CN104819968A - 基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置与方法，包括激发-发射光学结构、激发光源驱动模块、主控模块、结构相同的荧光检测模块与光源参考光检测模块。本发明采用可变光脉冲光源，结合双通道信号检测模块，实现单周转、多周转和弛豫三种光诱导荧光动力学过程的快速准确测量，通过解析荧光动力学曲线获得光合作用的功能吸收截面、最大光化学量子效率、电子传递速率等诸多表征光合作用状态的细节参数。

Description

基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置与方法

技术领域

本发明涉及光合作用检测装置领域，具体是一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置与方法。

背景技术

浮游植物是自然水体初级生产者，其光合组织虽然不到全球总植被生物量的1％，但其生产力约占总植物生产力45％，光合固碳量占全球总固碳量40％^[1]，对维持水体生态系统的正常运转至关重要。近些年随着我国水质富营养化程度加剧，浮游植物过量繁殖，水华和赤潮灾害频发，特别是自20世纪70年代以来，水华和赤潮发生频率以每10年增加3倍的速度不断上升，已经严重危害生态环境，极大地影响了渔业、旅游业、水产养殖业的发展，实时快速监测浮游植物的光合作用状态对预防水华和赤潮灾害至关重要。

传统植物光合作用状态测定方法是通过测量光合作用过程中反应物消耗速率或产物生成速率间接获得，包括光合放氧测定法、CO₂吸收测定法和有机物积累分析法等。然而，这些传统光合速率测定方法大多采用现场采样后离线分析方式，测量周期长、效率低、时效性差且手续繁琐。难以满足水华和赤潮形成过程中浮游植物光合作用实时、快速、高效、准确的监测需求。

叶绿素荧光作为植物光合作用过程探针，与“表观性”的气体交换相比，更具有反映光合作用过程“内在性”的特点，此外，叶绿素荧光分析技术具有灵敏、简便、快捷、无需样品预处理、无污染和无破坏性等特点，是快速无损伤诊断植物光合机构运转状况的先进工具。自1972年Mauzerall等人首次提出光诱导叶绿素荧光动力学研究光合作用能流与过程以来，先后出现多种叶绿素荧光分析技术，包括泵与探针技术(Pump and Probe，P&P)、脉冲振幅调制技术(Pulse AmplitudeModulation，PAM)、高速重复脉冲技术(Fast Repetition Rate，FRR)等。然而，现有荧光技术存在明显不足：①存在多光源，光学结构复杂；②探测灵敏度低；③光合作用能流过程调控不够灵活，光合作用诊断不够全面细致。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置与方法，以解决现有技术存在的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置，其特征在于：包括激发-发射光学结构、激发光源驱动模块、主控模块、结构相同的荧光检测模块与光源参考光检测模块，其中：

所述激发-发射光学结构包括样品池、多个阵列排列的LED芯片构成的激发光源，激发光源设置在样品池正面外，且激发光源光路前端向样品池依次设置有滤光片、石英导光柱，样品池与正面垂直的一侧外依次设置有聚焦透镜、滤光片、干涉滤光片、光电倍增管PMT，激发光源的出射光经过滤光片滤光后被石英导光柱导入样品池，在样品池内激发产生的荧光在90度方向依次通过聚焦透镜、滤光片、干涉滤光片后被光电倍增管接收；

所述激发光源驱动模块包括直接数字式频率合成器DDS、储能单元、大功率MOS管，直接数字式频率合成器DDS输出端通过大功率MOS管与激发-发射光学结构中激发光源连接，储能单元亦与激发光源连接。

所述荧光检测模块与光源参考光检测模块分别包括双通道模拟开关、快速荧光检测通道、锁相荧光检测通道，激发-发射光学结构中光电倍增管通过双通道模拟开关分别与快速荧光检测通道、锁相荧光检测通道连接，快速荧光检测通道包括前置放大电路、高速数/模转换器、FPGA驱动器、快速数据传输接口，前置放大电路输入与双通道模拟开关连接，前置放大电路输出与高速数/模转换器输入连接，高速数据采集电路输出与FPGA驱动器输入连接、FPGA驱动器输出与快速数据传输接口输入连接，快速数据传输接口输出与主控模块的快速数据传输接口连接。锁相荧光检测通道包括输入端放大器、带通滤波器、信号触法器、移相器、乘法器、低通滤波器、输出放大器，PMT产生的荧光信号传输给输入端放大器、输入端放大器输出与带通滤波器输入连接、DDS信号作为参考信号传输给信号触法器、信号触法器输出与移相器输入连接、移相器输出和带通滤波器输出作为乘法器输入、乘法器输出与低通滤波器输入连接、低通滤波器输出与输出放大器输入连接、输出放大器输出与主控模块数/模转换器连接。

所述主控模块由Cortex-M8处理器构建而成，主控模块中Cortex-M8处理器分别与荧光检测模块和光源参考光检测模块中快速数据传输接口输出、锁相检测电路输出连接。

所述检测装置的浮游植物光合作用检测方法，其特征在于：通过设计光源的激发策略，控制激发光的瞬时能量和累积能量，调控浮游植物光合电子传递链的阻塞位置Q_A和Q_B，将光合作用能流过程分为三段：

(1)、光源光强调节至30000μmol/m²/s以上，连续激发，70-120μs内可在阻塞位置Q_A处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧光ST，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动力学曲线，解析获得功能吸收截面σ_PSn、电荷分离效率η、最大光量子效率Δ￠；

(2)、光源设置为10kHz、脉宽5μs、平均光强2000μmol/m²/s的高速光脉冲，打开后重复激发，60-200ms内可在阻塞位置Q_B处形成电子阻塞，产生多周转饱和荧光MT，通过快速荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得阻塞位置Q_A到Q_B的电子转移效率

(3)、饱和荧光后，将光源切换成10kHz、脉宽2μs、平均光强不超过2μmol/m²/s微弱光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同频的弛豫荧光，利用弛豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率 利用反演得到的光合参数，进一步推算出更多光合作用状态的细节参数。

本发明能够快速测量获得浮游植物的功能吸收截面、最大光化学量子效率、电子传递速率等诸多表征光合作用状态的细节参数，能够在自然条件下快速无损伤诊断浮游植物体内光合机构运转状况和生长潜能。

本发明优点为：

(1)、采用可变光脉冲光源，通过设计光源的激发策略(调节脉冲振幅、频率和占空比)，控制激发光的瞬时能量和累积能量，实现单周转、多周转和弛豫三种光诱导模式。方法如下：将光源强度分别设置30000μmol/m²/s、2000μmol/m²/s，分别在光合作用电子传递链的Q_A、Q_B位点处形成阻塞，产生单周转和多周转饱和荧光；饱和荧光后，将光源改为高速重复光脉冲，其光照强度小于2μmol/m2/s(不足以引起光化学反应)，用于示踪阻塞位点累积能量的弛豫过程。

(2)、采用双通道荧光检测电路，一路为快速荧光检测通道，另一为锁相荧光检测通道，可实现不同特征荧光动力学曲线测量。①快速荧光探测通道，通过前置放大，配合高速数据采集，实现单周转和多周转荧光动力学曲线测量；②锁相荧光检测通道，采用快速频率自适应锁相检测电路，检测与激发光源同频的荧光信号，制频带以抑的直流背景和噪声，实现弛豫荧光动力学曲线的高灵敏探测。

(3)、采用板载LED阵列(COB-LED)光源和独特的光学结构设计，克服光源散射光和外界环境光照对荧光探测的干扰，实现浮游植物样品的均匀照射。

附图说明

图1为光合作用能流模型示意图。

图2为本发明装置示意图。

具体实施方式

基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置，包括激发-发射光学结构100、激发光源驱动模块200、主控模块500、结构相同的荧光检测模块300与光源参考光检测模块400，其中：

激发-发射光学结构100包括样品池13、多个阵列排列的LED芯片构成的激发光源10，激发光源10设置在样品池13正面外，且激发光源10光路前端向样品池依次设置有滤光片11、石英导光柱12，样品池13与正面垂直的一侧外依次设置有聚焦透镜15、滤光片16、干涉滤光片17、光电倍增管PMT18，激发光源10的出射光经过滤光片11滤光后被石英导光柱12导入样品池13，在样品池13内激发产生的荧光在90度方向依次通过聚焦透镜15、滤光片16、干涉滤光片17后被光电倍增管18接收；

激发光源驱动模块200包括直接数字式频率合成器DDS20、储能单元21、大功率MOS管22，主控模块两路模/数转换器输出与直接数字式频率合成器DDS20输入连接、直接数字式频率合成器DDS20输出通过大功率MOS管22与激发-发射光学结构100中激发光源10连接，储能单元21亦与激发光源10连接。

荧光检测模块300与光源参考光检测模块400分别包括双通道模拟开关30、快速荧光检测通道31、锁相荧光检测通道32，激发-发射光学结构100中光电倍增管18通过双通道模拟开关30分别与快速荧光检测通道31、锁相荧光检测通道31连接，快速荧光检测通道31包括前置放大电路31a、高速数/模转换器31b、FPGA驱动器31c、快速数据传输接口31d，前置放大电路输入与双通道模拟开关连接，前置放大电路输出与高速数/模转换器输入连接，高速数据采集电路输出与FPGA驱动器输入连接、FPGA驱动器输出与快速数据传输接口输入连接，快速数据传输接口输出与主控模块的快速数据传输接口53连接。锁相荧光检测通道32包括输入端放大器32a、带通滤波器32b、信号触法器32c、移相器32d、乘法器32e、低通滤波器32f、输出放大器32g，PMT产生的荧光信号传输给输入端放大器、输入端放大器输出与带通滤波器输入连接、DDS信号作为参考信号传输给信号触法器、信号触法器输出与移相器输入连接、移相器输出和带通滤波器输出作为乘法器输入、乘法器输出与低通滤波器输入连接、低通滤波器输出与输出放大器输入连接、输出放大器输出与主控模块数/模转换器52连接。

主控模块500由Cortex-M8处理器构建而成，主控模块500中Cortex-M8处理器分别与荧光检测模块和光源参考光检测模块中快速数据传输接口输出、锁相检测电路输出连接。

浮游植物光合作用检测方法，通过设计光源的激发策略，控制激发光的瞬时能量和累积能量，调控浮游植物光合电子传递链的阻塞位置Q_A和Q_B，将光合作用能流过程分为三段：

(1)、光源光强调节至30000μmol/m²/s以上，连续激发，70-120μs内可在阻塞位置Q_A处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧光ST，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动力学曲线，解析获得功能吸收截面σ_PSn、电荷分离效率η、最大光量子效率Δ￠；

(2)、光源设置为10kHz、脉宽5μs、平均光强2000μmol/m²/s的高速光脉冲，打开后重复激发，60-200ms内可在阻塞位置Q_B处形成电子阻塞，产生多周转饱和荧光MT，通过快速荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得阻塞位置Q_A到Q_B的电子转移效率

(3)、饱和荧光后，将光源切换成10kHz、脉宽2μs、平均光强不超过2μmol/m²/s微弱光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同频的弛豫荧光，利用弛豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率 利用反演得到的光合参数，进一步推算出更多光合作用状态的细节参数。

植物光合作用过程是活体细胞对光能吸收、转化和利用的过程。根据图1所示植物光合作用能流过程，植物光合作用状态与光能吸收效率、电荷分离效率以及Q_A、Q_B、PQ、PSI和Fd等主要电子受体间的电子传递速率有关。叶绿素荧光是光合作用研究的探针，能够反映光能吸收、激发能传递、光化学反应、电子传递、质子梯度建立和ATP合成等几乎所有光合作用过程。

本发明专利基于CN201410465026.3专利提出浮游植物光合速率测量方法，设计了如图2所示浮游植物光合作用测量装置。测量装置主要由激发-发射光学结构100、光源驱动模块200、荧光检测模块300、光源参考光检测模块400和主控模块500组成。

(1)激发-发射光学结构

采用板载4行4列16颗LED芯片作为激发光源10，激发光源的中心波长为468nm(可根据浮游植物对吸收特性选择)，前端放置3mm厚的BG39材料滤光片11，滤除荧光波段处光源光，然后通过截面10mm×10mm的石英导光柱12，照射到样品池13，激发产生的荧光在90度方向通过透镜聚焦15，经通过3mm厚HP670材料滤光片16和BP685干涉滤光片17(中心波长685nm，半高宽20nm)，滤去荧光波段以后的干扰光后，由光电倍增管(PMT)18接收、荧光检测模块检测。光源透射光由光电二极管14接收、光源参考光检测模块检测。这样光路设计具有以下优点：①板载LED阵列结合石英导光柱，使激发光能够均匀辐射到样品池内，确保光照辐射内浮游植物细胞受激发能量一致性；②激发-发射端的滤光片系统、90度方向荧光接收能够有效克服光源散射光对荧光探测的干扰。

(2)激发光源驱动模块

激发光源驱动模块由直接数字式频率合成器(DDS)20、储能单元21和大功率MOS管22组成。DDS在主控模块的16位数/模转换器(DAC)控制下产生振幅、频率、脉宽可精确调的可变电脉冲，电脉冲信号控制MOS管驱动激发光源产生可变光脉冲，储能单元为光源提供能量来源，确保能够产生瞬时稳定的强光脉冲。

(3)荧光检测模块

荧光检测模块主要由双通道模拟开关30、快速荧光检测通道31、锁相荧光检测通道32组成，两个检测通道与PMT探测器之间通过模拟开关切换。①快速荧光探测通道，探测器信号通过前置放大，由高速数据采集电路采集(采集速率需达到5Mbps以上)，采集数据通过快速数据传输接口输出至主控模块，该通道可实现1s以内快变荧光过程精确测量；②锁相荧光检测通道，探测器信号和激发光的DDS驱动信号输入通过锁相检测电路，获得与激发光同频率的荧光信号，制频带以抑的直流背景和噪声，输出信号由主控模块模/数转换器(ADC)采集，该通道能够实现特定频率荧光的高灵敏探测。

(4)光源参考光检测模块

光源参考光检测模块检测PIN探测信号，实现激发光源光强探测。该模块与荧光检测模块相同，具有快速检测和锁相检测两个通道。快速检测通道数据通过快速数据传输接口输出给主控，锁相检测通道信号由主控模块ADC采集。

(5)主控模块

主控模块的以Cortex-M8处理器为核心，结合RAM和Flash存储器、触摸液晶显示器及其它外围电路，实现激发光源控制、荧光检测模块数据采集、数据分析与处理、以及整个装置的输入输出控制。

2、光合作用参数测量方法与步骤

该装置采用快速可变光脉冲作为激发光源，通过设计光源的激发策略(调节光脉冲振幅、频率、脉宽和激发时序)，控制激发光的瞬时能量和累积能量，调控浮游植物光合电子传递链的阻塞位置(Q_A、Q_B)，将光合作用能流过程分为三段进行研究：①光源光强调节至30000μmol/m²/s以上，连续激发，70-120μs内可在Q_A处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧光(ST)，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动力学曲线，解析获得功能吸收截面σ_PSn、电荷分离效率η、最大光量子效率Δ￠等光合作用参数；②光源设置为10kHz、脉宽5μs、平均光强2000μmol/m²/s的高速光脉冲，打开后重复激发，60-200ms内可在Q_B处形成电子阻塞，产生多周转饱和荧光(MT)，通过快速荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得Q_A到Q_B电子转移效率③饱和荧光后，迅速将光源切换成10kHz、脉宽2μs、平均光强不超过2μmol/m²/s微弱光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同频的弛豫荧光，利用弛豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率如图2所示。利用反演得到的光合参数，进一步推算出更多光合作用状态的细节参数，包括光化学淬灭qP，非光化学淬灭NPQ，总电子传递速率rETR等。

Claims (2)

1.基于叶绿素荧光的浮游植物光合作用检测装置，其特征在于：包括激发-发射光学结构、激发光源驱动模块、主控模块、结构相同的荧光检测模块与光源参考光检测模块，其中：

所述激发-发射光学结构包括样品池、多个阵列排列的LED芯片构成的激发光源，激发光源设置在样品池正面外，且激发光源光路前端向样品池依次设置有滤光片、石英导光柱，样品池与正面垂直的一侧外依次设置有聚焦透镜、滤光片、干涉滤光片、光电倍增管PMT，激发光源的出射光经过滤光片滤光后被石英导光柱导入样品池，在样品池内激发产生的荧光在90度方向依次通过聚焦透镜、滤光片、干涉滤光片后被光电倍增管接收；

所述激发光源驱动模块包括直接数字式频率合成器DDS、储能单元、大功率MOS管，直接数字式频率合成器DDS输出端通过大功率MOS管与激发-发射光学结构中激发光源连接，储能单元亦与激发光源连接。

所述荧光检测模块与光源参考光检测模块分别包括双通道模拟开关、快速荧光检测通道、锁相荧光检测通道，激发-发射光学结构中光电倍增管通过双通道模拟开关分别与快速荧光检测通道、锁相荧光检测通道连接，快速荧光检测通道包括前置放大电路、高速数/模转换器、FPGA驱动器、快速数据传输接口，前置放大电路输入与双通道模拟开关连接，前置放大电路输出与高速数/模转换器输入连接，高速数据采集电路输出与FPGA驱动器输入连接、FPGA驱动器输出与快速数据传输接口输入连接，快速数据传输接口输出与主控模块的快速数据传输接口连接。锁相荧光检测通道包括输入端放大器、带通滤波器、信号触法器、移相器、乘法器、低通滤波器、输出放大器，PMT产生的荧光信号传输给输入端放大器、输入端放大器输出与带通滤波器输入连接、DDS信号作为参考信号传输给信号触法器、信号触法器输出与移相器输入连接、移相器输出和带通滤波器输出作为乘法器输入、乘法器输出与低通滤波器输入连接、低通滤波器输出与输出放大器输入连接、输出放大器输出与主控模块数/模转换器连接。

所述主控模块由Cortex-M8处理器构建而成，主控模块中Cortex-M8处理器分别与荧光检测模块和光源参考光检测模块中快速数据传输接口输出、锁相检测电路输出连接。

2.基于权利要求1所述检测装置的浮游植物光合作用检测方法，其特征在于：通过设计光源的激发策略，控制激发光的瞬时能量和累积能量，调控浮游植物光合电子传递链的阻塞位置Q_A和Q_B，将光合作用能流过程分为三段：

(1)、光源光强调节至30000μmol/m²/s以上，连续激发，70-120μs内可在阻塞位置Q_A处形成电子阻塞，产生单周转饱和荧光ST，然后通过快速荧光通道测量单周转荧光动力学曲线，解析获得功能吸收截面σ_PSn、电荷分离效率η、最大光量子效率Δφ；

(2)、光源设置为10kHz、脉宽5μs、平均光强2000μmol/m²/s的高速光脉冲，打开后重复激发，60-200ms内可在阻塞位置Q_B处形成电子阻塞，产生多周转饱和荧光MT，通过快速荧光通道检测多周转荧光动力学曲线，解析获得阻塞位置Q_A到Q_B的电子转移效率

(3)、饱和荧光后，将光源切换成10kHz、脉宽2μs、平均光强不超过2μmol/m²/s微弱光脉冲，持续激发，同时切换到高灵敏荧光检测通道，检测与光源同频的弛豫荧光，利用弛豫荧光动力学曲线获得PSI以后的电子传递速率 利用反演得到的光合参数，进一步推算出更多光合作用状态的细节参数。