CN104812892A - 经修饰的人轮状病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容总体上涉及病毒疫苗领域。具体地，本公开内容提供了一种经修饰的Vero适应性人轮状病毒毒株和产生高滴度病毒的培养方法、轮状病毒疫苗、疫苗接种方案以及诊断和预后测定。

Description

经修饰的人轮状病毒及其用途
递交数据
本申请与于2012年8月27日提交的标题为“Modified humanrotaviruses and uses therefor”的澳大利亚临时专利申请No.2012903702相关，并要求其优先权，其全部内容均通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容总体上涉及病毒疫苗领域。具体地，本公开内容提供了一种经修饰的人轮状病毒毒株和产生高滴度病毒的培养方法、轮状病毒疫苗、疫苗接种方案以及诊断和预后测定。
背景技术
本说明书中参考的任何现有技术不是且不应被认为是承认或以任何形式暗示该现有技术形成了任何国家中公知常识的一部分。
作者在本说明书中引用的出版物的目录细节按字母顺序收录在说明书结尾处。
在世界范围内，轮状病毒(RV)是婴幼儿中腹泻相关的发病率和死亡率的主要原因。RV感染每年导致超过500,000人死亡，主要在发展中国家。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)已声明，当务之急是开发安全且有效的疫苗(Bern和Glass(1994)Impact of diarrhealdiseases worldwide In Kapikian AZ(ed)Viral Infections of thegrastrointestinal tract，第2版，New York Marcel Dekker，Inc.：1-26；Jiang等(2002)Clin Infect Dis 34；1351-1361)。
特别地，RV导致急性胃肠炎，这是一种需要婴幼儿住院治疗的疾病。在美国、澳大利亚和日本的研究已证明34％至63％因急性腹泻病而住院治疗的儿童与RV感染相关。据估计，在美国健康保障组织中进行住院治疗的RV胃肠炎的发病率在13至24月龄的儿童中为十万分之222，而在小于1岁的儿童中为十万分之362。在该儿科群体中，RV感染与因急性腹泻而导致的全部住院治疗的63％有关。对美国1973至1983年的死亡率数据的综述表明在小于4岁的儿童中，每年有500例腹泻病导致的死亡，并且在美国，20％至80％因腹泻而导致的过多冬季死亡与RV感染相关。在第三世界国家中，RV还导致相当大比例与腹泻病相关的死亡率。因此，在世界发达区域和发展中区域两者中，有效的RV疫苗对儿童的健康具有重要影响。
RV是未包膜的二十面体病毒，其衣壳由三个病毒蛋白(VP)同心层形成。最内层由60个VP2二聚体以及分别为12个拷贝的VP1(RV聚合酶)和VP3(病毒加帽酶(copping enzyme))形成，所述VP2二聚体围绕由11条双链RNA片段构成的病毒基因组。第二层蛋白质由280个VP6的三聚体形成，其位于VP2的顶部，形成双层颗粒(DLP)。最后，向DLP添加280个糖蛋白VP7的三聚体和60个VP4蛋白的二聚体刺突用以形成代表成熟感染性RV的三层颗粒(TLP)。所述VP7构成RV的最外层。
VP7是一种外衣壳蛋白。VP7是一种糖蛋白并且与VP4和VP6相互作用。另一组蛋白质为“非结构蛋白”(NSP)。例如，已经提出，NSP5与NSP2一起在装配病毒粒质和病毒复制方面具有结构性作用。
Sato等(1981)Arch Virol.69：155-160描述了使用MA104细胞(来自猕猴的胎肾细胞)的滚动培养物成功培养了来自粪便样品的人RV。然而，MA104细胞是相对未被表征的，至少在用于作为产生疫苗之病毒的载体时。需要开发用于在充分表征的细胞系统中培养RV的方案以用于开发RV疫苗。还需所述病毒具有足够的滴度以在对象中产生保护性免疫应答。
发明内容
核苷酸和氨基酸序列通过序列标识号(SEQ ID NO)而被提及。SEQID NO在数值上与序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ IDNO：2)等相对应。序列标识符的总结提供于表1中。序列表提供在权利要求书之后。
提供了Vero细胞中的轮状病毒(RV)培养方法。提及的“Vero细胞”包括Vero细胞来源的细胞系。将RV称为“Vero适应性(Vero-adapted)”RV或“RV3-Vero”或“RV3BB”。所述方法涉及对RV接种物进行胰蛋白酶消化以及在Vero细胞中培养经胰蛋白酶消化的RV。与其他RV生产中使用的方法相比，本胰蛋白酶方法使用高得多浓度的胰蛋白酶来激活病毒以使RV3能够在Vero细胞中生长。提及的“胰蛋白酶消化”指用来自任何来源的胰蛋白酶处理RV，所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、反刍动物(例如牛)胰蛋白酶和重组胰蛋白酶的一种或更多种。一旦适应在连续细胞系中生长，则RV物质经历基因组修饰，所述基因组修饰被方便地鉴定为结构蛋白和非结构蛋白之一或两者(包括VP1、VP3、VP4、NSP4、NSP5/6)中推导的氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中的核苷酸改变。本公开内容还构想导致其他RV蛋白中氨基酸改变或导致RV基因组中核苷酸改变的遗传修饰。已提出，Vero适应性RV可用于开发疫苗。还提出了诊断和预后测定来监测RV感染、疫苗完整性和/或治疗方案或预防方案的有效性。
因此，提供了Vero细胞适应性(“Vero适应性”)RV(也称为RV-Vero或Vero-RV或RV3BB或Vero适应性RV3BB)，与MA104适应性RV中的相应蛋白质相比，其在VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中和/或编码VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6之基因中包含突变。
为了方便起见，参照由Rippinger等(2010)Virology 405(1)：1201-1213公开的MA104适应性RV3序列进行了核苷酸和氨基酸比较。
还构想了在Vero细胞中培养RV的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶使RV的接种物或等分试样被胰蛋白酶消化。然后，在存在Vero细胞的情况下，在足以导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的氨基酸和/或编码VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的基因之一或两者至少一个发生例如当与MA104适应性RV相比改变的遗传修饰的时间和条件下，培养RV。如上所述，胰蛋白酶可来自任何来源，例如猪胰蛋白酶、反刍动物胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。反刍动物胰蛋白酶包括来自牛(bovine)、绵羊(ovine)、山羊(caprine)、长颈鹿、牦牛、骆驼(camelus)、大羊驼(llama)、羚羊或袋鼠(macropod)的胰蛋白酶。在一个实施方案中，胰蛋白酶为猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、绵羊胰蛋白酶、山羊胰蛋白酶、骆驼胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。
在一个实施方案中，氨基酸或核苷酸改变发生在NSP4中选自53、76、85、162和165的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VP1中选自886的密码子、VP3中选自643和785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756的密码子和/或NSP2中选自433的核苷酸、NSP4中选自197、267、294、525和534的核苷酸、NSP5/6中选自158、165和355的核苷酸、VP1中选自2692的核苷酸、VP3中选自343、1366、1744、1976和2402的核苷酸和/或VP4中选自选自136、369、1130、1162、1171、1334和2276的核苷酸。
另一方面涉及一种组合物，其包含Vero适应性RV3BB和一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。认为这样的组合物为活的减毒RV疫苗或灭活RV疫苗。
另一方面涉及Vero-RV(例如Vero-RV3)或其组分在制备用于治疗对象中RV感染或再感染之药物中的用途。
还提供了针对Vero适应性RV的诊断剂，例如抗体。
核苷酸“改变”包括核苷酸替换、添加、缺失或插入。所述改变可导致或可不导致由携带该改变之核苷酸序列编码的蛋白质中发生相应氨基酸改变。这些核苷酸或氨基酸改变还可用于诊断目的，以监测尤其是病毒感染、载量、治疗效力和进化或适应性。对Vero适应性RV3和MA104适应性RV3之间的氨基酸序列差异和核苷酸序列差异的总结示于表2和表5中。
表1
序列标识符总结
表2
MA104适应性RV3和Vero适应性RV31之间差异的总结
1核苷酸编号或氨基酸残基编号基于Rippinger等，2010(同上)采用的编号方式。
附图说明
图1是MA104适应性RV3 NSP1基因的核苷酸序列的图示。
图2是MA 104适应性RV3 NSP1蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图3是Vero适应性RV3 NSP1基因的核苷酸序列的图示。
图4是Vero适应性NSP1蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图5是对MA104适应性RV3 NSP1基因和Vero适应性RV3 NSP1基因之核苷酸序列的比较的图示。
图6是对MA104适应性RV3 NSP1蛋白和Vero适应性RV3 NSP1蛋白之推导的氨基酸序列的比较的图示。
图7是MA104适应性RV3 NSP2基因的核苷酸序列的图示。
图8是MA104适应性RV3 NSP2蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图9是Vero适应性RV3 NSP2基因的核苷酸序列的图示。
图10是Vero适应性RV3 NSP2蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图11是对MA104适应性RV3 NSP2基因和Vero适应性RV3 NSP2基因之核苷酸序列的比较的图示。
图12是对MA104适应性RV3 NSP2蛋白和Vero适应性RV3 NSP2蛋白之推导的氨基酸序列的比较的图示。
图13是MA104适应性RV3 NSP3基因的核苷酸序列的图示。
图14是MA104适应性RV3 NSP3蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图15是Vero适应性RV3 NSP3基因的核苷酸序列的图示。
图16是Vero适应性RV3 NSP3蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图17是对MA104适应性RV3 NSP3基因和Vero适应性RV3 NSP3基因之核苷酸序列的比较的图示。
图18是对MA104适应性RV3 NSP2蛋白和Vero适应性RV3 NSP2蛋白之推导的氨基酸序列的比较的图示。
图19是MA104适应性RV3 NSP4基因的核苷酸序列的图示。
图20是MA104适应性RV3 NSP4蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图21是Vero适应性RV3 NSP4基因的核苷酸序列的图示。
图22是Vero适应性RV3 NSP4蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图23是对MA104适应性RV3 NSP4基因和Vero来源的RV3 NSP4基因之核苷酸序列的比较的图示。
图24是对MA104适应性RV3 NSP4蛋白和Vero适应性RV3 NSP4蛋白之推导的氨基酸序列的比较的图示。
图25是MA104适应性RV3 NSP5/6基因的核苷酸序列的图示。
图25是MA104适应性RV3 NSP5/6蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图27是Vero适应性RV3 NSP5/6基因的核苷酸序列的图示。
图28是Vero适应性RV3 NSP5/6蛋白之推导的氨基酸序列的图示。
图29是对MA104适应性RV3 NSP5/6基因和Vero适应性RV3NSP5/6基因之核苷酸序列的比较的图示。
图30是对MA104适应性RV3 NSP5/6蛋白和Vero适应性RV3NSP5/6蛋白之推导的氨基酸序列的比较的图示。
图31是MA104适应性RV3 VP1基因的核苷酸序列的图示。
图32是MA104适应性RV3 VP1探针的氨基酸序列的图示。
图33是Vero适应性RV3 VP1基因的核苷酸序列的图示。
图34是Vero适应性RV3 VP1蛋白的核苷酸序列的图示。
图35是对MA104适应性RV3 VP1基因和Vero适应性RV3 VP1基因的比较的图示。
图36是对MA104适应性RV3 VP1蛋白和Vero适应性RV3 VP1蛋白的比较的图示。
图37是MA104适应性RV3 VP2基因的核苷酸序列的图示。
图38是MA104适应性RV3 VP2探针的氨基酸序列的图示。
图39是Vero适应性RV3 VP2基因的核苷酸序列的图示。
图40是Vero适应性RV3 VP2蛋白的核苷酸序列的图示。
图41是对MA104适应性RV3 VP2基因和Vero适应性RV3 VP2基因的比较的图示。
图42是对MA104适应性RV3 VP2蛋白和Vero适应性RV3 VP2蛋白的比较的图示。
发明详述
贯穿本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”或变化形式应被理解为指包括所述要素或整数或方法步骤或者要素或整数或方法步骤的组，但不排除任何要素或整数或方法步骤或者要素或整数或方法步骤的组。
必须指出，除非上下文另有明确说明，否则本说明书中使用的没有数量词修饰的名词包括复数方面。因此，例如，提及的“轮状病毒”包括单一轮状病毒以及两种或更多种轮状病毒；提及的“试剂”包括单一试剂以及两种或更多种试剂；提及的“本公开内容”包括本公开内容教导的单个方面和多个方面等。术语“本发明”涵盖本文中教导和能够实现的方面。所有的这些方面均能够在本发明的宽度内实现。
构想了一种用于培养RV毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6至少之一中的氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6至少之一中的核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV。
提及的“改变”包括氨基酸或核苷酸替换、缺失、添加或插入。提及的“胰蛋白酶消化”指用胰蛋白酶处理RV。胰蛋白酶可来自任何来源，并且包括猪胰蛋白酶、反刍动物胰蛋白酶和重组胰蛋白酶。反刍动物胰蛋白酶可来自牛(即牛科动物)、绵羊(ovine)、山羊(caprine)、长颈鹿、牦牛、骆驼(camelus)、大羊驼、羚羊或袋鼠(macropod)。在一个实施方案中，胰蛋白酶为猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、绵羊胰蛋白酶、山羊胰蛋白酶、骆驼胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。在一个实施方案中，胰蛋白酶为猪胰蛋白酶。在一个实施方案中，胰蛋白酶为牛胰蛋白酶。在一个实施方案中，胰蛋白酶为猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。在一个实施方案中，胰蛋白酶为重组胰蛋白酶。“重组胰蛋白酶”为通过在任何细胞类型(例如细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达经改造的遗传物质而产生的任何来源的胰蛋白酶。
在一个实施方案中，RV毒株为RV3。将产生的RV方便地称为“Vero细胞适应性RV”或“Vero适应性RV”或“Vero-RV”或“RV-Vero”或RV3BB。在另一方面，收获经修饰的Vero-RV，例如以用于疫苗或用于产生抗体。
因此，构想了一种用于培养RV3毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV3活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV3的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV，随后，任选收获经修饰的RV3。
本文实现了一种构想用于培养RV3毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV3活化方案更高浓度的猪胰蛋白酶、反刍动物胰蛋白酶或重组胰蛋白酶对RV3的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV，随后，任选地收获经修饰的RV3。
本文实现了一种构想用于培养RV3毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV3活化方案更高浓度的猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶或重组胰蛋白酶对RV3的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV，随后，任选地收获经修饰的RV3。
在一个实施方案中，RV为R电泳型(electropherotype)，例如RV1、RV2或RV3。更具体地，毒株为RV3。在另一实施方案中，RV为M-电泳型(例如RV5)或PA电泳型(例如RV6)(参见Rodger等(1981)J.Clin.Microbiol 13：272-278；Albert等(1983)J.Clin.Microbiol 17：162-164)。
因此，本文描述了一种用于在Vero细胞中培养RV毒株(特别是RV3BB)至高滴度的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV，随后，任选地收获经修饰的RV。
本文所述的培养方案能够产生活的减毒RV或者可被杀死或通过其他方式被灭活的RV制备物而用作疫苗或开发针对其的抗体或其他诊断剂。
因此，提供了一种用于产生活的减毒RV的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV的减毒毒株的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV。
在一个替代实施方案中，按照上文所述培养并收获RV，然后将其杀死，由此产生用于灭活RV疫苗的灭活RV制备物。
提及的“遗传修饰”包括单个或多个核苷酸替换、添加、缺失和/或插入。在一个具体实施方案中，遗传修饰导致经编码蛋白质(如NSP4、NSP5或VP7)中的氨基酸改变(即替换、添加、缺失或插入)。在另一实施方案中，该修饰导致编码VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的基因发生核苷酸替换、添加、缺失和/或插入。在另一实施方案中，该修饰导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中的氨基酸改变。
将对RV进行的遗传修饰方便地与MA104细胞中培养的RV(即MA104适应性RV)进行比较。这种在MA104细胞中培养的RV不适合用于产生疫苗，原因是MA104细胞尚未完全取得资格，目前，其潜在的致肿瘤性尚未确定。
构想了一种用于培养RV毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中氨基酸修饰和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV。
本文还描述了一种用于培养选自RV1、RV2、RV3、RV5和RV6之列表的RV毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生RV3(或其在RV1、RV2、RV5或RV6中的等同物)中VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中氨基酸修饰和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV，随后任选地收获经修饰的RV。
关于一个实施方案，构想了一种用于培养RV3毒株的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV3的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV3发生VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中核苷酸改变的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV3。
收获的RV可用于制备活的减毒RV组合物，包括疫苗组合物。或者，将收获的RV杀死并以灭活RV组合物使用。
因此，提供了一种用于产生活的减毒RV的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV之减毒毒株的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化，然后，在足以使RV发生VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中核苷酸改变的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养经胰蛋白酶消化的RV。
在一个实施方案中，RV为RV3(也称为RV3BB)，并且所述遗传修饰为表2或表5中列出的那些。本公开内容构想了表2或表5中列出的一个或所有突变。
因此，提供了一种用于在Vero细胞中培养RV的方法，所述方法包括使用相对于其他RV活化方案更高浓度的胰蛋白酶对RV进行胰蛋白酶消化，然后，在足以在选自表2或表5中列出的突变之列表的位点处发生遗传修饰的时间和条件下，用Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系培养经胰蛋白酶消化的RV。
提及的“等效物”包括另一RV3毒株或另一RV中的对应核苷酸或氨基酸。
还描述了一种分离的Vero适应性RV，其包含对选自VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6之列表的基因或蛋白质的遗传修饰，所述突变选自表2或表5中的那些。
本文构想了一种用于在Vero细胞中产生减毒RV3方法，所述方法包括使减毒RV3的等分试样或接种物被胰蛋白酶消化，并在足以在选自表2或表5中所示列表的基因中发生相比较于MA104适应性RV3的遗传修饰的时间和条件下，用Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系培养经胰蛋白酶消化的RV3。
使用表3中限定的单一氨基酸代码对上述突变进行描述。
表3
缩写
本公开内容涉及一种用于在Vero细胞中产生减毒RV3的方法，所述方法包括使减毒RV3的等分试样或接种物被胰蛋白酶消化并在足以发生选自包含以下核苷酸替换、缺失和/或添加之列表的遗传修饰的时间和条件下用Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系培养经胰蛋白酶消化的RV3：在NSP4中选自53、76、85、162和165的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VP1中选自886的密码子、VP3中选自643和785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756的密码子和/或NSP2中选自433的核苷酸、NSP4中选自197、267、294、525和534的核苷酸、NSP5/6中选自158、165和355的核苷酸、VP1中选自2692的核苷酸、VP3中选自343、1366、1744、1976和2402的核苷酸和/或VP4中选自136、369、1130、1162、1171、1334和2276的核苷酸处的核苷酸替换、缺失和/或添加。
Vero适应性RV(特别是Vero适应性RV3)的产生使其能够用作减毒活RV疫苗。或者，可将在Vero细胞中产生的RV杀死并用作灭活RV疫苗。
因此，本文中教导的是一种减毒活RV组合物或灭活RV组合物，其包含在VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6中具有一个或更多个突变的RV，所述组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
在一个实施方案中，实现了一种包含减毒或灭活的Vero适应性RV的组合物，所述RV具有选自以下的遗传修饰：相比较于MA104适应性RV3，在NSP4中选自53、76、85、162和165的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VP1中选自886的密码子、VP3中选自643和785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756的密码子和/或NSP2中选自433的核苷酸、NSP4中选自197、267、294、525和534的核苷酸、NSP5/6中选自158、165和355的核苷酸、VP1中选自2692的核苷酸、VP3中选自343、1366、1744、1976和2402的核苷酸和/或VP4中选自136、369、1130、1162、1171、1334和2276的核苷酸中的一个或更多个突变，所述组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
提供了一种包含活的减毒RV3或灭活RV3的组合物，相比较于MA104适应性RV3，所述RV3包含选自表2或表5中列表的一个或更多个突变。
在一个实施方案中，所述RV包含表2或表5中列出的一个或更多个突变，包括1至38个突变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个突变。
方便地，根据世界卫生组织(WHO)标准进行所述组合物的制备。一般地，在三月龄前和出生后一旦可行时经口给予所述组合物。还可将所述组合物称为疫苗、制剂、药物及其他类似术语。
所述疫苗的期望免疫或生理作用是抑制RV感染、预防RV再感染、从靶对象纯化(clarification)RV或通过其他方式改善RV感染的症状，例如急性腹泻和/或体液损失(包括脱水)。特别地，所述效应包括产生免疫应答，特别是针对RV或RV组分(例如蛋白质、碳水化合物或脂质)的体液免疫应答。
所述疫苗还可包含两种或更多种不同的RV毒株或两种或更多种其抗原性或免疫原性组分。“组合”还包括多部分组合物，例如两部分组合物，其中病毒剂单独提供并且单独给予或分配，或者在分配前将其混合在一起。例如，多部分药物包装可具有两种或更多种单独保持的活的减毒RV剂或灭活RV剂或其组分。
可将本文所述的病毒剂保持在称为疫苗、制剂、药物或组合物的状态或者它们可以是经干燥、经冻干、经冷冻或脱水形式以及在使用之前重构成制剂。术语“疫苗”不应被认为是将所述制剂局限于诱导免疫应答的药剂，因为所述制剂可包含RV特异性抗体。
本文实现了一种用于针对RV感染给人对象接种疫苗的方法，所述方法包括在足以产生针对RV感染之免疫应答的时间和条件下，向所述对象施用有效量的减毒活Vero适应性RV3或灭活Vero适应性RV3。
特别地，所述免疫应答为保护性免疫应答。所述免疫应答可用在非减毒(毒性)RV毒株感染或再感染之前、期间或之后。
本公开内容教导了一种用于治疗患有RV感染或具有发生RV感染或再感染风险的人对象的方法，所述方法包括在足以产生针对RV感染之免疫应答的时间和条件下，向所述对象施用有效量的减毒活Vero适应性RV3或灭活Vero适应性RV3。这样的方法包括治疗患有由RV导致的腹泻的人对象。
“有效量”包括“治疗有效量”。
本文使用的疫苗或药剂之中的术语“有效量”和“治疗有效量”指足以提供降低RV感染或产生RV特异性抗体的期望治疗或生理效果或结果的药剂(例如减毒活RV或灭活RV)之量。不期望的效果(例如副作用)有时随期望治疗效果显现，因此，执业医生在确定何为合适的“有效量”时要平衡潜在的益处与潜在的风险。所需精确量将随对象不同而有所不同，取决于对象的年龄和一般状况、施用方式等。因此，不可能规定精确的“有效量”。然而，本领域技术人员仅使用常规实验即可确定在任何个体病例中合适的“有效量”。
因此，本文所用的“有效量”指在根据合适的给药方案施用时提供如下期望效果的病毒剂或其组分的量：降低RV感染、改善RV感染的症状和/或产生RV特异性抗体。给药可间隔数分钟、数小时、数日、数周或数月发生。合适的剂量和方案可通过主治医生或其他护理提供者确定。例如，活的减毒RV的施用包括105至108ffu/ml，例如105、106、107和108ffu/ml。
“可药用”载体、赋形剂或稀释剂指由不是生物学上或其他方面不期望的物质构成的药物载剂，即所述物质可随所选病毒剂或其组分向对象施用而不导致任何或显著的不良反应。载体可包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂、去污剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
本文使用的术语“治疗”指降低RV感染症状的严重程度和/或频率、消除RV感染的症状、防止RV感染症状发生和改善或补救或减轻RV感染后的症状。症状包括急性或慢性腹泻、体液损失和/或发烧。
对对象“治疗”可涉及预防RV感染以及通过减轻该病症的症状来治疗临床上有症状的个体。还构想了治疗有症状的对象。术语“治疗”还适用于预防和诱导针对RV的免疫记忆。可直接治疗人对象或者可通过将期望的免疫应答传递至未出生的婴儿来治疗怀孕母亲。
本文使用的“对象”一般指可从本文所述的药物制剂和方法受益的人。尤其可将对象称为个体、患者、宿主或接受者。
人对象可为任意年龄。具体易感人类的实例包括0至5岁和超过50岁，例如51至60岁、61至70岁、71至80岁、81至90岁以及超过91岁。如21至50岁的人一样，6至10岁、11至15岁和16至20岁的儿童也在构想之内。
实验性疫苗接种或抗体产生还可在实验室测试动物内。实验室测试动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、类人猿动物、豚鼠、仓鼠和灵长类动物，例如猩猩(orangutangs)、大猩猩、狨猴和猕猴。兔、啮齿动物和类人猿动物提供了特别方便的测试系统或动物模型。
本文实现的组合物包括适用于经口施用且可作为如下存在的那些：分散单位，例如各自包含预定量所述RV和/或其组分的液体剂、胶囊剂、小药囊或片剂；散剂或颗粒剂；水相或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或水包油液态乳剂或油包水乳剂。活性成分还可作为大丸剂、干药糖剂或糊剂存在。
还可将所述组合物称为抗原性组合物。
对于用作疫苗的抗原性组合物，所述组合物必须诱导针对病毒或其组分的免疫应答。本文使用的“抗原性组合物”可包含抗原(例如VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6)、编码抗原的核酸(例如抗原表达载体)或者表达或呈递抗原的细胞或者活的减毒病毒或灭活病毒。在另一实施方案中，所述组合物在包含RV和额外的免疫刺激剂或编码所述试剂的核酸的混合物中。免疫刺激剂包括但不局限于额外的抗原或病毒毒株、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。
在一个实施方案中，所述组合物或免疫功能等效物用作诱导人对象中针对RV之体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答的有效疫苗。用于主动和被动免疫接种实施方案两者中的一种或更多种抗原性组合物或疫苗也在本文构想之内。
疫苗可在其组成方面有所不同。当然，应当理解的是，本文所述的不同组合物还可包含多种组分。例如，疫苗可包含一种或更多种佐剂。根据本公开内容，疫苗可通过本领域技术人员已知的任意方法制备和/或施用。
构想的是，疫苗中可包含免疫调节剂以增强细胞或患者应答。免疫调节剂可作为经纯化的蛋白质、编码免疫调节剂的核酸和/或表达免疫调节剂的细胞包含在疫苗组合物中。本文所构想的疫苗调节剂的非限制性实例包括白细胞介素(L)、细胞因子、编码白细胞介素或细胞因子的核酸和/或表达这些化合物的细胞。白细胞介素和细胞因子包括但不局限于iIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-18、β-干扰素、α-干扰素、γ-干扰素、血管增生抑制素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、METH-1、METH-2、肿瘤坏死因子、TGFβ、LT及其组合。
还可使用趋化因子、编码趋化因子的核酸和/或表达其的细胞作为疫苗组分。趋化因子一般用作将免疫效应细胞募集到趋化因子表达位点的化学引诱剂。可有利的是将特定趋化因子编码序列与例如细胞因子编码序列组合表达以增强其他免疫系统组分向治疗部位的募集。这些趋化因子包括，例如，RANTES、MCAF、MIP1-α、MIPl-β、IP-10及其组合。本领域技术人员将认识到，还已知某些细胞因子具有化学引诱剂作用，因此也可将其归类在术语趋化因子之下。
理想的是共施用已显示出上调T细胞免疫或下调抑制细胞活性的生物应答调节剂(BRM)。这样的BRM包括但不局限于西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)、低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)或编码涉及一种或更多种免疫辅助功能之蛋白质(例如B-7)的基因。
本文构想的免疫接种方案包括使用佐剂刺激应答的那些。一些佐剂影响呈递抗原的方式。
在某些实施方案中，佐剂作用通过使用试剂(例如以磷酸盐缓冲盐水中的约0.05％至约0.1％w/v溶液使用的明矾)来实现。或者，将抗原制备成与糖类的合成聚合物(Carbopol[注册商标])混合的约0.25％w/v溶液。
例如，一些佐剂为从细菌获得的作用于宿主而非抗原的某些有机分子。一个实例为胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺[MDP])，一种细菌肽聚糖。与大多数佐剂一样，MDP的作用尚未完全了解。MDP刺激巨噬细胞，但是似乎也直接刺激B细胞。因此，佐剂的作用不是抗原特异性的。然而，如果佐剂与经纯化的抗原一起施用，则其可用于选择性地促进针对所述抗原的应答。
还可使用多种多糖佐剂。例如，可使用肺炎球菌多糖佐剂。应按照说明采用产生最佳应答或以其他方式不产生抑制的剂量。特别优选多糖的多种聚胺，例如甲壳质和壳聚糖，包括去乙酰化甲壳质。
另一组佐剂为细菌肽聚糖的胞壁酰二肽(MDP，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺)组。还构想了胞壁酰二肽的衍生物，例如氨基酸衍生物苏氨酰-MDP和脂肪酸衍生物MTPPE。
构想用于本公开内容中的另一种佐剂为BCG。在本公开内容中，BCG(卡介苗，分枝杆菌(Mycobacterium)的一种减毒菌株)和BCG-细胞壁骨架(CWS)还可与或不与海藻糖双霉菌酸酯一起用作佐剂。海藻糖双霉菌酸酯本身可使用。已显示，海藻糖双霉菌酸酯施用与增强小鼠对流感病毒感染的抗性有关。可按照美国专利No.4,579,945中所述制备海藻糖双霉菌酸酯。
由于其免疫刺激特性，BCG是一种重要的临床工具。BCG用于刺激网状-内皮系统、活化自然杀伤细胞并增加造血干细胞的增殖。已证实，BCG的细胞壁提取物具有优异的免疫佐剂活性。用于分枝杆菌的分子遗传工具和方法已提供了将外源基因导入BCG的手段。
另一方面涉及Vero-RV(例如Vero-RV3或其组分)在制备用于治疗对象中RV感染/再感染之药物中的用途。
本文还构想了针对Vero-适应性RV试剂的抗体。
“抗体”指能够与抗原结合、相互作用或以其他方式缔合的免疫球蛋白家族的蛋白质(即RV试剂或其组分)。因此，抗体为抗原结合分子。“抗体”是免疫相互作用分子的一个实例，并且包括多克隆抗体或单克隆抗体。特定的免疫相互作用分子为用于诊断或纯化方法中的单克隆抗体或在人对象中诱导时的多克隆抗体。术语“抗体”还包括经改造的抗体，例如针对两种不同RV抗原(例如VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6)的双特异性抗体。
术语“抗原”在本文中以其最广泛的含义使用，指能够在免疫应答中反应和/或诱导免疫应答的物质。提及的“抗原”包括全病毒或其组分。
可使用例如和Milstein(Kohler等(1975)Nature 256：495-499和Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6(7)：511-519；Coligan等(1991-1997)Current Protocols in Immunology或Toyama等(1987)Monoclonal Antibody，Experiment Manual，Kodansha Scientific出版)所述的标准方案进行免疫接种以及随后单克隆抗体的产生。基本上，通过生产产生抗体的细胞，特别是产生抗体的体细胞(例如B淋巴细胞)的标准方法用Vero适应性RV或其免疫原性片段免疫动物。然后，可从经免疫的动物中移出这些细胞以用于无限增殖化。抗原可能需要首先与载体缔合。
“载体”指与非免疫原性或低免疫原性物质(例如半抗原)天然或人工相连以增强其免疫原性的一般具有高分子量的任何物质。
可利用本领域中公知的方法进行抗体产生细胞的无限增殖化。例如，无限增殖化可通过使用Epstein-Barr病毒(EBV)的转化方法[Kozbor等(1986)Methods in Enzymolog 121：140]来实现。在一个实施方案中，使用被广泛用于产生单克隆抗体的细胞融合方法(Coligan等(1991-1997)中所述，同上)使抗体产生细胞无限增殖化。在该方法中，将具有产生抗体潜力的抗体产生体细胞(特别是B细胞)与骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可源自于致敏动物(优选啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的淋巴结、脾和外周血。在示例性实施方案中，使用小鼠脾细胞。不过，可使用大鼠细胞、兔细胞、绵羊细胞或山羊细胞或者来自其他动物物种的细胞替代。
已从淋巴细胞瘤中开发出用于产生杂交瘤之融合方法的特化骨髓瘤细胞系(Kohler等(1976)同上；Kozbor等(1986)同上；以及Volk等(1982)J.Virol.42(1)：220-227)。开发这些细胞系至少由于三个原因。第一是有利于从未融合的和类似的无限自身增殖的骨髓瘤细胞中筛选融合的杂交瘤。通常，这通过使用具有酶缺陷的骨髓瘤来实现，所述酶缺陷使骨髓瘤不能够在支持杂交瘤生长的特定选择性培养基中生长。第二个原因归因于淋巴细胞瘤细胞产生其自身抗体的固有能力。使用不能够产生内源性免疫球蛋白轻链或重链的骨髓瘤细胞系来消除杂交瘤产生肿瘤细胞抗体。筛选这些细胞系的第三个原因归因于其对融合的适合性和效率。
很多骨髓瘤细胞系可用于产生融合的细胞杂合体，包括，例如P3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-Ag14和S194/5.XXO.Bu.1。和Milstein(Kohler等(1976)同上)已对P3X63-Ag8和NS-1细胞系进行了描述。Shulman等(1978)Nature276：269-270开发了Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。Trowbridge(1982)J.Exp.Med.148(1)：220-227对S194/5.XXO.Bu.1系进行了报道。
用于产生抗体产生性脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞之杂合体的方法通常包括分别在存在促进细胞膜融合的一种或多种物质(化学的、病毒或电)的情况下，将体细胞与骨髓瘤细胞以10∶1的比例(但是该比例可为约20∶1至约1∶1不等)混合。已对融合方法进行了描述(Kohler等(1975)同上；Kohler等(1976)同上；Gefter等(1977)Somatic Cell Genet.3：231-236；以及Volk等(1982)同上)。那些研究人员使用的融合促进剂为Sendai病毒和聚乙二醇(PEG)。
由于融合方法以非常低的频率产生存活的杂合体(例如，当使用脾作为体细胞来源时，约每1x105个脾细胞仅获得1个杂合体)，因此，具有从剩余的未融合细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞)筛选融合的细胞杂合体的手段是有用的。在其他得到的融合细胞杂合体中检测期望的抗体产生性杂交瘤的手段也是必需的。一般地，融合细胞杂合体的筛选通过在支持杂交瘤生长但防止未融合骨髓瘤细胞生长的培养基中培养细胞实现，所述未融合骨髓瘤细胞通常会继续无限分裂。融合中使用的体细胞在体外培养中不会维持长期的生存力，因而不构成问题。
选择性培养融合的细胞杂合体需要数周。在该时间段早期，需要鉴定产生期望抗体的那些杂合体，使得随后可对其进行克隆和增殖。一般情况下，约10％获得的杂合体产生期望抗体，但是约1％至约30％的范围也是常见的。抗体产生杂合体的检测可通过数种标准测定方法中的任意一种实现，包括如例如美国专利No.6,056,957中所述的酶联免疫测定技术和放射免疫测定技术。
一旦筛选出期望的融合细胞杂合体并将其克隆到单个抗体产生细胞系中，可通过两种标准方式中的任一种增殖每个细胞系。可将杂交瘤细胞的混悬液注射到组织相容性动物中。然后，经注射的动物将生长出分泌由融合细胞杂合体产生之特异性单克隆抗体的肿瘤。可抽吸动物的体液，例如血清或腹水以提供高浓度的单克隆抗体。或者，可在实验室培养容器中体外增殖单个细胞系。可通过倾析、过滤或离心收获包含高浓度单一特异性单克隆抗体的培养基，并随后对其进行纯化。
通过任意合适的免疫检测手段测试细胞系之检测目的病毒或病毒抗原的特异性。例如，可将细胞系等分到多个孔中、孵育，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、间接荧光抗体技术等分析每个孔中的上清液。鉴定产生能够识别靶抗原而不识别非靶表位的单克隆抗体的细胞系，然后直接在体外培养或者将其注射到组织相容性动物中以形成肿瘤，并产生、收集和纯化所需抗体。
因此，提供了用于诊断或预后或者在治疗上用于降低RV感染、维持或组装的多克隆抗体和单克隆抗体，这些抗体与Vero适应性RV(例如Vero适应性RV3或其组分)特异性相互作用。
本公开内容的范围内包括针对上述提及一抗的任何二抗(单克隆、多克隆抗体或抗体片段或合成抗体)。一抗和二抗两者均可用于检测测定或者一抗可与市售的抗免疫球蛋白抗体一起使用。因此，本文提供了监测RV感染、再感染、感染史、疫苗完整性并监测治疗干预的诊断和预后测定。
在免疫测定中特别优选使用单克隆抗体，这是因为能够大量产生单克隆单体以及产物的同质性。可通过本领域技术人员公知的技术，通过将无限增殖细胞系与对免疫原性制备物敏化的淋巴细胞融合来进行用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备。
因此，另一方面提供了一种用于检测来自对象的生物样品中Vero适应性RV(例如RV3-Vero或其组分)的方法，所述方法包括在足以形成抗体-多肽复合物的时间和条件下使生物样品与对RV或其组分或其衍生物或其同源物具有特异性的抗体接触，然后检测所述复合物。
生物样品包括粪便样品。
因此，可以以多种方式，例如通过Western印迹、ELISA方法和RIP检测Vero适应性RV或其抗体的存在。如通过参考美国专利No.4,016,043、4,424,279和4,018,653领会的，可利用多种免疫测定技术。
夹心测定(Sandwich assay)属于最有用且最常用的测定法，并且适合于在本公开内容中使用。存在多种夹心测定技术的变化形式，并且所有变化形式均旨在涵盖在本公开内容内。简言之，在典型的正向测定中，将未标记的抗体固定在固体基底上，并将待测试RV或RV抗原(所述“抗原”)的样品与结合分子接触。在孵育适当的时间段(即足以允许形成抗体-抗原复合物的时间段)后，然后添加对抗原具有特异性之经能够产生可检测信号的报道分子标记的二抗并温育，允许足以形成抗体-抗原-经标记抗体的另一种复合物的时间。洗掉任何未反应的物质，并通过观察报道分子产生的信号确定抗原的存在。结果可通过简单观察可见信号而定性，或者可通过与包含已知量半抗原的对照样品进行比较而定量。正向测定的变化形式包括同步测定，其中向结合抗体同时添加样品和经标记抗体两者。这些技术是本领域技术人员公知的，包括明显容易进行的任何微小改变。根据本公开内容，所述样品为可包含Vero适应性RV或其抗体的样品，包括组织活检样品、粪便样品、血液、滑液和/或淋巴液。因此，所述样品一般为包含生物液体的生物样品。
在典型的正向夹心测定中，使对RV或其抗原性部分具有特异性的一抗与固体表面共价或被动结合。所述固体表面一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物为纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物的形式可以是管、珠子、圆盘状微孔板或适用于进行免疫测定的任何其他表面。结合过程在本领域中是公知的，并且一般由交联共价结合或物理吸附组成，在制备测试样品中洗涤聚合物-抗体复合物。然后，将一等份待测样品添加到固相复合物上，并在足够的时间段(例如2至40分钟或更方便时，则过夜)和适当的条件(例如约20℃至约40℃)下孵育，以允许抗体中存在的任何亚基结合。孵育期后，洗涤、干燥抗体亚基固相，并将其与对一部分半抗原具有特异性的二抗一起孵育。所述二抗与用于指示二抗与半抗原结合的报道分子相连。
一种替代方法包括固定RV抗原，然后将固定化的靶标暴露于血清或血浆。根据靶标的量和报道分子信号的强度，可通过与抗体直接标记来检测结合的靶标。或者，将对一抗具有特异性的经标记二抗暴露于靶标-一抗复合物以形成靶标-一抗-二抗三元复合物。通过报道分子发出的信号检测所述复合物。
本说明书中使用的“报道分子”指通过其化学性质提供能够检测抗原-结合抗体的分析上可鉴别信号的分子。检测可以是定性的或定量的。在该类型的测定中，最常用的报道分子为酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)以及化学发光分子。在酶免疫测定的情况下，一般通过戊二醛或高碘酸盐将酶与二抗缀合。然而，容易认识到，存在多种不同的缀合技术，这些技术可容易地供本领域技术人员利用。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。一般根据相应酶水解时产生的可检测颜色变化来选择待与特异性酶一起使用的底物。合适酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。除上述显色底物外，还可采用产生荧光产物的荧光底物。在所有情况下，将酶标记的抗体添加到一抗-抗原复合物并使其结合，然后洗去过量的试剂。然后，向抗体-抗原-抗体复合物添加包含合适底物的溶液。所述底物将与连接有二抗的酶反应，产生定性的可见信号，通常还可通过分光光度法对其进行定量，以指示样品中存在的抗原量。“报道分子”还延及细胞凝集或凝集抑制(如乳胶珠上的红细胞)等的使用。
或者，可通过化学方式将荧光化合物(例如荧光素和罗丹明)与抗体偶联而不改变其结合能力。当用特定波长的光照射激活时，经荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子内诱导激发状态，随后发射出用光学显微镜通过视觉可检测的特征颜色的光。经荧光标记的抗体能够与一抗-半抗原复合物结合。洗去未结合的试剂后，然后将剩余的三元复合物暴露于合适波长的光下，观察到的荧光指示目的半抗原的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都已非常成熟，并特别优选用于本发明的方法中。不过，还可采用其他报道分子，例如放射性同位素、化学发光分子或生物发光分子。
还可进行遗传测定，例如包括PCR分析来检测Vero适应性RV(例如Vero-RV3)并且其涵盖在本文中。这样的遗传测定用于检测本文所构想的核苷酸改变。
还提供了试剂盒，例如分区形式的试剂盒，其中所述分区包含包括抗体、PCR组分、来自报道分子的底物在内的试剂和/或含有固定化抗体或抗原的固体支持物。还可包括一套使用说明书。
实施例
通过下述非限制性实施例对本公开内容教导的方面进行进一步描述。
实施例1
用于在Vero细胞中培养轮状病毒疫苗的方法
下文描述了使轮状病毒(RV3)适应于Vero细胞的方法。
1-1材料。
1.病毒产生无血清培养基(VP-SFM)GIBCO#11681。
2.以9ml/升使用L-谷氨酰胺(0.2M)ICN Biomedicals Inc.#16-801-49。
3.以100IU/ml/使用青霉素/链霉素(100X)CSL。
4.胰蛋白酶1X Sigma Chemicals#T-7418(使用50μg/ml用于活化，5μg/ml用于保持培养基)。
5.RV3轮状病毒：轮状病毒的RV3毒株为从具有无症状感染的新生儿分离的血清型G3P2A[6]，亚组II，长电泳型。合适的RV3毒株包括Hu/澳大利亚/10-25-10/77/L(ATCC识别号VR2104，保藏日期：1985年2月1日)和Hu/澳大利亚/1-9-12/77/S(ATCC识别号R2105，保藏日期：1985年2月1日)。
6.Vero细胞。
1-2制备初始病毒接种物。
在感染Vero细胞之前，对RV3进行胰蛋白酶消化。简言之，在37℃下，将每管200μL的RV3疫苗贮存液与20μL的0.5mg/ml胰蛋白酶孵育30分钟，然后将其置于4℃下直至完成细胞培养物制备。与通常用于活化RV以感染进入细胞的浓度相比，该浓度更高。标准胰蛋白酶活化使用5至15μg/ml的猪胰蛋白酶来切割轮状病毒VP4蛋白，从而使病毒变得活化，并最终与细胞结合、进入并进行复制。在该过程中，使用＞3倍标准量来活化RV3BB。
1-3制备Vero细胞并与RV3一起在转管中接种
在胰蛋白酶消化后，利用标准细胞培养方案用PBS洗涤烧瓶中的Vero细胞两次，并将其放置成混悬液。将经胰蛋白酶消化的Vero细胞重悬于50ml的PBS中，并于1700rpm下离心10分钟。移除上清液，洗涤沉淀的Vero细胞并如上在PBS中再次离心。进行细胞计数并用VP-SFM-T(即VP-SFM+5μg/ml胰蛋白酶)将Vero细胞稀释至7x105细胞/ml。将总共约2x106细胞(2.5ml细胞混悬液)置于含有200μl经胰蛋白酶消化的病毒混悬液或作为对照经培养基和胰蛋白酶(VP-SFM-T)“模拟感染”的每个无菌转式组织培养管中。在转式设备上于37℃/5％v/vCO2/95％v/v空气下孵育病毒和细胞。24小时后，再添加一等份试样经胰蛋白酶消化并洗涤的Vero细胞(100μl总体积VP-SFM中2x106细胞)。允许进行感染，并在感染后40小时时收获病毒。通过两轮的冷冻(-70℃)和解冻使细胞裂解以收获RV3病毒。低速离心病毒以除去细胞碎片并将澄清的病毒混悬液储存于-70℃下。
可利用标准方法在MA104细胞中对病毒进行滴定以确定感染灶(infectious foci)的数目。
实施例2
用于RT-PCR扩增和测序的RNA提取物和方法
RNA提取。根据生产商的方案，使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN，Westburg，Leusden，The Netherlands)从Vero适应性RV-3毒株中提取病毒RNA。
RT-PCR。使用Invitrogen一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)进行逆转录酶PCR(RT-PCR)。用于扩增轮状病毒基因的引物列于表1中。用45℃下30分钟的初始逆转录步骤，接着95℃下15分钟的PCR活化进行RT-PCR。扩增由40个循环组成：对于VP6、VP7、NSP1-5为94℃45秒、45℃45秒和70℃75秒，以及对于VP1-4为94℃45秒、45℃45秒和70℃3分钟。最后，于70℃下进行延伸7分钟。通过电泳分离扩增子、切除合适的DNA凝胶并根据生产商的说明书，但做如下改变使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN)进行纯化。步骤5，省略向乳化的凝胶DNA混合物添加异丙醇；以及步骤9，包括了被生厂商标记为任选的额外洗涤步骤以除去微量的琼脂糖。
测序。根据生厂商的方法，使用Big Dye版本3.1(ABI)进行测序。表4中列出的引物也用于测序。如需要的话，则使用额外的内部引物。
表4
用于扩增和测序RV-3病毒基因组的引物
实施例3
鉴定RV3-Vero中相比较于MA 104适应性RV3的核苷酸和氨基酸改变
鉴定RV3-Vero中相比较于来源于MA 104细胞之RV3的独特核苷酸改变(图1至42及表2和5)
独特的核苷酸改变位于NSP4中选自53、76、85、162和165的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VP1中选自886的密码子、VP3中选自643和785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756的密码子和/或NSP2中选自433的核苷酸、NSP4中选自197、267、294、525和534的核苷酸、NSP5/6中选自158、165和355的核苷酸、VP1中选自2692的核苷酸、VP3中选自343、1366、1744、1976和2402的核苷酸和/或VP4中选自136、369、1130、1162、1171、1334和2276的核苷酸中。Vero-RV3中相对于MA104-RV3的特定核苷酸突变示于表2和5中。
表5
MA104适应性RV3和Vero适应性RV3之间的核苷酸和氨基酸差异
1每个基因编码区的核苷酸序列与Rippinger等2010(同上)公开的RV3 MA104适应性病毒的核苷酸序列进行比较。
本领域的技术人员将认识到，除具体描述的那些之外，可对本文所述的本发明方面进行改变和修改。应当理解，这些方面包括所有这些改变和修改。本公开内容教导了本说明书中单独地或共同地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物以及任意两个或更多个步骤或特征的任何和所有组合。
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Claims (22)

1.一种用于培养轮状病毒(RV)毒株的方法，所述方法包括对RV的等分试样或接种物进行胰蛋白酶消化并在足以使所述RV发生导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中核苷酸改变的遗传修饰的时间和条件下，在Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系中培养所述经胰蛋白酶消化的RV。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RV毒株为人RV3。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包括收获所述RV的额外步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰蛋白酶为猪胰蛋白酶、反刍动物胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述反刍动物胰蛋白酶为牛胰蛋白酶、绵羊胰蛋白酶、山羊胰蛋白酶或骆驼胰蛋白酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述氨基酸或核苷酸改变是相比较于MA 104适应性RV而言。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述氨基酸或核苷酸改变发生在：NSP4中选自53、76、85、162和165的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VP1中选自886的密码子、VP3中选自643和785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756的密码子和/或NSP2中选自433的核苷酸、NSP4中选自197、267、294、525和534的核苷酸、NSP5/6中选自158、165和355的核苷酸、VP1中选自2692的核苷酸、VP3中选自343、1366、1744、1976和2402的核苷酸和/或VP4中选自136、369、1130、1162、1171、1334和2276的核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述氨基酸或核苷酸改变选自表2或表5中所提供的列表。
9.一种用于在Vero细胞中产生减毒RV3的方法，所述方法包括使减毒RV3的等分试样或接种物胰蛋白酶消化，并在足以使选自表2或表5中提供的列表之相比较于MA104适应性RV3的遗传修饰发生的时间和条件下，用Vero细胞或Vero细胞来源的细胞系培养所述经胰蛋白酶消化的RV3。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述胰蛋白酶为猪胰蛋白酶、反刍动物胰蛋白酶或重组胰蛋白酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述反刍动物胰蛋白酶为牛胰蛋白酶、绵羊胰蛋白酶、山羊胰蛋白酶或骆驼胰蛋白酶。
12.一种分离的Vero适应性RV3，其包含选自以下列表的一个或更多个突变：NSP4中选自53、76、85、162和165的密码子、NSP5/6中选自46和112的密码子、VP1中选自886的密码子、VP3中选自643和785的密码子以及VP4中选自43、374、385、388、442和756的密码子和/或NSP2中选自433的核苷酸、NSP4中选自197、267、294、525和534的核苷酸、NSP5/6中选自158、165和355的核苷酸、VP1中选自2692的核苷酸、VP3中选自343、1366、1744、1976和2402的核苷酸和/或VP4中选自136、369、1130、1162、1171、1334和2276的核苷酸。
13.根据权利要求12所述的分离的Vero适应性RV3，其包含选自表2或5中列表的突变。
14.一种减毒活RV组合物或灭活的RV组合物，其包含具有选自VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6中一个或更多个突变之遗传修饰的RV，所述组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述减毒的或灭活的Vero适应性RV具有选自表2或表5中列出的一个或更多个突变的遗传修饰，所述组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
16.一种用于针对RV感染给人对象接种疫苗的方法，所述方法包括在足以产生针对RV感染之免疫应答的时间和条件下，向所述对象施用有效量的减毒活Vero适应性RV3或灭活的Vero适应性RV3。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫应答是保护性免疫应答。
18.一种用于治疗患有RV感染或具有发生RV感染或再感染风险的人对象的方法，所述方法包括在足以产生针对RV感染之免疫应答的时间和条件下，向所述对象施用有效量的减毒活Vero适应性RV3或灭活的Vero适应性RV3。
19.Vero-RV在制备用于治疗对象中RV感染之药物中的用途。
20.一种分离的Vero-RV抗体。
21.一种用于检测或监测Vero-RV的方法，所述方法包括筛选导致VP1、VP3、VP4、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中氨基酸改变和/或VP1、VP3、VP4、NSP2、NSP4和/或NSP5/6的一个或更多个中核苷酸改变的遗传修饰。
22.Vero-RV在制备监测Vero-RV的感染、治疗、流行病学或适应性之诊断剂中的用途。
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