的多的LC梯度(6.5分钟对比前述方法的23分钟)， 仅使用阳性极性ESI进行分析。在一些方面，该快速预测方法可利用 沃特斯Acquity UPLC BEH Amide 2.1x 501.7uM柱，而不是更长的菲 罗门Luna HILIC 100x 3mm 1.7uM柱。可在18小时中针对两个96 孔板(对应于2种测试化合物)获取LC-MS数据。
在一些方面，除了约1之外的倍数改变比率指示了该测试化合物 的致畸性，例如，大于约1的倍数改变比率(例如，包括但不限于约 1.01、约1.02、约1.03、约1.04、约1.05、约1.06、约1.07、约1.08、 约1.09、约1.1、约1.11、约1.12、约1.13、约1.14、约1.15、约1.16、约1.17、约1.18、约1.19、约1.2、约1.21、约1.22、约1.23、约1.24、 约1.25、约1.26、约1.27、约1.28、约1.29、约1.3、约1.31、约1.32、 约1.33、约1.34、约1.35、约1.36、约1.37、约1.38、约1.39、约1.4、 约1.41、约1.42、约1.43、约1.44、约1.45、约1.46、约1.47、约1.48、 约1.49、或约1.5)和/或少于约1的倍数改变比率(例如，包括但不 限于约0.99、约0.98、约0.97、约0.96、约0.95、约0.94、约0.93、 约0.92、约0.91、约0.9、约0.89、约0.88、约0.87、约0.86、约0.85、 约0.84、约0.83、约0.82、约0.81、约0.8、约0.79、约0.78、约0.77、 约0.76、约0.75、约0.74、约0.73、约0.72、约0.71、约0.7、约0.69、 约0.68、约0.67、约0.66、约0.65、约0.64、约0.63、约0.62、约0.61、 约0.6、约0.59、约0.58、约0.57、约0.56、约0.55、约0.54、约0.53、 约0.52、约0.51、或约0.5)。
例如，在一些方面，少于约0.9和/或大于约1.1的倍数改变比率 指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.9和/或少于约1.1的倍 数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于或等 于约0.9和/或大于或等于约1.1的倍数改变比率指示了该测试化合物 的致畸性，并且大于约0.9和/或少于约1.1的倍数改变比率指示了该 测试化合物的非致畸性。
例如，在一些方面，少于约0.89和/或大于约1.11的倍数改变比 率指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.89和/或少于约1.11 的倍数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于 或等于约0.89和/或大于或等于约1.11的倍数改变比率指示了该测试 化合物的致畸性，并且大于约0.89和/或少于约1.1的倍数改变比率指 示了该测试化合物的非致畸性。
例如，在一些方面，少于约0.88和/或大于约1.12的倍数改变比 率指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.88和/或少于约1.12 的倍数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于 或等于约0.88和/或大于或等于约1.12的倍数改变比率指示了该测试 化合物的致畸性，并且大于约0.88和/或少于约1.12的倍数改变比率 指示了该测试化合物的非致畸性。
例如，在一些方面，少于约0.87和/或大于约1.13的倍数改变比 率指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.87和/或少于约1.13 的倍数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于 或等于约0.87和/或大于或等于约1.13的倍数改变比率指示了该测试 化合物的致畸性，并且大于约0.87和/或少于约1.13的倍数改变比率 指示了该测试化合物的非致畸性。
例如，在一些方面，少于约0.86和/或大于约1.14的倍数改变比 率指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.86和/或少于约1.14 的倍数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于 或等于约0.86和/或大于或等于约1.14的倍数改变比率指示了该测试 化合物的致畸性，并且大于约0.86和/或少于约1.14的倍数改变比率 指示了该测试化合物的非致畸性。
例如，在一些方面，少于约0.85和/或大于约1.15的倍数改变比 率指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.85和/或少于约1.15 的倍数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于 或等于约0.85和/或大于或等于约1.15的倍数改变比率指示了该测试 化合物的致畸性，并且大于约0.85和/或少于约1.15的倍数改变比率 指示了该测试化合物的非致畸性。
例如，在一些方面，少于约0.84和/或大于约1.16的倍数改变比 率指示了该测试化合物的致畸性，并且大于约0.84和/或少于约1.16 的倍数改变比率指示了该测试化合物的非致畸性。在一些方面，少于 或等于约0.84和/或大于或等于约1.16的倍数改变比率指示了该测试 化合物的致畸性，并且大于约0.84和/或少于约1.16的倍数改变比率 指示了该测试化合物的非致畸性。
一种代谢物，其片段、加合物、减去物或损失物的确定，可使用 一种物理分离方法进行鉴定。在一些实施例中，一种代谢物，其片段、 加合物、减去物或损失物的确定，可使用除了物理分离方法之外的一 种方法进行鉴定。此类测量方法可包括例如，比色测定、酶测定、或 免疫学测定。免疫学测定可包括例如，IF、RIA、ELISA和其他免疫 测定。可替代地，可通过，例如，基因表达分析，包括实时PCR、 RT-PCR、RNA印迹(Northern分析)、和原位杂交鉴定某些生物标 记物。
如此处使用的术语“物理分离方法”是指本领域的普通技术人员 已知的足以产生如下曲线的方法，该曲线是在hSLC与一种有毒、致 畸或测试化学品化合物接触时产生的小分子的改变和差异。在一些实 施例中，物理分离方法许可检测以下细胞代谢物，包括但不限于糖、 有机酸、氨基酸、脂肪酸、激素、维生素、和寡肽，连同其离子片段 和低分子量化合物(优选具有少于3000道尔顿，并且更具体地是50 和3000道尔顿之间的分子量)。例如可以使用质谱法。在具体的实 施例中，这个分析可通过液体色谱法/电喷射离子化飞行时间质谱法 (LC/ESI-TOF-MS)进行。然而，应理解，可使用替代的色谱方法或 其他本领域中已知的方法(包括但不限于此处所述的那些中的任一 个)检测如此处列出的代谢物。
例如，生物标记物是通过包括LC/ESI-TOF-MS和/或QTOF-MS 的方法鉴定的。代谢组学生物标记物是通过其独特的分子质量鉴定 的，并且与响应于一种具体的有毒的、致畸的或测试化合物检测的标 记物一致；因此为了实践本发明实际上不需要鉴定对应于该生物标记 物的潜在化合物。
可使用以下鉴定生物标记物，例如，质谱法，例如MALDI/TOF (飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱 -质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、毛细管电 泳-质谱法、核磁共振光谱法、串联质谱法(例如，MS/MS、MS/MS/MS、 ESI-MS/MS等)、二次离子质谱法(SIMS)、和/或离子迁移谱(例 如GC-IMS、IMS-MS、LC-IMS、LC-IMS-MS等)。
在一些方面，可使用一种气相离子分光光度法。在其他方面，可 使用激光-解吸/离子化质谱法以鉴定生物标记物。例如，现代激光解 吸/离子化质谱法(LDI-MS)能以两个主要的变型实施；基质辅助激 光解吸/离子化(MALDI)质谱法和表面增强激光解吸/离子化(SELDI)。在MALDI中，分析物与含有基质的溶液混合，并且将 一滴该液体放置在基板的表面上。然后使该基质溶液与该生物标记物 共结晶。将该基板插入到质谱仪中。激光能量被引导到基板表面，在 此处它解吸和电离化这些蛋白质而不显著破碎它们。然而，MALDI 作为一种分析工具具有限制。它不提供用于分馏该生物流体的手段， 并且该基质材料可以干扰检测，特别是对于低分子量分析物。在SELDI 中，该基板表面被修饰，使得它是在解吸过程中的积极参与者。在一 种变型中，该表面被选择性地结合感兴趣的生物标志物的吸附剂和/ 或捕获试剂衍生化。在另一个变型中，该表面被能量吸收分子衍生化， 能量吸收分子被激光击中时未被解吸。在另一个变型中，该表面被结 合感兴趣的生物标志物的分子以及包含在施加激光时断开的光解键 的分子衍生化。在这些方法的每个中，衍生剂通常被定位于基板表面 上施加样品的特定位置。这两种方法可以通过以下组合，例如，使用 SELDI亲和力表面捕获一种分析物(例如，生物标记物)，并将含有 基质的液体添加到所捕获的分析物中以提供能量吸收材料。
来自质谱法的数据可被表示为质谱图。“质谱图”是质谱法数据作 为色谱图的一种表示，其中x轴表示时间，并且y轴表示信号强度。 在一个方面，该质谱图可以是总离子流(TIC)色谱图。在另一个方 面，该质谱图可以是基峰色谱图。在其他方面，该质谱图可以是选择 离子监测(SIM)色谱图。在又另一个方面，该质谱图可以是选择反 应监测(SRM)色谱图。在又另一个方面，该质谱图可以是提取离子 色谱图(EIC)。在EIC中，在整个运行中监测单个特点。在分析中 的每一个点绘制围绕一种特定分析物的质荷比的质量公差窗口内的总强度或基峰强度。质量公差窗口的大小通常取决于收集数据的仪器 的质量准确度和质量分辨率。如在此使用的，术语“特点”是指一种单 一的小的代谢物或一种代谢物的一个片段。在一些实施例中，术语特 点在进一步调研时也可包括噪声。
本领域的普通技术人员理解，质谱仪的部件中的任何一个，例如 解吸源、质量分析仪、检测等，以及各种样品制剂可以与此处描述的 或本领域普通技术人员已知的其他合适的部件或制剂组合。例如，对 照样品可以含有重原子，例如13C，由此允许测试样品在同一质谱运 行中与已知对照样品混合。包括良好的稳定同位素标记。
可使用一种激光解吸飞行时间(TOF)质谱仪。在激光解吸质谱 法中，具有结合的标记物的基板被引入到一个入口系统中。该标记物 被解吸，并通过来自离子化源的激光离子化成气相。通过离子光学组 件收集所产生的离子，并且然后在飞行时间质量分析器中，将离子通 过一个短的高电压场加速，并让其漂移到一个高真空室中。在该高真 空室的远端，使该加速的离子在不同的时间撞击一个灵敏的检测器表 面。由于飞行时间是这些离子的质量的函数，可使用离子形成和离子 检测器影响之间的经过时间来鉴定具有特定质荷比的分子的存在或 不存在。在一个方面，生物标志物的水平可以通过MALDI-TOF质谱 法进行检测。
检测生物标记物的方法还包括使用表面等离子体共振(SPR)。 可将SPR生物传感技术与MALDI-TOF质谱法组合用于解吸和鉴定生 物标志物。
可以使用计算机用于统计分析。可以使用用于本领域已知的统计 方法的软件从色谱(质量信号谱)中提取用于统计分析的数据。统计 学是有效利用有关成组的个体或实验的数值数据的科学。用于统计分 析的方法是本领域中众所周知的。
例如，可使用安捷伦公司MassProfiler或MassProfilerProfessional 软件用于统计分析。或可使用安捷伦公司MassHunter软件Qual软件 用于统计分析。可以使用替代的统计分析方法。这类其他统计方法包 括方差分析(ANOVA)检验、卡方检验、相关性检验、因子分析检 验、Mann-Whitney U检验、均方加权误差(MSWD)、皮尔森积差相 关系数、回归分析、施佩尔曼氏秩相关系数、学生T检验、韦尔奇T 检验、杜克检验和时间序列分析。
在一些方面，来自质谱法的信号可以不同的方式进行变换，以提 高该方法的性能。可以如此转换任一单个信号或信号分布的汇总(例 如平均值、中值或方差)。可能的转换包括取对数，取一些正幂次或 负幂次，例如平方根或倒数，或取反正弦(迈尔斯(Myers)，古典 与现代回归应用(Classical and Modern Regression with Applications)， 第2版，达克斯伯里出版社，1990)。
在一些方面，可使用统计分类算法来建立一个分类模型，以预测 测试化合物的致畸性和非致畸性。基于机器学习的分类器已经在各个 领域，如机器感知、医学诊断、生物信息学、脑-机接口、DNA序列 分类、和计算机视觉中的物体识别中得到应用。基于学习的分类器已 被证明在解决某些生物学问题中是高效的。
如在此使用的，“训练集”是在信息科学的各个领域中使用的一个 数据集，以发现潜在的预测关系。训练集用在人工智能、机器学习、 遗传编程、智能系统和统计学中。在所有这些领域中，训练集有大致 相同的作用，并通常与测试集结合使用。
如在此使用的，“测试集”是在信息科学的各个领域中使用的一个 数据集，以评估预测关系的强度和实用性。测试集用在人工智能、机 器学习、遗传编程、智能系统和统计学中。在所有这些领域中，测试 集有大致相同的作用。
“敏感度”和“特异性”是二元分类测试的性能的统计测量。这样敏 感度测量被正确鉴定的、实际阳性的比例(例如患病的人被正确鉴定 为具有该病况的百分比)。特异性测量被正确鉴定的阴性的比例(例 如健康的人被正确鉴定为不具有该病况的百分比)。这两个测量密切 相关于第一类错误和第二类错误的概念。一个理论的、最佳的预测可 以达到100％的敏感性(即预测所有来自生病的组的人生了病)和100 ％的特异性(即不会将来自健康组的任何人预测为生病)。100％的 特异性意味着该测试识别所有实际阴性-例如，在测试某种疾病时，所 有无病的人会被识别为无病。100％的敏感度意味着该测试识别所有实际阳性-例如，所有生病的人都被识别为生病。因此，与高特异性测 试形成对照，高敏感度测试中的阴性结果被用于排除该疾病。高特异 性测试中的阳性结果可以证实疾病的存在。然而，从理论观点看，100％ 特异性测试标准也可归因于一种‘伪造’测试试剂盒，借此该测试只是 总指示阴性。因此，特异性单独不会告诉我们该测试如何做好对阳性 病例的识别。也需要敏感度的知识。对于任何测试，测量之间通常存 在权衡。例如，在如下诊断测定中，其中一个是测试哪个人具有一定 病况，该测定可以被设置为忽略一定比例的被正确鉴定为具有该病况 的生病的人(低特异性)，以减少漏失被正确鉴定为不具有该病况的 健康人的百分比的风险(高灵敏度)。可使用接收者工作特征(ROC) 曲线用图表示这种权衡。
一个测量系统的“准确性”是一个量的测量值和它的实际(真实) 值的接近程度。一个测量系统的“精确度”，也被称为再现性和重复性， 是在不变的条件下重复的测量值显示相同结果的程度。尽管这两个词 可以在口语上同义使用，他们在科学方法的上下文中刻意形成对照。 一个测量系统可以准确但不精确，精确但不准确，不准确也不精确， 或既准确也精确。例如，如果一个实验包含了系统误差，然后增加样 本大小通常增加精确度但不提高准确性。消除系统误差提高准确度， 但不会改变精确度。
术语“可预测性”(也称为平凡性)是一个系统的状态可被定性或 定量地正确预测或预见的程度。完美的可预测性意味着严格决定论， 而缺乏可预见性并不一定意味着缺乏决定论。可预测性的限制可能由 因素例如信息缺乏或过度复杂导致。
在一些方面，本发明的方法可以至少约80％准确性、至少约85％ 准确性、至少约90％准确性、或至少约95％准确性预测一种测试化合 物的致畸性。
在一些方面，本发明的方法可以至少约80％敏感度、至少约85％ 敏感度、至少约90％敏感度、或至少约95％敏感度预测一种测试化合 物的致畸性。
在一些方面，本发明的方法可以至少约80％特异性、至少约85％ 特异性、至少约90％特异性、或至少约95％特异性预测一种测试化合 物的致畸性。
在一些方面，此处所述的方法可利用胱氨酸确定单独，或与多种 其他代谢物(包括但不限于此处所述的代谢物中的一种或多种)中的 任一种组合的胱氨酸。例如，使用相对于参照处理的至少10％增加的 阈值，可仅使用胱氨酸的倍数改变的确定以分类致畸剂。
在一些方面，此处所述的方法可利用鸟氨酸确定单独、与多种其 他代谢物(包括但不限于此处所述的代谢物中的一种或多种)中的任 一种组合的鸟氨酸。例如，使用相对于参照处理的约20％增加和/或 18.5％降低的阈值，可仅使用鸟氨酸的倍数改变的确定以分类致畸剂。
除了测定鸟氨酸与胱氨酸、不对称二甲基精氨酸(ADMA)与胱 氨酸、和/或胱硫醚与胱氨酸的倍数改变的变化比率外，此处所述的方 法的准确性可通过进一步测定与在存在该测试化合物的情况下培养 的hSLC相关的一种或多种额外的代谢物上的倍数改变(与在不存在 该测试化合物的情况下培养的hSLC比较)来提高。
在一些实施例中，一种方法可进一步包括测定精氨酸或其片段、 加合物、减去物或损失物的倍数改变与ADMA或其片段、加合物、 减去物或损失物的倍数改变的比率。在一些方面，少于至少约0.9或 大于至少约1.1的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且大于至少 约0.9和少于至少约1.1的比率指示了该测试化合物的非致畸性。参 见，例如，PCT/US2011/029471和美国专利申请序列号13/069,326(“使 用人干细胞样细胞和代谢组学预测药物的人发育毒性(Predicting Human Developmental Toxicity of PharmaceuticalsUsing Human Stem-Like Cells and Metabolomics)”，韦斯特(West)等人，2010， 毒理学与应用药理学；247(1):18-27，和克莱因斯特瑞乌尔 (Kleinstreuer)等人，2011，毒理学与应用药理学；257(1):111-121。
额外的代谢物可以包括，例如，一种或多种额外的代谢物、两种 或更多种额外的代谢物、三种或更多种额外的代谢物、四种或更多种 额外的代谢物、五种或更多种额外的代谢物、六种或更多种额外的代 谢物、七种或更多种额外的代谢物、八种或更多的额外的代谢物、九 种或更多种额外的代谢物、十种或更多种额外的代谢物、十一种或更 多种额外的代谢物、十二种或更多种额外的代谢物、十三种或更多种 额外的代谢物、十四种或更多种额外的代谢物、或十五种或更多种额 外的代谢物。
一种或多种额外的代谢物可以包括选自以下各项的代谢途径的 代谢物，例如，丙氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐代谢网络；精氨酸和 脯氨酸代谢网络；抗坏血酸盐和阿尔多雷特(aldarate)代谢网络；柠 檬酸盐循环；半胱氨酸和蛋氨酸代谢网络；半乳糖代谢网络；谷胱甘 肽代谢网络；乙醛酸盐和二羧酸盐代谢网络；烟酸盐和烟酰胺代谢网 络；泛酸盐和辅酶A生物合成途径；戊糖和葡糖醛酸相互转换途径； 戊糖磷酸盐途径；丙酸盐代谢网络；丙酮酸盐代谢网络；和/或维生素 B6代谢网络。
例如，一种或额外的代谢物可包括泛酸盐和辅酶A生物合成途径 的代谢物，如，例如丙酮酸、L-缬氨酸、二甲基苹果酸盐、泛解酸盐 (pantoate)、泛酸盐、磷泛酸基-L-半胱氨酸、5,6-二氢尿嘧啶、N- 氨基甲酰基-β丙氨酸、和/或辅酶A。
例如，一种或额外的代谢物可包括谷胱甘肽代谢网络的一种代谢 物，如，例如5-氧脯氨酸、L-谷氨酸盐、甘氨酸、L-γ-谷氨酰半胱氨 酸、甘氨酸、脱氢抗坏血酸盐、谷胱甘酰精胺、和/或L-鸟氨酸。
例如，一种或额外的代谢物可包括精氨酸和脯氨酸代谢网络的一 种代谢物，如，例如丙酮酸盐、二甲基精氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、 谷氨酰胺、天门冬氨酸盐、L-精氨酸琥珀酸盐(argosuccinate)、胍基 -乙酸-磷酸盐、富马酸盐、肌氨酸、2-氧代精氨酸、丙酮酸盐、5-氨基 -戊酸、N-谷酰胺脯氨酸(linatine)、吡咯-2-羧苯磺酸盐(carbosylate)、 腐胺、6-氧代-1,4,5,6-四氢烟酸盐、2,6-二羟基烟酸盐、富马酸盐、和/ 或GABA。
例如，一种或额外的代谢物可包括烟酸盐和烟酰胺代谢网络的一 种代谢物，如，例如6-氧代-1,4,5,6-四氢烟酸盐、2,6-二羟基烟酸盐、 和/或富马酸盐。
例如，额外的代谢物可包括一种或多种、两种或更多种、三种或 更多种、四种或更多种、或五种或更多种选自以下各项的额外的代谢 物：半胱氨酸、N1-乙酰基亚精胺、不对称二甲基精氨酸、胱硫醚、 2'-脱氧尿苷、GABA、苹果酸、琥珀酸、和天冬氨酸。
例如，额外的代谢物可以包括选自以下各项的额外的代谢物中的 任何一种或多种、任何两种或更多种、任何三种或更多种、任何四种 或更多种、任何五种或更多种、任何种或更多种、任何七种或更多种、 任何八种或更多种、任何九种或更多种、任何十种或更多种、任何十 一种或更多种、任何十二种或更多种、任何十三种或更多种、或任何 十四种或更多种：甲基磺酰基乙腈；天冬氨酸，N-乙酰基亚精胺；二 甲基-L-精氨酸；L-胱硫醚；GABA；富马酸；缬氨酸；琥珀酸；天冬 氨酸；泛解酸；具有215.1387的m/z，466的RT，和ESI(+)极性的代谢物；具有234.8904的m/z，246的RT，和ESI(+)极性的代 谢物；具有251.0666的m/z，105的RT，和ESI(+)极性的代谢物； 和具有403.0839的m/z，653的RT，和ESI(+)极性的代谢物。在 一些方面，测定了十五种代谢物的所有倍数改变。参见，PCT/US 2011/029471的表11和美国专利申请序列号13/069,326(“使用人干细 胞样细胞和代谢组学预测药物的人发育毒性(Predicting Human Developmental Toxicity of Pharmaceuticals Using HumanStem-Like Cells and Metabolomics)”)，将这些中每个通过引用以其全文合并在 此。
本发明的基于hSLC和代谢组学的方法提供了超过其他使用基于 小鼠或斑马鱼的模型以确定化合物的毒性和致畸性的研究的一个显 著优势。
可使用本发明的方法用于将一种测试化合物分类为一种致畸剂 或一种非致畸剂、用于预测一种测试化合物的致畸性、和/或用于将一 种测试化合物确认为一种致畸剂。本发明的方法也可在药物发现的临 床前期充当高通量筛选工具。此外，这种途径可被用于检测环境(重 金属，工业废物产品)和营养的化学品(如醇)对人类发育的有害影 响。此外，本发明的方法可以帮助制药、生物技术和环保机构对发展 化合物和人类暴露的关键剂量作出决策。化学生物学整合至胚胎干细 胞技术还提供了增强对人发育和疾病的理解的独特机会。从hSLC分 化的细胞的代谢应该充当相似的作用，并在阐明毒性和疾病对于特定细胞或组织类型具有更大敏感度并且是以人特异性方式的机制上是 有用的。
使用本发明的hSLC依赖性方法产生的生物标记物组合也可以在 用于候选药物和药物发现中先导化合物的临床前评估中的高通量筛 选方法中使用。本发明方法的这一方面与当前发育毒理学模型相比对 工业资源产生的影响最小，因为执行这项技术不需要实验动物。对生 产力产生积极的影响使得在医药行业中研究小组能够以更大的信心 选择和推进化合物用以探索开发，并且遇到不良发育影响的风险减 少。
本发明包括用于鉴定和/或测量一种或多种代谢物的一种试剂盒。 在一些方面，该试剂盒可以用于通过一种物理分离方法确定一种代谢 物。在一些方面，该试剂盒可以用于通过除了物理分离方法之外的一 种方法如，例如一种比色、酶、免疫方法确定一种代谢物。在一些方 面，一种测定试剂盒也可包括一个或多个适当的阴性对照和/或阳性对 照。本发明的试剂盒可以包括其他试剂，例如缓冲剂，并且实践本发 明所需要的溶液也包含在内。任选地与这样一种或多种容器相关联的 可以是通知或印刷的说明书。如在此使用，短语“包装材料”是指用于 储藏该试剂盒内容物的一种或多种物理结构。通过众所周知的方法构 建该包装材料，优选地提供一种无菌的、无污染物的环境。如在此使 用，术语“包装”是指一种固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔 片、等，能够在固定限制之内保持一种多肽。本发明的试剂盒还可以 包含使用说明书。使用说明书典型地包括描述试剂浓度的具体表达， 或至少一种测定方法参数，例如试剂和待混合样品的相对量，试剂/ 样本混合物的维护时间段，温度，缓冲条件、等。
在一些方面，一种试剂盒可以是包装的组合，该组合包括一个第 一容器的基本元素，该第一容器包括处于固体形式的一个特定集的一 种或多种经纯化的代谢物，如此处所述，以及一个第二容器，该第二 容器包括用于重悬该特定亚集的经纯化代谢物的生理学上适合的缓 冲液。
本发明通过以下实例进行说明。应理解，具体实例、材料、量以 及程序应根据如在此所列出的本发明的范围和精神广义地解释。
实例
实例1
一种用于发育毒性筛选的新的基于人胚胎干细胞的生物标记物测定 的建立和评估
在这个实例的情况下，开发了一种利用商业上可得到的人胚胎干（hES）细胞的基于代谢生物标记物的体外测定，从而以指示致畸性的方式鉴定扰乱细胞代谢的测试化合物的浓度。设计这个测定是为了有助于可能的人发育毒物的早期发现期检测。在这个研究中，使用来自hES细胞培养基的代谢组学数据来评估用于开发一种快速体外致畸性测定的可能生物标记物。将hES细胞用具有已知人致畸性的药物在相当于其公开的人峰治疗血浆浓度的一个浓度处进行处理。两种代谢物生物标记物（鸟氨酸和胱氨酸）被鉴定为发育毒性的指示物。然后使用一种9点剂量响应曲线开发使用这些代谢物的一种基于靶向暴露的生物标记物测定，连同一个细胞毒性终点一起。使用一个独立集的测试化合物评价该新的测定的预测性。为了说明该测定可怎样应用到对发育毒性具有未知可能性的化合物，评价了额外的10种化合物，这些化合物没有关于人孕期暴露的数据，但在动物发育毒性研究中已显示阳性结果。该新的测定在该测试集中以77%准确性（57%敏感度，100%特异性)鉴定该可能的发育毒物。该测定与现有体内模型具有高一致性（≥ 75%），证明该新的测定可预测新的化合物的发育毒性可能性，作为发现期测试的部分，并提供关于体内测试中很可能需要的结果的一个信号。
这个实例描述了开发一种快速的、可复制的、基于生物标记物的 针对发育毒性测试的筛选，被设计为以预测发育毒性的方式鉴定如下 暴露水平，在此暴露水平下一种测试化合物扰乱代谢。跨越九个独立 实验重复评估两种代谢物即鸟氨酸和胱氨酸响应于该测试化合物的 扰动，以确保跨越多个实验的可重复性和液相色谱高分辨质谱法 (LC-HRMS)系统。使用该鸟氨酸/胱氨酸比率(o/c比率)，我们开 发了一种快速靶向测定，其跨越一种9点剂量响应曲线测量代谢和细 胞活力的改变，以确定在何种暴露水平一种测试化合物以与发育毒性 可能性相关的方式扰乱代谢。为了在化合物的训练和测试集中评估该 测定对已知人致畸剂的预测性，将一种化合物被预测为具有发育毒性 可能性的暴露水平针对在治疗给药之后该化合物的人峰血浆体内浓 度(Cmax)进行评分。在这个情况下Cmax值被用作有助于解释该测定 的性能的一个基准暴露水平，因为它是在治疗情况下人通常会暴露的最高浓度，并且我们期望在这个暴露水平检测发育毒性。
然而，在一种化合物的开发的发现阶段应用该测定不需要这个 Cmax信息，并且一种测试化合物的致畸可能性是基于在何种暴露水平 一种测试化合物以一种指示致畸性的方式扰乱代谢。该测定的设计和 敏感度通过否定代谢物丰度的变化的混杂影响(严格的讲归因于细胞 毒性)，允许在该测试化合物的非细胞毒性水平鉴定致畸可能性。在 多个暴露水平在不存在细胞毒性的情况下鉴定发育毒性的能力是该 测定的一个核心力量，并使它与现有的体外测定区别开。
有用的术语和定义
致畸性阈值。与针对致畸作用的可能性相关的代谢扰动阈值。以 经验为主地，使用该训练集结果，针对靶向生物标记物测定，该阈值 被测定为0.88。这个阈值被应用于使用该测定评价的所有测试集和未 知化合物。
鸟氨酸/胱氨酸比率(O/C比率)。鸟氨酸(Orn)针对处理x的 倍数改变除以胱氨酸(Cyss)针对处理x的倍数改变。
Figure BDA0000709953210000311
致畸性可能性.一种测试化合物的内插暴露水平(浓度)，在此水 平处，o/c比率或细胞活力的剂量响应曲线与该致畸性阈值相交。大 于这个浓度的暴露水平与致畸性相关。
准确性。正确预测的数目除以评价的测试化合物的数目。
敏感度。致畸剂的检测，真阳性/(假阴性+真阳性)。
特异性。非致畸剂的检测，真阴性/(真阴性+假阳性)。
训练集。具有良好建立的人发育毒性信息的化合物集，用以鉴定 发育毒性的生物标记物。在该研究的两个期中测试这个化合物集，并 用以设置该致畸性阈值。
测试集。具有良好建立的人发育毒性信息的化合物集，不用以鉴 定该生物标记物，但用以评价发育毒性的生物标记物的预测性。这个 化合物集是用以评价该靶向生物标记物测定性能，并使用该训练集设 置该致畸性阈值。
应用集。具有未良好定义的人发育毒性信息的化合物集，用以表 明该测定的应用。这些化合物未基于其Cmax被分类为致畸剂或非致畸 剂，因为人致畸性在这个浓度是未知的。
材料和方法
在两个期中进行该基于靶向生物标记物的测定的开发和评价。在 第一期(1期)，两种之前鉴定的预测生物标记物的预测可能性(鸟 氨酸和胱氨酸，克莱因斯特瑞乌尔(Kleinstreuer)等人，2011，毒理 学与应用药理学；257:111-121)是跨越该训练集的九个独立实验重复 (实验区组)使用非靶向的代谢组学方法表征的。在该第二期(2期)， 该预测生物标记物是用以开发一种快速周转的、靶向的、基于暴露的 针对化合物基于致畸性可能性的优先次序的测定。该新的测定的预测 性是使用初始训练集连同一个独立测试集的化合物评价的。
测试化学品选择和分类.使用总共46种化合物来评价鸟氨酸、胱 氨酸的能力和o/c比率，以在两个实验期预测发育毒性。这46种化合 物被分成三个组，称为训练、测试、和应用集。该训练集是一组具有 良好建立的人发育毒性信息的化合物，用以鉴定发育毒性的生物标记 物。该测试集是一组具有良好建立的人发育毒性信息的化合物，不用 以鉴定该生物标记物，但用以评价发育毒性的生物标记物的预测性。 该应用集是一组具有未良好定义的人发育毒性信息的化合物，用以表 明该测定的应用。这些化合物未基于其Cmax被分类为致畸剂或非致畸 剂，因为人致畸性在这个浓度是未知的。
该训练集由23种良好表征的药物化合物(11种已知为人非致畸 剂和12种已知为人致畸剂，表2)组成，并且之前用以建立一个计算 模型并鉴定预测致畸性的生物标记物(克莱因斯特瑞乌尔 (Kleinstreuer)等人，2011，毒理学与应用药理学；257:111-121)。 这个训练集是在两个实验期利用的。为了评估在这些研究中开发的靶 向生物标记物测定的预测能力，在第二实验期中使用一个额外的测试 集的13种良好表征药物化合物(6种已知为人非致畸剂和7种已知为 人致畸剂，表3)，以评价该新的测定的预测性。最终集的化合物(该 应用集，表4)由不具有可在人孕期暴露获得的决定性发育毒性数据 但具有关于发育毒性可能性可获得的动物数据的10种化合物组成。 应用化合物分类的一个两类系统(致畸剂和非致畸剂)用于测定发育， 该致畸性分类严格聚焦于观察到的与每个化学品相关的人风险。化合 物购自西格玛奥德里奇(圣路易斯，MO)，除了安普那韦、波生坦、 恩他卡朋(多伦多研究化学品公司(Toronto Research Chemicals)， 多伦多，安大略，加拿大)、拉帕替尼(泰克化学公司(Chemie Tek)， 印第安纳波利斯，IN)、西多福韦和雷美替胺(塞莱克化学品(Selleck Chemicals)，休斯顿，TX)之外。
表1.训练集化合物说明。
Figure BDA0000709953210000341
aFDA分类要求，描述于舒尔(Shure)(2008，联邦公报(Federal Register)；73:30831-30868)。
b体内临床前和已知人发育影响总结自致畸剂信息系统(TERIS，参 见万维网depts.washington.edu/terisweb/teris/)和布里格斯(Briggs) 等人(2011，“孕期和哺乳期药物(Drugs in pregnancy and lactation)” 第9版费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威尔金斯(Wilkins) 出版社)。
c除致畸影响外的胚胎毒性(例如，生长迟缓、胚胎致死现象)。
表2.测试集化合物说明。
Figure BDA0000709953210000351
aFDA分类要求，描述于舒尔(Shure)(2008，联邦公报(Federal Register)；73:30831-30868)。
b体内临床前和已知人发育影响总结自致畸剂信息系统(TERIS，参 见万维网depts.washington.edu/terisweb/teris/)和布里格斯(Briggs) 等人(2011，“孕期和哺乳期药物(Drugs in pregnancy and lactation)” 第9版费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威尔金斯(Wilkins) 出版社)。
c除致畸影响外的胚胎毒性(例如，生长迟缓、胚胎致死现象)。
表3.应用集化合物说明。
Figure BDA0000709953210000361
aFDA分类要求，描述于舒尔(Shure)(2008，联邦公报(Federal Register)；73:30831-30868)。
b体内临床前和已知人发育影响总结自致畸剂信息系统(TERIS，参 见万维网depts.washington.edu/terisweb/teris/)和布里格斯(Briggs) 等人(2011，“孕期和哺乳期药物(Drugs in pregnancy and lactation)” 第9版费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威尔金斯(Wilkins) 出版社)。
c除致畸影响外的胚胎毒性(例如，生长迟缓、胚胎致死现象)。
d克拉克(Clark)，2009，生殖毒理学(Reprod Toxicol)；28:285-296。
未分化的hES细胞系保持(1期和2期)。WA09hES细胞获得 自WiCell研究所(麦迪逊，WI)，并在无饲养层条件下在hESC合 格基质胶(Matrigel)(BD生物科学公司(BDBiosciences)，圣何 塞，CA)涂覆的6孔板中使用mTeSR1培养基(干细胞技术公司(StemCell Technologies,Inc.)，温哥华，BC，加拿大)保持。为了 保持未分化的干细胞群，分化的菌落每天通过抽吸去除并替换培养 基。此外，hES细胞仅用在实验中达通道40，并大约每10代检测核 型，以最小化并且监测遗传不稳定的可能性。将hES细胞在90％-95 ％融合时(大约每7天)使用维尔烯(生命科技公司，格兰德岛，NY) 传代。将所有细胞培养物在37℃、5％CO2下保持。
96孔hES细胞铺板(1期和2期)。所有实验处理是在96孔板 上进行。为了最小化铺板可变性和增加再现性，hES细胞被铺板为单 个细胞悬浮液并在化合物暴露过程中维持在一种未分化的状态。在该 96孔板中铺板之前，从一种6孔板中使用TrypLE(生命科技公司)去除hES细胞。该细胞用DMEM/F12(生命科技公司)洗涤并重悬于 包含10μM Y27632Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂(默克公司(Merck KGaA/Calbiochem)，达姆施塔特，德国)的mTeSR1中。将ROCK 抑制剂添加到该铺板培养基中以通过降低离解诱导的细胞凋亡增加 铺板效率。将hESC合格基质胶涂覆的96孔板的内60个孔以100,000 个细胞/孔的密度种植。该板的外孔包含等体积培养基，以最小化跨越 该板的湿度上的不同。铺板24小时后开始化合物暴露。
期I hES细胞化合物暴露。将hES细胞用一种测试化合物在等价 于该化合物的公开治疗Cmax的单一浓度处进行处理。使用治疗Cmax， 因为它被认为是生理上相关的暴露水平并与该化合物的发育影响相 关联(国家研究委员会(National Research Council)，2000，“发育毒 理学和风险评估科学前沿(Scientific frontiers in developmentaltoxicology and risk assessment)”，华盛顿，DC：美国学术出版社(The NationalAcademies Press))。对于六种化合物(5-氟尿嘧啶、氨喋呤、 白消安、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羟基脲和甲氨蝶呤)使用一个实验测定的 IC30代替该Cmax值，这归因于在该Cmax暴露水平大于30％的细胞毒性。 这样做是为了确保在样品收集时有足够的细胞存在，以提供用于 LC-HRMS分析的信号。对于测试化合物暴露，所有化合物储备溶液 (除了丙戊酸)是用DMSO(西格玛奥德里奇)制备的。丙戊酸在 DMSO中在这个研究中使用的浓度是不可溶的，所以它被稀释于包含 0.1％DMSO的mTeSR1中。每个96孔板包括培养基对照，有和没有 测试化合物，0.1％DMSO溶剂，对照细胞和暴露于单一浓度的八种 不同的测试化合物的细胞(图1A)。培养基对照包括在每个板上， 以评估测试化合物对样本基质的影响。将hES细胞暴露于该测试化合 物持续72小时，每隔24小时替换培养基和测试化合物。在整个处理 周期中监测细胞，以确保未发生分化。在处理72小时后，收集从最 终的24小时处理周期消耗的培养基并添加到乙腈(西格玛奥德里奇， 最终乙腈浓度40％)中，以停止代谢过程，并从溶液中沉淀蛋白质。 收集来自每个96孔板的单孔并作为单独的样本进行分析。然后将这 些样本储存在-80℃下，直到制备用于LC-HRMS分析。根据制造商 说明(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，WI)，使用CellTiter-Fluor 细胞活力测定评估细胞活力。如下设定质量控制参数使得如果该处理 中6个细胞样本的相对荧光单位(RFU)活力变异系数(CV)超过 10％，并且使用格拉布检验没有鉴定到离群值(参见万维网 graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm)，则停止分析该化合物，并重 复细胞培养实验。如果离群值存在，则将离群值样本从分析中去除。 如果针对一个板上DMSO对照细胞样本的CV在这些质量控制参数之 外，则重复整个板。总共九次重复将hES细胞暴露于这23种化合物 中的每个。
2期hES细胞化合物暴露。该靶向生物标记物测定的预测性是在 初始训练集连同一个独立测试集中评价的(表2和3)。此外该测定 被应用到应用集的化合物中(表4)，以在当人致畸性是未知时表明 功用。用于大部分化合物的标准化合物暴露水平是范围从0.04μM-300 μM的九个3倍稀释(图1B)。针对丙戊酸的暴露范围增加至4 μM-30,000μM，因为其治疗Cmax在该标准暴露范围之外。将在浓度低 于1μM时有细胞毒性的化合物在更低暴露水平(0.001μM-10μM) 重复。每种测试化合物的储备溶液是在100％DMSO中以1000倍于 最高暴露水平的一个浓度制备的，抗坏血酸、叶酸、和丙戊酸除外。 这三种化合物在DMSO中是完全不可溶的，并且储备液是在包含0.1％ DMSO的mTeSR1中制备的。将该储备溶液在mTeSR1培养基中1: 1000稀释，并且在包含0.1％DMSO的mTeSR1中进行随后的稀释， 使得在所有处理中DMSO的最终浓度是0.1％。将hES细胞处理72 小时，并收集从上一个24小时处理周期消耗的培养基，并添加到包 含13C6标记的精氨酸(剑桥同位素实验室，安多弗，MD)的乙腈中， 如在1期下所述的。将消耗的培养基样本存储在-80℃直至制备用于 LC-HRMS分析。使用CellTiter-Fluor细胞活力测定评估细胞活力。一 个质量控制步骤包括如下标准，DMSO对照细胞的测量活力RFU的 CV不可超过10％以使一个板经受LC-HRMS分析。一种剂量响应曲线被拟合为参照处理(0.1％DMSO处理对照细胞)标准化数据
(活力RFUTrt X/活力RFUDMSO)，使用一个带有R软件包“drc” 的四参数对数逻辑模型(里兹(Ritz)和斯特雷比格(Streibig)，2005， 统计软件杂志；12:1-22)。
样本制备(1期和2期)。该消耗的培养基样本的高分子量成分 (>10KDa)是使用一种Millipore Multiscreen Ultracel-10过滤板(EMD 密理博公司(EMD Millipore)，比勒利卡，MA)去除。在样品过滤 前，将过滤板用0.1％NaOH洗涤，以去除已知污染物聚合物。然后 将板用HPLC级水漂洗两次，以去除残留的聚合物和NaOH。将消耗 的培养基样本添加到经洗涤的过滤板中。在1期中，将样本掺杂以13C6标记的精氨酸。在4℃在2,000X g下将样本离心200分钟。收集滤 液并且在莎凡特(Savant)高容量Speedvac Plus浓缩器中进行浓缩。将浓缩的样本重新溶解于1:1的水中的0.1％甲酸：含有13C5标记的 谷氨酸(剑桥同位素实验室)的乙腈混合物中的0.1％甲酸中。该13C 标记的化合物用作内标来追踪制备效率并追踪LC-HRMS性能。
1期质谱法。在三个独立的LC-HRMS系统中针对九个生物重复 获取LC-HRMS数据，在每个系统上评价三个重复。每个系统由与一 种安捷伦公司G6520A QTOF高分辨率质谱仪(QTOF HRMS)、一 种安捷伦公司G6530A QTOF HRMS、或一个安捷伦公司G6224A TOF HRMS系统(安捷伦技术公司，圣克拉拉，CA)相接的一个安捷伦 公司1290Infinity LC系统组成。为了有利于分离具有宽范围的结构的 生物的小分子并且允许增加对亲水种类的保留，利用了亲水相互作用 液相色谱法(HILIC)。使用具有维度3×100mm和3μm颗粒尺寸 的一种LunaHILIC柱(菲罗门，托伦斯，CA)并维持在30℃。注入 样本(2μL)，并且该数据获取时间是23分钟(min)，以0.5ml/min 的流速，使用17min溶剂梯度，溶剂是水中0.1％甲酸(溶剂A)和 乙腈中0.1％甲酸(溶剂B)。使用一种双重ESI源采用电喷射离子化。 该仪器的扫描范围是70-1600Da。数据获取是用MassHunter获取软件 (版本B 04.00，安捷伦技术公司)进行的，使用高分辨率准确质量条 件，并且使每个样本集首先在ESI阳性极性下然后在ESI阴性极性条件下运行。
2期质谱法。为了评估该靶向生物标记物测定的性能使用两种仪 器平台获取数据。针对每种化合物的超高效液相色谱法(UPLC) -HRMS数据获取是使用两种系统中的一种进行的。系统1由与一种安 捷伦公司G6520A QTOF HRMS相接的一种安捷伦公司1290Infinity LC系统组成。系统2使用与一种安捷伦公司G6224A TOF HRMS相 接的相同模型LC系统。应用维持在40℃的一种沃特斯Acquity UPLC BEH Amide 2.1x 50mm 1.7μm颗粒尺寸柱(沃特斯，米尔福德，MA) 用于分离代谢物。以1.0ml/min的流速使用一种溶剂梯度，该溶剂是 水中0.1％甲酸(溶剂A)和乙腈中0.1％甲酸(溶剂B)，并且注入2 μL样本。使用一种双重ESI源采用电喷射离子化，仅以阳性离子化模 式操作。该仪器的质量范围被设置为60-1600Da，并且使用MassHunter 获取软件(版本B 04.00)经6.5min获取数据。在样本中胱氨酸和鸟 氨酸代谢物的鉴定先前通过比较其碰撞诱导解离质谱与参照标准(西 格玛奥德里奇)证实。
峰检测(1期和2期)。使用MassHunter定性分析软件版本5.0 (安捷伦技术公司)将安捷伦公司原始数据文件转换为开源mzData 文件格式。在转换过程中，对质心数据进行去同位素(+1仅充电状态)， 并在分析中排除绝对高度小于200的峰。使用R软件包“xcms”(史密 斯等人，2006，分析化学；78:779-787)进行峰选取和特点构建。使 用centwave算法检测质量特点(峰)。使用基于非线性聚类法的obiwarp 算法校正保留时间偏差以比对来自LC-MS样本中的数据。使用基于 密度分组算法生成质量特点箱或组。在数据已经分组成质量特点后， 基于保留时间和特点箱的质量范围使用迭代峰填充以对丢失的特点 进行积分。特点强度基于特点提取离子色谱的墨西哥帽积分值。
鸟氨酸/胱氨酸比率计算。在该研究的两期中，样本的每个96孔 板包含一种参照处理(0.1％DMSO)以允许弥补随着时间的推移 LC-MS仪器响应的不同。针对每个代谢物计算相对倍数改变，通过用 一个处理水平内每个样本的积分面积除以参考处理(DMSO)的中值 积分面积，以针对在细胞培养样本的一个板内每个样本中的两种代谢 物产生一个标准化值。通过用鸟氨酸的参照标准化值除以胱氨酸的参 照标准化值计算针对一个处理中的每个样本的o/c比率。在2期中， 使用每个浓度的平均o/c比率值，使用R软件包“drc”(里兹(Ritz) 和斯特雷比格(Streibig)，2005，统计软件杂志；12:1-22)拟合剂量 响应的四参数对数逻辑模型。
致畸性阈值选择(1期和2期)。致畸性的分类是基于以下前提， 针对个体代谢物可鉴定与发育毒性相关的代谢扰动的阈值。代谢改变 的这个阈值被称为致畸性阈值，并且是区分致畸剂和非致畸剂需要的 代谢扰动量级的测量。以经验为主地，该致畸性阈值是针对鸟氨酸、 胱氨酸、和o/c比率通过范围从10％至25％改变的迭代产生的，以鉴 定一个能够对具有最大准确性和最高敏感度的训练集进行分类的一 侧或两侧的非对称阈值。在一侧和两侧的阈值之间的分类准确性和敏 感度平局的情况下，优先考虑一侧的阈值以利于简易性。由于在1期 进行的测定仅使用单一浓度的每种化合物，并且在2期开发的靶向生 物标记物测定利用了一种基于暴露的途径，针对该研究的每个期测定 一个致畸性阈值。该致畸性阈值是在2期仅使用来自该训练集的结果 测定的。然后这个阈值被应用到来自该测试和应用集的结果。
发育毒性可能性的1期预测。如果与参照处理(DMSO)比较， 该处理样本丰度的改变的平均值在九个实验重复针对代谢物的或o/c 比率超过其在浓度测试中各自的致畸性阈值，则一种测试化合物被分 类为一种发育毒物。该预测准确性(正确预测)、敏感度(真阳性率)、 和特异性(真阴性率)基于对针对该化合物的已知人致畸性的预测结 果(致畸剂或非致畸剂)进行的评分。
发育毒性可能性的2期预测。对于具有未知发育毒性可能性的测 试化合物，利用该靶向生物标记物测定以鉴定如下暴露水平，在此暴 露水平处一种测试化合物以一种指示致畸性的方式扰乱代谢并且不 需要任何药代动力学信息(例如，Cmax)。图2说明了在此种情况下 怎样应用该测定。在o/c比率超过该致畸性阈值的暴露水平处，一种 测试化合物被认为是致畸的(红框，图2)。在该致畸性阈值处来自 o/c比率或细胞活力的四参数对数逻辑模型的内插浓度被认为是一种 测试化合物的致畸性可能的暴露水平(图2)。大于该致畸性可能浓 度的暴露水平被预测为具有发育毒性可能性。
为了评估该测定在该训练和测试集中的预测性，由o/c比率和细 胞活力测定的致畸性可能浓度被用以相对于人治疗Cmax浓度分类该 测试化合物的致畸性。由于这些化合物的发育毒性可能性在人类中是 未知的，这个途径未被应用到应用集。使用人治疗Cmax将一种测试化 合物评分为一种致畸剂或非致畸剂的逻辑是基于以下范例，暴露在致 畸作用中是一种关键因素，并且一种已知人致畸剂在最高暴露时或低 于最高暴露时(很可能发生在治疗循环水平)很可能扰乱细胞代谢。 如果o/c比率的扰动在大于该化合物的Cmax浓度的浓度展现(图3A)， 它被评分为一种非致畸剂，因为扰动是在很可能在常规治疗过程中遇 到的一个范围之外观察到的。如果一种化合物在或低于其治疗Cmax的 一个浓度展现致畸性可能性，则它被分类为一种致畸剂(图3B)，因 为指示致畸作用的一个代谢扰动是在该治疗浓度范围内展现的。使用 相同的范例，来自细胞活力的致畸性可能浓度被用以预测一种化合物 的致畸性。该测定的预测准确性、敏感度、和特异性是通过将该预测 结果与一种化合物的已知人致畸性进行比较来计算的。
该靶向生物标记物测定与其他发育毒性测试的比较。一个文献综 述比较了啮齿动物和兔体内模型以及三种体外筛选针对在该靶向生 物标记物测定中测试的化合物的发育毒性预测(欧洲中心关于替代方 法(ECVAM)评价的小鼠胚胎干细胞测试(mEST)、斑马鱼胚胎毒 性试验(ZET)、以及移植后大鼠全胚胎培养(WEC)测试的批准)。 将在这些测定中使用每个原著者分类方法进行的预测用于比较，并且 未重新解释该数据。其他体外系统采用了一种三级分类系统(非、弱/ 中等、和强致畸剂；布朗(Brown)，2002，实验动物的替代方案(Altern Lab Anim)；30:177-198)，与在这个研究中使用的两级系统进行比 较。因此，为了将来自该靶向生物标记物测定的结果与其他模型进行 比较，来自这些测定的预测结果需要被修改为一个两级系统。被预测 为弱/中等或强致畸剂的化合物两者都被标记为一种预测致畸剂。通过 将该预测结果针对该已知人致畸性进行评分，针对每个测定计算准确 性、敏感度和特异性。针对已在该其他模型系统中测试的特定的化合 物集，另外计算这些值以用于靶向生物标记物测定。通过比较每个比 较的普通处理内的致畸剂或非致畸剂的分类，评价该靶向生物标记物 测定和其他上述的模型之间的一致性。
结果
预测发育毒性的代谢物的1期模型证实和表征。进行这个研究的 第一期是为了证实个体代谢物的预测性。该预测代谢物的表征导致在 这个研究的第二期所述的新的靶向生物标记物测定的开发。之前，利 用一个训练集的23种药物化合物(表2)以鉴定能够体外预测致畸性 的一个代谢特征(克莱因斯特瑞乌尔(Kleinstreuer)等人，2011，毒 理学与应用药理学；257:111-121)。将用致畸剂处理时展现一种统计 上的显著改变并缺少对非致畸剂的响应的代谢物针对其能力进行表 征，以使用一种简单的倍数改变阈值分类发育毒物。这些代谢物中， 鸟氨酸和胱氨酸被鉴定为如下代谢物，其代表了之前应用的高度预测 发育毒性的代谢特征。这两种代谢物中的每种分类发育毒物的能力是 通过基于用一种测试化合物处理的细胞对比每个代谢物的参照处理 (0.1％DMSO)的倍数改变测定致畸性阈值来表征的。该阈值是用以 评价该训练集内每个代谢物的分类准确性。
鸟氨酸和胱氨酸各自展现经得起快速评价一种测试化合物以与 致畸性一致的方式扰乱代谢的可能性的特征。在hES细胞消耗的细胞 培养基中两种代谢物都是高度丰富的并且在响应于在多种LC-HRMS 仪器上可复制地测量的处理时显示在其丰度上的改变。为了证实这些 最初的观察和该途径的再现性，进一步在囊括该训练集的9个独立实 验重复(区组)的一个研究中评价该代谢物。该分泌代谢物鸟氨酸能 够以83％准确性使用一种两侧阈值区分致畸剂与非致畸剂(表5)， 该两侧阈值由在鸟氨酸的积累上的一个18.5％降低或20％增加组成 (图4A)。胱氨酸(一种培养基成分)在分类致畸剂上最好地预测 个体代谢物并且使用相对于该参照处理的10％增加的阈值(图4B) 具有83％的准确性(表5)。胱氨酸展现在丰度上的显著增加，相对 于针对在hES细胞中未引起细胞毒性的大部分的致畸剂(例如羟基脲， 全反式视黄酸，13-顺式视黄酸，卡马西平，以及萨力多胺)的参照处 理。鸟氨酸在细胞毒性处理的情况下
(例如5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，甲氨蝶呤，以及丙戊酸) 减少，但当细胞暴露于相关的非细胞毒性致畸剂全反式视黄酸和13- 顺式视黄酸时增加。
接着，对鸟氨酸和胱氨酸的比率的倍数改变比其个体倍数改变更 具有预测性的可能性进行了评价。当将鸟氨酸倍数改变除以该胱氨酸 倍数改变(即o/c比率)时，所得到的比率能够使用在o/c比率上的 12％降低的一个致畸性阈值正确地分类91％(表5)的该训练集(图 4C)，错误分类仅有苯妥英和华法林。与鸟氨酸和胱氨酸的准确性单 独比较，o/c比率的应用增加了整体预测准确性8％，捕获鸟氨酸的高 特异性和胱氨酸的高敏感度(表5)产生一种更准确的致畸性分类。
表4.在基于非靶向代谢组学发育毒性测定中的致畸性阈值和代 谢物模型度量。
Figure BDA0000709953210000451
致畸性阈值，与致畸作用相关的代谢扰动的一个关键阈值；准确性，正确 预测的数目除以评价的测试化合物的数目；敏感度，致畸剂的检测；特异 性，非致畸剂的检测。
用以预测与暴露相关的发育毒性的一种靶向生物标记物测定的2 期开发和评价。
靶向LC-HRMS方法开发。在这个研究的第二期，使用1期证实 的代谢物开发一种基于靶向生物标记物的测定。由于毒性是该化学品 剂和暴露水平两者的函数，高水平的与o/c比率的毒性的阈值相关的 预测性提供了开发一种靶向、快速致畸性测定的机会。为此，开发了 一种短的和可再现的分析方法并针对在hES细胞消耗的培养基样本中 在鸟氨酸和胱氨酸丰度上的相对改变的快速周转分析进行优化。相比 之下，之前使用的非靶向代谢组学方法被设计以分析更宽的幅度的小 分子，并因此需要漫长的色谱分离。之前的平台也取决于在阳性和阴 性离子化模式中针对每个样本的两种数据获取。仅聚焦于该色谱分 离、离子化和鸟氨酸和胱氨酸的检测，特异性设计了一种新的靶向方 法以更快速地测量在该hES细胞模型系统中观察到的这些代谢物的相 对改变。开发该新的UPLC-HRMS方法，并使用消耗的培养基样本(如 之前所述的制备的)针对测量鸟氨酸和胱氨酸的增加速度、敏感度、和保留时间再现性进行评估。这在测定周转时间上导致一个显著减 少。针对每个样本的数据获取时间从23分钟减少至6.5分钟，提供了 LC-HRMS通量的四倍增加。该阳性离子化模式优先地可经受得起对 这些代谢物的检测，从而消除对阴性模式的需要，这进一步将针对每个样本批次的总分析时间减少一半，因此将总仪器通量增加八倍。对 经120天使用参照处理样本(DMSO处理细胞)进行的17个批次的 方法再现性进行评价。内标和内源性代谢物的积分面积的平均CV分 别为<5％和<8％，证明该方法以可再现性的方式执行。
致畸性阈值的鉴定。基于在1期使用一个定义的致畸性阈值达到 的高分类准确性，一种9点浓度曲线被用以基于一系列的暴露来分类 发育毒性可能性。使用该2期训练集数据，通过选择一个产生最高预 测准确性与最大敏感度的阈值来优化该致畸性阈值。将该预测致畸性 可能浓度与该治疗Cmax进行比较以对该新的测定设计(在图3，表6 中所述的)的性能和分类准确性进行评分。在这个途径的情况下，在 o/c比率上相对于该参照处理的12％降低是最佳阈值，并且能够以96％ 准确性分类该训练集的化合物(表7，图5A)。该测定正确地分类所 有该非致畸剂(100％特异性)，并且错误分类地这些已知人发育毒物 中的仅一种，即苯妥英(92％敏感度)。
基于测试集预测评价该靶向生物标记物测定性能。为了评估在这 个研究中开发的靶向生物标记物测定的预测性，将使用训练集鉴定的 致畸性阈值应用至测试集的化合物。测试测试集由未包括在该训练集 中的具有已知人致畸性的13种化合物组成，具有B、D和X的FDA 孕期分类。针对该化合物的治疗Cmax，对每个化合物针对o/c比率的 致畸性可能浓度进行评分。该测试集是以77％准确性(100％特异性， 57％敏感度，表7)分类的。o/c比率不正确地分类致畸剂波生坦、拉 帕替尼和洛伐他汀、(表8，图5B)。应注意，依维莫司的Cmax低于 该测定中使用的最低暴露水平，并且这种化合物的o/c比率以低于该 致畸性阈值起始，所以它被分类为一种致畸剂，尽管它在图5B中与 非致畸剂成组。
表5.靶向生物标记物测定结果：训练集。
Figure BDA0000709953210000471
Figure BDA0000709953210000481
Cmax，治疗峰血浆体内浓度；致畸性可能性，当o/c比率或细胞活 力的剂量响应曲线与该致畸性阈值相交时的内插浓度；NON，可 能的非致畸剂；TER,可能的致畸剂。o/c比率的致畸性可能值和 发生在低于该Cmax值的暴露水平处的活力测量值被加粗。
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表6.与来自靶向生物标记物测定的细胞活力比较，鸟氨酸/胱氨酸 比率的模型度量。
Figure BDA0000709953210000491
Figure BDA0000709953210000501
准确性，正确预测的数目除以评价的测试化合物 的数目；敏感度，致畸剂的检测；特异性，非致 畸剂的检测。
表7.靶向生物标记物测定结果：测试集。
Figure BDA0000709953210000502
Cmax，治疗峰血浆体内浓度；致畸性可能性，当o/c比率或细胞 活力的剂量响应曲线与该致畸性阈值相交时的内插浓度；NON， 可能的非致畸剂；TER,可能的致畸剂。o/c比率的致畸性可能值 和发生在低于该Cmax值的暴露水平处的活力测量值被加粗。
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鸟氨酸/胱氨酸比率和细胞活力的比较。因为在消耗的细胞培养基 中测量构成o/c比率的代谢物，可获得处理的细胞以进行细胞活力分 析。将该细胞活力结果与o/c比率进行比较，以确定是否该比率的改 变归因于细胞死亡或是否它是归因于不与细胞活力改变相关的代谢 改变。评价活力结果以使用一个相似于o/c比率的途径来确定分类性 能(图3)。使用来自该训练集的o/c比率结果测定的致畸性阈值也 被用以通过细胞活力基于如下内插浓度分类致畸性，在此浓度该细胞 活力剂量响应曲线超过致畸性阈值(表6和8)。这使得能够直接在 来自对照的等同水平的改变处比较o/c比率和细胞活力。细胞活力针 对该训练集具有70％的准确性并且针对该测试集是62％(表7)。在 该训练和测试集两者中，该细胞活力测定在正确地分类所有这些非致 畸剂上是成功的，但在分类致畸剂上表现不好，在该训练集中这12 种化合物中正确地分类的仅有5种(42％敏感度，表7)并且在该测 试集中7种致畸剂中2种(29％敏感度，表7)。通过细胞活力正确 地分类的那些是杀死分裂细胞的抗肿瘤的化合物。
当应用至训练和测试集时，针对发育毒性预测，相比于活力单独， o/c比率分别是26％和15％更准确的(表7)。o/c比率和细胞活力测 定两者正确地分类非致畸剂，相对于Cmax具有100％特异性，然而它 们在区别致畸剂的能力上不同(表7)。在致畸剂检测中，相比于活 力，单独o/c比率在训练集中是50％更敏感，并且在测试集中是28％ 更敏感(表7)。此外，o/c比率能够正确地分类细胞毒性和非细胞毒 性致畸剂两者。通过o/c比率提供的在假阴性上的降低与该测定的代 谢扰动测量值相关，该代谢扰动可独立于在细胞活力上的改变发生。
在图6中高亮的是一个子集的结果，这些结果表明该测定关于o/c 比率性能相对于细胞活力的若干特征。萨力多胺(图6A)和全反式 视黄酸(图6B)是如下致畸剂的实例，该致畸剂展现在不存在细胞毒 性的情况下指示发育毒性的o/c比率上的改变。该致畸剂丙戊酸(图 6C)是一种细胞毒性致畸剂的一个实例，该细胞毒性致畸剂在暴露水 平在观察到细胞毒性很久之前引起o/c比率上的显著改变。5-氟尿嘧 啶(图6D)是一种抗肿瘤的致畸剂，其在与细胞活力的降低直接相 关的o/c比率上产生改变，并且在该代谢物比率上的改变很可能是细 胞死亡的一个直接结果。视黄醇(图6E)是一种细胞毒性非致畸剂的 一个实例，此处o/c比率直接与在高于人正常情况下遇到的那些几乎 20倍的暴露水平下的细胞死亡相关。非致畸剂糖精(图6F)是在这 个研究中检查的暴露处在o/c比率或活力上不产生改变的一种化合 物。
o/c比率应用至具有未知人致畸性的化合物。该靶向生物标记物 测定被应用至一个应用集的具有未知人发育毒性结果的10种化合物。 由于这些化合物的人发育毒性是未知的，未应用对测定性能进行评分 的Cmax途径(在图3中说明的)，并且这些化合物被处理为未知，如 在图2中说明的。结果呈现为，它们会通过在工业设置中利用的测定 产生。针对o/c比率和细胞活力的致畸性可能浓度总结在表9中。所 有10种化合物在指示致畸性的o/c比率上展现一个改变，尽管在此浓 度下在化合物之间发生的这种改变变化很大。这10种化合物的九种 在测试的暴露范围内在细胞活力上展现一个改变(表9)。这10种化 合物的七种在细胞毒性之前或在不存在细胞毒性的情况下引起在o/c 比率上的一个改变(加粗的化合物，表9)。在不存在母体毒性的情 况下，啮齿动物发育毒性测试在这10种化合物的七种中鉴定了一个 致畸和/或胚胎毒性影响。其他三种化合物(阿德福韦二匹伏酯，西多 福韦，和雷美替胺)在也引起母体毒性的暴露水平下仅有胚胎毒性， 所以不知道该影响是否归因于化合物暴露。
表8.靶向生物标记物测定结果：应用集。
Figure BDA0000709953210000531
Figure BDA0000709953210000541
Cmax，人中的峰血浆浓度；致畸性可能性，当o/c比率或细胞活力的剂 量响应曲线与该致畸性阈值相交时的内插浓度；NA，不可获得或未确 定。在细胞活力之前出现的o/c比率的致畸性可能值被加粗。
a数据编译自布里格斯(Briggs)等人(2011，“孕期和哺乳期药物”第 9版，费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威尔金斯(Wilkins)) 出版社，除非另外指出。
b一种测试化合物被认为是致畸的，如果它在不存在母体毒性的情况下 引起结构性畸形。
c这一栏是指在不存在致畸影响的情况下的一个胚胎毒性影响。一种测 试化合物被认为有胚胎毒性，如果它在不存在母体毒性的情况下引起 生长迟延或胚胎致死现象。
d谢泼德(Shepard)和勒米尔(Lemire)，2007，“致畸剂的目录，” 第12版，巴尔的摩：约翰·霍普金斯大学出版社。
e阿德福韦二匹伏酯在母体有毒剂量处是致畸的和有胚胎毒性的。
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g西多福韦在母体有毒剂量处是有胚胎毒性的。
h雷美替胺是在母体有毒剂量处是致畸的。
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测定性能(比较于其他测定)。将训练和测试集基于o/c比率的 发育毒性预测与来自其他模型系统的公开结果进行比较(表10)。呈 现在表10中的来自该模型系统的针对该应用集的发育毒性预测总结 在补充表1中。对于合并的36种训练和测试集化合物，在一个模型 逐系统(system-by-system)基础上仅使用在靶向生物标记物测定和正 比较的每个模型系统两者中评价的处理进行比较。该比较的结果(表 11)指示，此处所述的o/c比率是针对人发育毒物比其他考虑的模型 系统更准确的指示物。准确性的增加归因于在每个比较(优于其他体 外系统例如mEST和WEC，特异性显著增加)中o/c比率的更低的假 阳性率(增加的特异性)，连同在敏感度上的中等增加。有意思地， o/c比率能够正确地分类非致畸剂咖啡因和视黄醇以及致畸剂华法林 和D-青霉胺，其中大多数其他模型系统无效。在o/c比率以及啮齿动 物和兔体内模型连同ZET的致畸性预测之间存在一个高一致性程度 (≥75％)(表11)。在o/c比率以及该mEST和WEC之间一致性较 低(分别是67％和69％，表11)。o/c比率和这些体外模型之间的较 低一致性的原因是，归因于该靶向生物标记物测定的高准确性。
表9.靶向生物标记物测定结果与公开的发育毒性测定结果的比 较：训练和测试集。
Figure BDA0000709953210000561
Figure BDA0000709953210000571
mEST，小鼠胚胎干细胞测试；ZET，斑马鱼胚胎毒性测试；WEC，全 胚胎培养；NON，非致畸剂；TER，致畸剂；NA，不可获得。如果存 在冲突的预测，使用来自最近的公开或具有更多一致性的公开的分类。 加粗结果指示与已知人发育毒性影响不同的预测。
a从以下各项总结的人、啮齿动物和兔影响：妊娠与哺乳(Pregnancy andLactation)(布里格斯(Briggs)等人，2011，“药物在孕期和哺乳期” 第9版费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威尔金斯(Wilkins)出 版社)；TERIS和/或ACToR数据库(在万维网actor.epa.gov/actor/faces/ACToRHome.jsp)，除非另外指出。
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表10.靶向生物标记物测定预测的模型度量，与基于常见模型系 统中的处理的其他模型预测进行比较。
Figure BDA0000709953210000591
N，该模型系统和该靶向生物标记物测定之间常见的测定的处理的数 目；TB，使用在该模型系统中评价的处理的靶向生物标记物测定结 果；Acc，模型系统的准确性；TB_Acc，靶向生物标记物测定的准 确性；Sen，模型系统的敏感度；TB_Sen，靶向生物标记物测定的 敏感度；Spec，该模型系统的特异性；TB_Sen，该靶向生物标记物 测定的特异性。
表11.靶向生物标记物测定结果与公开的发育毒性测定结果的比 较：应用集。
mEST，小鼠胚胎干细胞测试；ZET，斑马鱼胚胎毒性测试；WEC， 全胚胎培养；NON，非致畸剂；TER，致畸剂；NA，不可获得。如 果存在冲突的调用，使用来自最近的公开或具有更多一致性的公开的 分类。
a从以下各项总结的人、啮齿动物和兔影响：妊娠与哺乳(Pregnancy andLactation)(布里格斯(Briggs)等人，2011，“药物在孕期和哺乳期” 第9版费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威尔金斯(Wilkins) 出版社)，TERIS和/或ACToR数据库(在万维网actor.epa.gov/actor/faces/ACToRHome.jsp)，除非另外指出。
b使用治疗Cmax，当可如在该方法部分所述的和在图3中说明的获得 时，进行针对该靶向生物标记物测定的预测。然而，在应用该测定中， 未使用这个方法，因为Cmax不可获得。
c根斯乔(Genschow)等人，2004，实验动物替代方案；32:209-244。
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h钱(Chan)和劳(Lau)，2006，生育和不育(Fertil Steril)；86:490-492。 讨论
开发本测定以解决对动物测试更准确、快速和较廉价的替代方案 的需要。我们的目标是为毒理学家提供一个新的和生物学上恰当的工 具，以在当前需要的体内试验之前有助于化合物优先次序，并作为新 兴的多层次的测试策略的部分。未分化的hES细胞代表了用于在开发 的最早期阶段对测试化合物对人细胞的发育毒性作用建模的一个简 单而优雅的测试系统，在一些情况下这也可在后期胎儿发育中针对化 合物的作用引起启示。一种基于hES细胞的发育毒性测试降低了假阴 性的风险，特别归因于在发育途径和药代动力学上的种间差异(斯科 特(Scott)等人，2013，毒理学通讯；219：49-58)。本实例改良了 一种基于非靶向代谢组学的发育毒性测定，以降低复杂性并通过聚焦 于两种生物上相关的代谢物增加通量，该测定可准确地对一个宽范围 的暴露水平下的人有毒响应建模。
这个实例证明，某个程度的代谢扰动可用以预测一种测试化合物 引起发育毒性的可能性。这个实例的测定使用了一种多暴露途径，其 允许在一个大范围的暴露水平下考虑细胞响应。将致畸性阈值应用至 这个途径允许使用在渐增的暴露水平下代谢的改变，以鉴定在何种浓 度代谢以一种指示可能的致畸性的方式变化。此处建立的模型允许将 鸟氨酸和胱氨酸的代谢比率的改变与细胞活力进行比较，以鉴定代谢 的改变很可能导致致畸性的暴露水平并将其关联至细胞死亡。细胞活 力和代谢改变的合并评价也允许这个测定鉴定在何时暴露可导致发 育毒性(归因于细胞死亡或可能的胚胎毒性)。在训练和测试集中使 用在2期设置的致畸性阈值，o/c比率能以合并的89％准确性区分致 畸剂与非致畸剂(表11)。
代谢物的分析在理解毒性机制中是一个关键过程，因为代谢物在 维持体内平衡和信号转导上发挥关键作用。个体代谢物的扰动能够破 坏正常的发育过程。在代谢物丰度上的变化可通过独立于蛋白和转录 物丰度的机制发生，如一种化合物或化合物的酶代谢物的变构相互作 用、翻译后修饰中的缺陷、破坏蛋白-蛋白相互作用和/或变化的转运。 代谢上的改变，如在细胞培养系统中消耗的培养基中测定的，产生可 区分的“代谢足迹”，这是细胞代谢的一个功能性测量，可以用来评价 对处理的响应。含有鸟氨酸和胱氨酸作为反应物或产物的生化途径的 扰动已经在实验上与致畸的机制相关联。细胞外，或由我们的测定测 量的分泌蛋白质组内，胱氨酸支配着半胱氨酸，这归因于培养基的氧 化状态。一旦导入到细胞内环境，胱氨酸被迅速转化为半胱氨酸，并 且是胱氨酸/半胱氨酸硫醇氧化还原对，这是处理反应性氧种类(ROS) 的细胞调控能力的一个关键组成部分。已关于其调节分化、增殖、细 胞凋亡和其他可能导致致畸的细胞事件的能力调查了它的作用(汉 森，2006，出生缺陷研究C今胚胎学(Birth Defects Res C Embryo Today)；78：293-307)。包括医药、农药、和环境污染物的广谱的 致畸剂被怀疑产生ROS或扰乱维持细胞的氧化还原状态的适当平衡 的细胞机制，这可能会导致对发育调控网络的不利影响，作为发育毒 性的一种作用机制(汉森，2006，出生缺陷研究C今胚胎学(Birth Defects Res C Embryo Today)；78：293-307；科瓦契奇(Kovacic)和 索玛纳坦(Somanathan)，2006，出生缺陷研究C今胚胎学(Birth Defects Res C Embryo Today)；78：308-325)。据推测，萨力多胺致畸和其 种类的发育毒性的具体表现形式的一个主要机制与在肢体形成过程 中凋亡途径的ROS相关的上调相关(汉森，2006，出生缺陷研究C 今胚胎学(Birth Defects Res C Embryo Today)；78:293-307)。胱氨 酸在这个测定中的测量提供了对细胞的氧化还原状态的洞察。当胱氨 酸的摄取被干扰时，它可充当一种生物标记物，指示该细胞使用ROS 相关途径信号转导能力的破坏。
在这个测定中的第二代谢物是鸟氨酸，其是通过该hES细胞在培 养过程中分泌的。鸟氨酸作为精氨酸分解代谢成尿素的产物形成，对 氮的排泄是关键的，并且是多胺的前体。鸟氨酸的分解代谢受致畸剂 全反式视黄酸影响，全反式视黄酸是鸟氨酸脱羧酶(ODC)的转录的 抑制物，导致增加的鸟氨酸分泌，继而抑制多胺合成(毛(Mao)等 人，1993，生物化学杂志(Biochem J)；295:641-644)。同样清楚的 是ODC在发育中起着重要作用，因为ODC敲除的小鼠模型导致非常 早的胚胎阶段的破坏，并且对发育中的胚胎是致命的(培格(Pegg)， 2009，IUBMB life；61:880-894)。在鸟氨酸水平上的变化可导致多胺 代谢的破坏，多胺代谢对人发育过程中的细胞生长和分化是关键的 (凯兰(Kalhan)和比尔(Bier)，2008，营养学年度评论(Annu Rev Nutr)；28:389-410)。
在训练集中的23种化合物中仅一种(苯妥英)和在测试集中的 13种化合物的三种(波生坦，拉帕替尼，和洛伐他汀)在该靶向生物 标记物测定被错误分类(表6和8)。这些化合物中所有四种都展现 在指示致畸性的o/c比率上的改变；然而，该致畸性可能浓度高于该 治疗Cmax，其被设置为一种具有针对暴露水平的生物相关性的标记物。 为了发现不具有建立的Cmax值的化合物，可使用在o/c比率上的这些 改变作为关于该化合物的致畸可能性的一种信号。而流行病学研究显 示了苯妥英和出生缺陷之间的关联，还不存在描述在波生坦、拉帕替 尼和洛伐他汀孕期暴露之后的出生缺陷的发生率的此类研究。没有公 开过有关孕期暴露于波生坦或拉帕替尼的婴儿中的出生缺陷的案例 报告，并且只有极少数的报告描述在妊娠早期(TERIS)洛伐他汀暴 露之后的畸形。
体内大鼠发育毒性研究已鉴定了针对在器官发生过程中100 mg/kg体重/天的洛伐他汀观察到的最低不利影响水平(LOAEL)(兰 卡思(Lankas)等人，2004，出生缺陷研究B部分发育和生殖毒理 学(Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol)；71:111-123)。有意思 地，这个暴露水平导致1.5μM左右的Cmax(兰卡思等人，2004，出生 缺陷研究B部分发育和生殖毒理学；71:111-123)，其接近在这个研 究中通过o/c比率鉴定的致畸性可能性(1.3μM，表7，图7A)。当 在器官发生过程中在如下暴露水平体内给予时，拉帕替尼引起大鼠幼崽死亡，该暴露水平约3.3倍于基于AUC的人临床暴露(布里格斯 (Briggs)GG，弗里曼(Freeman)RK，亚夫(Yaffe)SJ，2011，“孕 期和哺乳期药物”第9版，费城：利平科特威廉姆斯(Williams)&威 尔金斯(Wilkins)出版社)。这个暴露水平大约等于如下浓度，在hES 细胞中在此浓度拉帕替尼暴露之后细胞活力降低(图7B)。当前动物 模型用以测量致畸性风险，但仍未知怎样使其结果良好相关于人对个 体化合物的风险。而该测定的主要目标是预测在人中致畸性的可能 性，对于理解与用于监管验收的体内动物模型的一致性也是重要的。这些是在该靶向生物标记物测定产生的数据可怎样关联到体内发育 毒性数据的几个实例。
对于在这个研究中评价的化合物，该靶向生物标记物测定与体内 啮齿动物和兔研究约75％的时间一致(表11)。仍存在显著的机会来 提高对怎样将化合物浓度从体外系统转变为人暴露水平的理解(巴塔 查里亚(Bhattacharya)等人，2011，公共科学图书馆·综合(PLoS One)； 6:e20887)。当与在一种化合物的发现和开发过程中进行的额外测定 合并时，该应用集是用以表明对与一个暴露范围的毒性可能性相交的 测量可怎样将模型响应变为针对整体化合物风险的预测。在这个集中 的10种化合物具有未知人发育毒性结果，就像任何新的化合物一样。 将o/c比率与应用集的化合物可获得的Cmax进行比较，以开始评估针 对每个化合物的致畸性可能性的信号的相关性(补充表1)。该治疗 Cmax是用以理解人遇到的可能的暴露水平。然而，由于这些化合物的 人致畸性是未知的，该Cmax未被用以评估该测定的预测性。该应用集 意在表明该靶向生物标记物测定针对未知化合物的功用，与针对具有 已知人致畸性的化合物的测定性能的评估形成对比(图8)。然后任 何可获得的临床前体内发现被用以开发和理解每个化合物和其风险 可能性。这样一种途径可被用在采用该测定作为一种传统的化合物发 现或临床前发育程序的部分、或作为利用一组基于人细胞的测定的一 种新的范例的部分中，目标在于早期决策制定。
该靶向生物标记物测定的一个显著优点是使用衍生自胚胎的人 细胞，这些细胞能够概括体内每个细胞类型并且在培养中具有不受限 的增殖能力。消除了可在其他体外发育毒性测定中观察到的在发育毒 性上的物种特异性差异的可能性。与ECVAM-评价的mEST对比，此 处呈现的测定不需要将该hES细胞分化为特异性谱系，例如胚胎体或 心肌细胞。分化为特异性谱系可限制一个测定对影响不同的发育谱系 的致畸剂的预测的可能性。此处所述的测定可正确地分类已知影响多 个谱系(包括心血管、神经和骨骼)的化合物(表2和3)。靶向生 物标志物测定提供了分析确定的终点，并且不需要形态学的任何主观 解释，如mEST、植入后大鼠WEC测试和ZET所要求的。对mEST 的最近的修饰已开始通过增加额外的发育终点(即，神经和成骨细胞 分化)，并实施分子终点替代主观评价(在托伊尼森Theunissen和皮 尔斯玛(Piersma)，2012，生物科学前沿(Front Biosci)；17:1965-1975中综述)来解决这些限制。表10呈现了对此处所述的靶向生物标记 物测定与五种其他发育毒性测定的结果的比较，该靶向生物标记物测 定比其他测定具有更高的准确性(表11)。以o/c比率进行的预测的 更高准确性归因于超过其他测定的在特异性上的增加，或对非致畸剂 的检测。重要地是要注意在这些模型系统中每个之间以预测化合物方 式存在不同。包括在表10中的其他测定没有一个基于人暴露水平分 类化合物，而我们的分类系统直接将一种化合物的致畸性可能性与针 对具有已知人发育毒性结果的化合物的已知治疗Cmax进行比较。当进 行预测时，胎儿很可能遇到的一种化合物的实际暴露水平是关键的。 在该靶向生物标记物测定中测试的17种人非致畸剂中的九种在超过 该治疗Cmax的暴露水平处引起o/c比率的改变。据信，在开发过程中 在正确的时间以合适的剂量给予到正确物种中的任何化合物将是致 畸的(达尔斯顿GP和努森TB，2010，“基本概念，当前监管设计和 解释”，于：努森TB，达尔斯顿GP编辑，综合毒理学(Comprehensive Toxicology)，第12卷，第2版，纽约：爱思唯尔，第3-9页)。该 靶向生物标记物测定分离未指示致畸性的暴露水平与指示致畸性的 水平的能力是该测定的一个核心力量。
尽管此处所述的靶向生物标记物测定在预测发育毒性上显示显 著的前景，在其他体外模型的情况下，hES细胞不能完全复制通过外 源化学品贡献于正常人发育的破坏的所有事件。毒性的体外模型不包 括吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的影响，这可能使得很难预测 未知毒性的物质如何在体内起作用。在代谢活化是必需的或为了针对 发育毒性可能性测试母体化合物和任何已知的代谢物两者时，代谢活 性的不存在可以部分地通过加入外源生物活化系统来克服。测试母体 化合物和代谢物两者可以帮助辨别哪种药剂是近因致畸剂，这对准确 预测测试化合物的发育毒性可能性是必不可少的。此外，母胎相互作 用和器官发生不能使用体外模型来建模。然而，使用体外测定的一个 优点是分离归因于化合物的不利结果与归因于来自化合物暴露的母 体毒性的结果的能力。从人类胚胎衍生的细胞中测试的发育毒性很可 能产生比当前可通过使用动物模型、或其他给出hES细胞与人类发育 的生理相关性的体外非人测定获得的终点更可靠的体外预测终点。
这个测定可以帮助减少或消除物种特异性的误解，减少对一个第 二物种的需要，并且可以包括为旨在定义人类群体中可能的不良响应 可能存在的位置的一组体外测定的部分。很像用以理解针对目标器官 毒性的可能性的其他体外培养系统，这个测定可以评估针对发育毒性 的可能性。其强度的部分是与一系列暴露水平相交完成的。虽然没有 确定的方式对项目的安全余量或人响应的基于体外数据的完全预测， 测定(如本文中的这个测定)可以帮助定义可以预期响应的暴露范围 以及不期望发生响应的那些。然后结果可被并入一组测试，这些测试 作为总体开发了临床安全余量的近似值。此信息将有助于推动关于一 种化合物是否应该沿着其发展道路上取得进展的决策。
实例1也已公开为史密斯(Smith)等人，2013，“建立和评估新 的基于人胚胎干细胞的针对发育毒性筛选的生物标志物测定 (Establishment and assessment of a newhuman embryonic stem cell-based biomarker assay for developmental toxicityscreening)，”出生 缺陷研究B部分发育和生殖毒理学；98(4):343-63，将其通过引用以 其全文合并在此。
实例2
ADMA/胱氨酸比率
在本发明的情况下，已经确定从一个小数目的代谢物获得的分析 数据可以充当致畸性的非常精确的预测物。如实施例1中描述的，开 发了一个算法，其在训练集的情况下评价这些分泌特点和培养基组分 的个体预测能力，以鉴定并证实可用于开发更加简化的预测模型的几 个关键特征。选择过程加权特征、整体强度和峰形的预测能力，以鉴 定表现非常好的可以通过靶向LC-MS或甚至其他检测系统进行测量 的特点/代谢物。鉴定在训练集和测试集中可以准确地鉴定至少90％ 的致畸剂和非致畸剂的几对特征和一些个别特征，将其用于devTOX 计算模型的开发。
在这个实例中，由于胱氨酸和非对称二甲基精氨酸(ADMA)的 丰度、理想的峰形、及其展现与计算模型相似的性能量度(表14)， 选择其用于简化的预测模型，其中两者都显示93％准确度。这个简化 模型是基于ADMA和胱氨酸的参照处理(DMSO)标准化值的比率。这个简单的比率能够分化如下致畸剂，所述致畸剂通常展现出相对于 非致畸剂的比率的降低。当跨越训练集的9个独立的重复进行评价时， 它显然能够区分致畸剂与非致畸剂(图9)，使用少于0.9的比率的 一个标准指示致畸性。
图9显示针对每种训练集药剂，ADMA(分泌的代谢物)和胱氨 酸(培养基组分)的参照处理标准化比率的比率。x轴是ADMA/胱氨 酸的参照标准化比率。y轴是药物的训练集。灰色颜色的三角形符号 表示致畸剂，并且黑色颜色的圆形符号表示非致畸剂。每个点符号表示一个独立实验区组的培养基值(6个重复/区组)。十字符号标记该 样本中值。在图9中，灰色垂直线是致畸性的阈值，灰色水平线是中 值绝对偏差，并且黑色垂直线指定1.0。底部的箭头指示用于分化致 畸剂和非致畸剂的值，其中利用0.9的截止(灰色线)。
表12.确认比较和测试集模型预测。
Figure BDA0000709953210000671
Figure BDA0000709953210000681
处理不包括在用星号和斜体标记的训练集中。Ter＝致畸剂，Non＝ 非致畸剂。
实例3
胱硫醚/胱氨酸比率
如在前面实例中所述的程序之后，也确定胱硫醚/半胱氨酸倍数变 化比率的确定还在此处所述的快速致畸性筛选中提供优异的预测性 和一般性能。这示于图10中。在图10中，灰色颜色的三角形符号表 示致畸剂，黑色颜色的圆形符号表示非致畸剂，灰色垂直线是致畸性 的阈值，十字符号标记样本中值，灰色水平线是中值绝对偏差，并且 黑色垂直线指定1.0。
实例4
活力分析
如在细胞培养(分泌蛋白质组)之后在消耗的培养基中测量的细 胞代谢的改变是细胞健康的一个功能性测量。该细胞培养“分泌蛋白质 组”是指在细胞培养之后消耗的培养基或细胞培养上清液中存在的代 谢物。该分泌蛋白质组由培养基组分、跨质膜被动和主动运输的代谢 物、溶胞时细胞内代谢产物释放、以及通过酶的细胞外代谢产生的那 些构成。相对于未处理的培养，通过一种实验药剂引出的该分泌蛋白 质组的改变产生一个代谢特征，可使用该代谢特征来推断一种细胞培 养物内存在的代谢上有生活力细胞的数目。我们已经鉴定了许多分泌 代谢物，这些分泌代谢物可被用于推断有生活力细胞的数目(相对于 在一种参照培养物“对照组”中的细胞数目)。我们将许多分泌代谢物 与使用商业试剂盒进行的活力分析的结果进行比较，并在一种9点浓 度曲线的至少两个最高浓度观察到细胞毒性时，发现这些分泌代谢物 的相对丰度的降低直接与大于0.86(P值<<.001)的皮尔逊相关系数 的细胞活力的测量相关。通过基于LC-MS或试剂盒的检测，这些代 谢物可被用于确定一种细胞培养物内有生活力的细胞的数目而不需 要毁坏或影响这些细胞。这些代谢物可被用作对活力的新的测量，该 测量不需要破坏生长中的细胞。
在此所引用的所有专利、专利申请、和出版物、以及以电子方式 可获得的资料(包括，例如，在(例如)GenBank和RefSeq中的核 酸序列提交，以及在(例如)SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基 酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的转译) 的完整披露内容通过引用结合。所有标题都是为了方便读者，并且不 应用来限制标题后正文的含义，除非这样说明。在本申请的披露内容 与通过引用结合在此的任何文献的一个或多个披露内容之间存在任 何不一致性的情况下，将以本申请的披露内容为准。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本发 明不限于所示和所述的精确细节，因为将在权利要求书定义的本发明 内包含对于本领域技术人员而言显而易见的变体。

Claims (18)

1.一种将测试化合物分类为致畸剂或非致畸剂的方法，该方法包括：
在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细胞（hSLC）；
测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中鸟氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中胱氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定鸟氨酸的倍数改变与胱氨酸的倍数改变的比率，其中：
少于或等于0.88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且
大于0.88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
2.一种预测测试化合物的致畸性的方法，该方法包括：
在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细胞（hSLC）；
测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中鸟氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中胱氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定鸟氨酸的倍数改变与胱氨酸的倍数改变的比率，其中：
少于或等于0.88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且
大于0.88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
3.一种用于将测试化合物确认为致畸剂的方法，该方法包括：
在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细胞（hSLC）；
测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中鸟氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中胱氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定鸟氨酸的倍数改变与胱氨酸的倍数改变的比率，其中：
少于或等于0.88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且
大于0.88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
4.一种用于测定以下暴露浓度的方法，在该暴露浓度下测试化合物是致畸的，该方法包括：
在一系列浓度的该测试化合物中和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细胞（hSLC）；
测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中鸟氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的人干细胞样细胞的培养基中胱氨酸的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞中的情况进行比较；
针对每个浓度的测试化合物，测定鸟氨酸的倍数改变与胱氨酸的倍数改变的比率，其中：
在给定浓度的该测试化合物情况下少于或等于0.88的比率指示了该测试化合物在该给定浓度下的致畸性；并且
在给定浓度的该测试化合物情况下大于0.88的比率指示了该测试化合物在该给定浓度下的非致畸性。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用物理分离方法鉴定该胱氨酸，和/或鸟氨酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中该物理分离方法包括质谱法。
7.如权利要求6所述的方法，其中该质谱法包括液相色谱法/电喷射离子化质谱法。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用比色或免疫学测定测量该胱氨酸，和/或鸟氨酸。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该人干细胞样细胞包括人诱导多能性（iPS）细胞。
10.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在一系列浓度的该测试化合物中培养该人干细胞样细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中该系列浓度包括连续稀释。
12.如权利要求10所述的方法，其中该系列浓度包括九个三倍稀释。
13.如权利要求10所述的方法，其中该系列浓度选自0.04 μM至300 μM、4 μM至30,000μM、和0.0001 μM至10 μM。
14.如权利要求10所述的方法，其中该测试化合物的该系列浓度包括测试化合物的人治疗Cmax。
15.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中人干细胞样细胞在包括该测试化合物的人治疗Cmax的测试化合物浓度下培养。
16.如权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括检测一种或多种与在存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞相关的额外的代谢物，与在不存在该测试化合物的情况下培养的人干细胞样细胞的情况进行比较。
17.如权利要求16所述的方法，其中一种或多种额外的代谢物包括精氨酸、不对称二甲基精氨酸和胱硫醚。
18.如权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括测定精氨酸的倍数改变与不对称二甲基精氨酸的倍数改变的比率，其中：
少于0.9或大于1.1的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且
大于0.9和少于1.1的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
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