CN104800855A - 用于光学成像和光动力治疗的肿瘤靶向融合蛋白药物载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域。更具体而言，本发明涉及融合蛋白的医学应用。本发明提供了一种用于光学成像和光动力治疗的新型肿瘤靶向融合蛋白药物载体，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的融合蛋白药物载体ATF-HSA利用该载体中HSA天然配体结合位点FA1装载CPZ形成ATF-HSA:CPZ复合物，该复合物使CPZ水溶性增强并对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有靶向选择性，可用于体内外肿瘤光学成像和光动力治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域。更具体而言，本发明涉及融合蛋白的生物医学应用。
背景技术
光动力学疗法（photodynamic therapy,PDT）是利用一定波长的光激活聚集在目标细胞的光活性物质（即光敏剂），被激活的光敏剂利用其周围的组织溶氧产生具有细胞毒性的单线态氧或自由基，进而发挥对目标细胞杀伤作用的一种治疗方法。光动力学疗法是一种选择性的，非侵入性的治疗方法，对很多种疾病特别是对肿瘤具有很好的治疗效果。在光动力治疗的开展过程中，光敏剂的选择和使用是其核心问题。例如，非对称单羧基取代酞菁锌（β-carboxyphthalocyanine zinc,CPZ）是一种较为理想的强效光敏剂，其最大吸收波长（680nm）在最适于治疗的600-800nm波长范围内，具有摩尔消光系数高，单线态氧量子产率高等优点。同样，包括CPZ在内的许多光敏剂也具有其应用局限性，例如水溶性和对肿瘤靶向选择性差。因此，如何提高CPZ以及其他光敏剂的水溶性和对肿瘤靶向选择性是急需解决的问题。同样，利用CPZ以及其他光敏剂荧光信号进行的光学成像（photodynamic imaging,PDI）也存在上述问题。除此之外，与光敏剂性质类似的其他药物分子，例如吲哚类药物（indole compound）和苯二氮平类药物（benzodiazepine）等在各自临床使用中也存在类似问题[1-22]。
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这些文献全文引入本文作为参考。
发明内容
本发明涉及一种新型融合蛋白药物载体，该载体包含尿激酶（uPA）氨基端片段，例如uPA氨基端Ser1-Glu143（ATF）。本发明还涉及一种包含u2A氨基端片段和人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）的融合蛋白药物载体，例如ATF-HSA。该融合蛋白药物载体对具尿激酶受体（uPAR）高水平表达的肿瘤细胞具有靶向选择性并可利用HSA天然配体结合位点装载药物分子。本发明还涉及在该融合蛋白药物载体中装载药物的方法。作为示例，利用该方法成功装载了一种药物分子（单羧基取代酞菁锌光敏剂，β-carboxy phthalocyanine zinc,CPZ）。具体的，本发明的融合蛋白药物载体ATF-HSA利用该载体中HSA天然配体结合位点FA1装载CPZ形成ATF-HSA:CPZ复合物。本发明ATF-HSA:CPZ复合物使CPZ水溶性增强并对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有靶向选择性，可用于体内外肿瘤光学成像和光动力治疗。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种新型融合蛋白药物载体，该载体包含uPA氨基端片段，例如uPA氨基端Ser1-Glu143（ATF）。
在一个具体的实施方案中，本发明还涉及一种包含uPA氨基端片段和人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）的融合蛋白药物载体。
在一个更具体的实施方案中，本发明提供了如下氨基酸序列（以氨基酸单字母表示）的对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有靶向选择性的新型融合蛋白药物载体，表达式为ATF-HSA（SEQ ID NO.1）：
EFSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSPPEEVDGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLVDHHHHHH。
在SEQ ID NO.1中，氨基酸序列SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSPPEE来自ATF；氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL来自HSA，其余氨基酸为构建融合蛋白时必需引入的酶切位点（EcoRⅠ和SalⅠ）氨基酸（EF和VD）及氨基酸标签（甘氨酸标签G和组氨酸标签H）。
在第二方面中，本发明提供了一种编码融合蛋白药物载体ATF-HSA的融合蛋白基因。
优选地，所述融合蛋白基因的序列如SEQ ID NO.2所示：
GAATTCAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCATCGAACTGTGACTGTCTAAATGGAGGAACATGTGTGTCCAACAAGTACTTCTCCAACATTCACTGGTGCAACTGCCCAAAGAAATTCGGAGGGCAGCACTGTGAAATAGATAAGTCAAAAACCTGCTATGAGGGGAATGGTCACTTTTACCGAGGAAAGGCCAGCACTGACACCATGGGCCGGCCCTGCCTGCCCTGGAACTCTGCCACTGTCCTTCAGCAAACGTACCATGCCCACAGATCTGATGCTCTTCAGCTGGGCCTGGGGAAACATAATTACTGCAGGAACCCAGACAACCGGAGGCGACCCTGGTGCTATGTGCAGGTGGGCCTAAAGCCGCTTGTCCAAGAGTGCATGGTGCATGACTGCGCAGATGGAAAAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAAGTCGACGGTGGTGGTGGTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAGTCGACCATCATCATCATCATCAT。
在SEQ ID NO.2中，核苷酸序列AGCAATGAACTTCATCAAGTTCCATCGAACTGTGACTGTCTAAATGGAGGAACATGTGTGTCCAACAAGTACTTCTCCAACATTCACTGGTGCAACTGCCCAAAGAAATTCGGAGGGCAGCACTGTGAAATAGATAAGTCAAAAACCTGCTATGAGGGGAATGGTCACTTTTACCGAGGAAAGGCCAGCACTGACACCATGGGCCGGCCCTGCCTGCCCTGGAACTCTGCCACTGTCCTTCAGCAAACGTACCATGCCCACAGATCTGATGCTCTTCAGCTGGGCCTGGGGAAACATAATTACTGCAGGAACCCAGACAACCGGAGGCGACCCTGGTGCTATGTGCAGGTGGGCCTAAAGCCGCTTGTCCAAGAGTGCATGGTGCATGACTGCGCAGATGGAAAAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAA编码ATF。
核苷酸序列GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTA编码HSA。
其余核苷酸为上述构建融合蛋白基因时必需引入的酶切位点及核苷酸序列标签。
在该方面中，本发明还提供了一种包含本发明的ATF-HSA融合蛋白基因的表达载体，例如包含ATF-HSA融合蛋白基因的pPICZαA表达载体。所述表达载体用于表达ATF-HSA融合蛋白。
在该方面中，本发明还提供了一种包含本发明的ATF-HSA融合蛋白基因或本发明的表达载体的表达体系，所述表达体系优选是真核细胞，例如巴斯德毕氏酵母（Pichia pastoris）X-33。所述细胞用于表达ATF-HSA融合蛋白。
在第三方面中，本发明提供了在上述的ATF-HSA融合蛋白药物载体中装载药物分子的方法，称为：DIP法（Dilute-Incubate-Purify，即“稀释-孵育-纯化”法），其特征在于：该方法可将药物分子完全包裹在药物载体内部，避免药物分子或药物载体的聚集，例如，所述方法包括步骤：
（1）将药物分子稀释至其尚未形成聚集体时的浓度，即药物分子单体较多时的终浓度；
（2）在含有少量有机溶剂的情况下，例如10%DMSO，将终浓度低于上述药物分子终浓度的ATF-HSA融合蛋白药物载体与药物分子混合孵育；
（3）利用纯化ATF-HSA融合蛋白药物载体的方法纯化和浓缩以获得高浓度、高纯度的融合蛋白药物载体:药物分子复合物，以分离掉多余药物分子。
在第四方面中，本发明提供了利用上述方法在ATF-HSA融合蛋白药物载体中装载药物分子（例如光敏剂CPZ）而获得的一种ATF-HSA:药物分子复合物（例如ATF-HSA:CPZ复合物）。
在第五方面中，本发明还提供装载了药物分子的融合蛋白药物载体:药物分子复合物（例如ATF-HSA:CPZ）的应用，其特征在于，所述复合物用作体内外肿瘤成像的探针，或者用于肿瘤的光动力治疗。该复合物对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有优良的靶向选择性。
本发明的优点是：
（1）该融合蛋白药物载体制备过程直接简单，药物载体在体内外稳定，本身对细胞无毒性；
（2）装载方法简便快捷，可显著提高药物分子（如CPZ）在水溶液中的单体活性比例；
（3）根据该方法制备的ATF-HSA:药物分子复合物例如ATF-HSA:CPZ复合物水溶性好，在体内外对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞均具有很好的靶向选择性；
（4）在体内外对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向成像和光动力治疗效果。
附图说明：
图1为本发明的一个具体实例的原理示意图。
本发明提供了一种可使单羧基取代酞菁锌（β-carboxy phthalocyanine zinc,CPZ）水溶性增强并对具尿激酶受体（uPAR）高水平表达的肿瘤细胞具有靶向选择性的新型融合蛋白药物载体ATF-HSA。利用该载体HSA天然配体结合位点FA1装载CPZ形成ATF-HSA:CPZ复合物可用于体内外肿瘤靶向成像与光动力治疗。
图2为实施例中ATF-HSA融合蛋白药物载体的表达、纯化与表征（A）及ATF-HSA和ATF-HSA:CPZ复合物在体外与uPAR的结合（B）。
A：ATF-HSA融合蛋白药物载体纯化后利用分子筛superdex200凝胶柱鉴定其纯度（单体洗脱峰13ml）。其中插图为12%SDS-PAGE鉴定ATF-HSA融合蛋白药物载体的表达（相对分子量约84kDa）。
B：Native-PAGE鉴定体外ATF-HSA和ATF-HSA:CPZ复合物与uPAR的结合活性。证明ATF-HSA和ATF-HSA:CPZ复合物在体外均具有与uPAR的结合活性。
图3为ATF-HSA:CPZ复合物在生理盐水中的紫外可见光谱（A）和荧光激发与发射光谱（B）。
A：ATF-HSA:CPZ复合物紫外可见光谱显示在生理盐水中，被装载的CPZ分子主要是以单体活性形式存在（680nm），与之对比的是一种水溶性的酞菁类衍生物光敏剂（ZnPc-(Lys)5），其在生理盐水中主要是以聚集体形式存在（630nm）。其中光谱右侧插图为在可见光下对应样品在比色皿中的状态，被装载的CPZ分子和ZnPc-(Lys)5水溶性好，均呈酞菁类光敏剂特征性的蓝色。
B：ATF-HSA:CPZ复合物荧光激发与发射光谱显示在生理盐水中，被装载的CPZ分子荧光强度远强于ZnPc-(Lys)5。其中光谱右侧插图为对应样品在特定光源激发下在比色皿中的荧光，被装载的CPZ分子荧光（酞菁类光敏剂特征性的红色荧光）明显强于ZnPc-(Lys)5（几乎没有任何荧光，还是呈原本可见光下的蓝色）。
图4为ATF-HSA:CPZ复合物在体外人非小细胞肺癌H1299（uPAR高水平表达）中的光学成像效果。
A：ATF-HSA:CPZ复合物（下图，CPZ分子荧光为酞菁类光敏剂特征性红色荧光）在H1299细胞中的成像效果明显好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（上图，红色荧光）。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向成像效果。图中还显示该复合物存在于细胞质中，与细胞核染料DAPI没有叠加（蓝色荧光）。
B：ATF-HSA:CPZ复合物中CPZ分子在H1299细胞中的成像强度明显高于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物中的CPZ分子强度（约2倍）。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。
图5为ATF-HSA:CPZ复合物在两种肿瘤细胞（非小细胞肺癌H1299和人乳腺癌MDA-MB-231，uPAR高水平表达）中的细胞摄取情况（A）和对这两种肿瘤细胞光动力治疗的效果（B）。
A：ATF-HSA:CPZ复合物在两种肿瘤细胞（H1299和MDA-MB-231）中的摄取量高于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（约2倍）并且呈时间依赖性。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。
B：ATF-HSA:CPZ复合物对两种肿瘤细胞（H1299和MDA-MB-231）的光动力治疗效果好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（约2倍）并且呈浓度依赖性。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向光动力治疗效果。
图6为ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型（uPAR高水平表达）中的成像结果。
A：ATF-HSA:CPZ复合物（下图）在小鼠肝癌H22模型中对肿瘤的成像效果明显好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（上图）。图中分别显示小鼠活体成像图（左图）和肿瘤三维成像图（右图）。另外，ATF-HSA:CPZ复合物在肿瘤部位的靶向蓄积与成像明显好于非肿瘤部位。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体内较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向成像效果。NT：非肿瘤组织（non-tumor）,T：肿瘤组织（tumor）。
B：ATF-HSA:CPZ复合物中CPZ分子在小鼠肝癌H22模型中肿瘤部位的浓度明显高于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物中的CPZ分子浓度。另外，ATF-HSA:CPZ复合物在肿瘤部位的靶向蓄积浓度明显高于非肿瘤部位。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体内较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。NT：非肿瘤组织（non-tumor）,T：肿瘤组织（tumor）。
图7为ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型（uPAR高水平表达）中对肿瘤光动力治疗结果。
A：ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型中对肿瘤光动力治疗的效果明显好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（约2倍）和生理盐水（约4倍）。证明ATF-HSA:CPZ复合物在体内较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向光动力治疗效果。
B：经光动力治疗后ATF-HSA:CPZ复合物和HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型中的浓度。NT：非肿瘤组织（non-tumor），T：肿瘤组织（tumor）。
具体实施方式
本发明通过如下实施例对本发明进行详细说明。但是本领域技术人员了解，以下实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
尿激酶（uPA）氨基端片段（amino-terminal fragment，ATF，Ser1-Glu143）含一个类生长因子结构域及一个环状结构域，其中类生长因子结构域能与尿激酶受体（uPAR）特异性紧密结合。由于其分子量较小（相对分子量约为14kDa），在体内代谢较快，半衰期较短，所以如果未经修饰或保护，ATF对uPAR的靶向选择性应用受到很大限制。
本发明经过不懈努力，利用人血清白蛋白（HSA）的配体结合能力和ATF对uPAR的识别结合能力构建融合蛋白药物载体ATF-HSA。另外利用HSA自身半衰期较长的特点，延长了ATF及ATF-HSA载体的半衰期，从而延长其功能作用时间。该融合蛋白药物载体本身稳定，无细胞毒性，除可以装载药物分子外，还对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。我们进一步发展了一种使用该载体装载药物的方法。作为对该药物载体和装载药物方法的测试示例，我们把一种光敏剂药物分子（单羧基取代酞菁锌，CPZ）装入到该载体中，成功地制备了该药物载体和光敏剂的复合物ATF-HSA:CPZ。该复合物在体内外对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞均具有很好的靶向选择性，可以用于体内外肿瘤成像和光动力治疗。该药物载体也可以用于其他药物分子的装载，以增强其水溶性和对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞的靶向选择性。
实施例
ATF-HSA融合蛋白药物载体的构建、表达、纯化与表征：
使用基因克隆的方式构建ATF-HSA融合蛋白基因（SEQ ID NO.2）pPICZαA表达载体（购自美国Invitrogen公司）。经基因测序鉴定后，将该表达载体电转化巴斯德毕氏酵母（Pichia pastoris）X-33（购自美国Invitrogen公司）感受态细胞。经小量表达鉴定后在该真核表达系统中大量表达该融合蛋白药物载体，每隔24h，补加甲醇至终浓度为1%。诱导表达4d后，4℃，7000rpm，10min离心去除菌体，使用醋酸钠缓冲液（AB）调节其pH至pH4.5。4℃，10000rpm离心40min，经0.45μm、0.22μm滤膜真空抽滤后，用去离子水将该处理后的大量诱导表达培养液稀释5倍（控制其pH保持在4.5）。于10℃流过已平衡好（用A液，即20mM AB，pH4.5平衡）的阳离子交换柱SPFF（购自美国GE公司），先使用A液平衡至蛋白检测仪（HD-21-88，购自上海琪特分析仪器有限公司）读数稳定，然后使用NaCl浓度连续洗脱法洗脱纯化，即将B液（20mMAB pH4.5，1M NaCl）与A液（20mM AB pH4.5）连续混合后洗脱，收集检测器洗脱峰。12%SDS-PAGE检测收集目的蛋白的情况。分子筛superdex200凝胶柱（购自美国GE公司）检测纯化后目的蛋白的纯度。Native-PAGE鉴定体外ATF-HSA与uPAR的结合活性。超微量分光光度计（购自美国GE公司）检测纯化后目的蛋白的浓度。结果如图2（A）所示。具体的，SDS-PAGE鉴定ATF-HSA融合蛋白药物载体表达量较高，相对分子量约84kDa；分子筛superdex200凝胶柱鉴定其纯化后纯度较高（单体洗脱峰13ml）；Native-PAGE证明ATF-HSA在体外具有与uPAR的结合活性。
ATF-HSA:CPZ复合物的制备、纯化与表征：
称取1.244mg（MW：622）CPZ粉末，溶于200μl二甲基亚砜（DMSO），混匀后即配制成10mM CPZ DMSO溶液。配制ATF-HSA与CPZ的200ml结合体系，即200ml中含10%DMSO，50mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8.5，ATF-HSA终浓度为2μM，CPZ终浓度为10μM；依次向结合体系中添加相应量的ATF-HSA和CPZ，于室温、避光搅拌结合过夜。将200ml ATF-HSA:CPZ混合液，使用50mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8.5稀释1倍（即至400ml），4℃，10000rpm离心15min。离心后取400ml上清，与25ml已平衡好的DEAE阴离子柱填料（购自美国GE公司，50mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8.5平衡）室温避光混合1h。结合后使混合液流过，然后用125ml50mM Tris-HCl，50mMNaCl，pH8.5平衡结合有ATF-HSA:CPZ复合物的DEAE柱，最后使用50ml50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.5洗脱ATF-HSA:CPZ复合物。将该洗脱液装入透析袋，使用蔗糖法浓缩将其浓缩至约10ml，将浓缩后ATF-HSA:CPZ，于10℃，对1L生理盐水透析液透析，3h更换一次透析液（1L），透析过夜。上述制备纯化方法即为DIP法（Dilute-Incubate-Purify,即“稀释-孵育-纯化”法）具体实施方法。从透析袋取出ATF-HSA:CPZ生理盐水溶液，离心后于4℃避光放置待检测用。利用紫外可见、荧光等性能检测手段，对ATF-HSA:CPZ进行相关测试表征。
HSA:CPZ复合物也按相同方法制备、纯化与表征以作后续实验对照（HSA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL，由SEQ ID NO.2的核苷酸序列GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTA编码，下同）。
结果如图2（B）中所示。Native-PAGE证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外具有与uPAR的结合活性。
图3为ATF-HSA:CPZ复合物在生理盐水中的紫外可见光谱（A）和荧光激发与发射光谱（B）。ATF-HSA:CPZ复合物紫外可见光谱显示在生理盐水中，被装载的CPZ分子主要是以单体活性形式存在（680nm）；比色皿中，被装载的CPZ分子水溶性好，呈酞菁类光敏剂特征性的蓝色。ATF-HSA:CPZ复合物荧光激发与发射光谱显示在生理盐水中，被装载的CPZ分子荧光强度较高；比色皿中，被装载的CPZ分子荧光（酞菁类光敏剂特征性红色荧光）强度较强。
ATF-HSA:CPZ体外对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞成像：
选取贴壁肿瘤细胞H1299（购自中国科学院上海细胞生物学研究所，uPAR高水平表达，使用购自美国Gibco公司的RPMI1640培养基培养）作为体外成像细胞，在5%CO2,37℃培养箱（购自美国Thermo公司）中按常规细胞培养的方法培养、传代，直至细胞生长旺盛。于细胞培养皿加入2ml H1299细胞悬液（5×104细胞/ml）培养过夜。加入终浓度2μM ATF-HSA:CPZ于细胞培养皿中，5%CO2，37℃培养箱中孵育24h后，用PBS缓冲液（购自上海生工生物工程股份有限公司）洗涤3次。然后按照说明书加入DAPI细胞核染料染色液（购自美国Sigma公司），孵育5min。去染色液，PBS缓冲液洗涤2-3次。利用Olympus FluoViewTMFV1000激光共聚焦显微镜（购自日本Olympus公司），分别用635nm（用于激发CPZ分子荧光）和405nm（用于激发DAPI荧光）的激光扫描获取图像。
HSA:CPZ复合物也按相同实验步骤以作对照。
结果如图4所示。ATF-HSA:CPZ复合物（CPZ分子荧光为酞菁类光敏剂特征性红色荧光）在H1299细胞中的成像效果明显好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物，证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向成像效果。图中还显示该复合物存在于细胞质中，与细胞核染料DAPI没有叠加（蓝色荧光）。ATF-HSA:CPZ复合物中CPZ分子在H1299细胞中的成像强度明显高于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物中的CPZ分子强度（约2倍），证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。
ATF-HSA:CPZ体外对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞摄取和光动力学实验：
选取贴壁肿瘤细胞H1299和MDA-MB-231（购自中国科学院上海细胞生物学研究所，uPAR高表达，使用购自美国Gibco公司的DMEM培养基培养）作为实验细胞，在5%CO2,37℃培养箱中按常规细胞培养的方法培养、传代，直至细胞生长旺盛。于96孔细胞培养板铺细胞（3×104细胞/孔）。添加终浓度1μM ATF-HSA:CPZ。然后，根据药物摄取不同时间点（24h、18h、12h、4h、2h、0.5h）吸去到达摄取时间的培养孔内原有的细胞培养基，加入灭菌PBS缓冲液清洗一次，混匀后吸去PBS缓冲液，加入100μl1%SDS、0.1M NaOH溶液，混匀后室温放置30min检测。使用BioTek Synergy4Hybrid Multi-ModeMicroplate Reader读板机（购自美国BioTek公司）检测，使用1%SDS、0.1M NaOH溶液配制已知浓度实验药物，绘制实验药物浓度标准曲线，以计算实验药物细胞摄取量。使用BCA试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司），绘制蛋白浓度标准曲线，以计算细胞蛋白总量。
HSA:CPZ复合物也按相同实验步骤以作对照。
选取贴壁肿瘤细胞H1299和MDA-MB-231作为实验细胞，于96孔细胞培养板铺细胞（1×104细胞/孔）。根据不同浓度（10-7、10-6.5、10-6M）添加ATF-HSA:CPZ。孵育24h后，吸去原有细胞培养基，加入新鲜、37℃温浴的细胞培养基清洗一次。吸去此清洗的细胞培养基，再加入新鲜、37℃温浴的细胞培养基。混匀后，按实验需要利用波长680nm的光源光照1min达光剂量1.5J/cm2，光照结束后于37℃，CO2培养箱静置培养过夜。吸去原有细胞培养基，加入100μl新鲜、37℃温浴的细胞培养基，再加入10μl5mg/ml MTT（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，噻唑蓝，购自美国Sigma公司）溶液，混匀后，于37℃，CO2培养箱静置培养作用4h。作用时间结束后，吸去细胞培养孔内原有的110μl细胞培养基与MTT溶液，再加入150μl DMSO，室温下，15min震荡混匀。使用BioTek Synergy4Hybrid Multi-ModeMicroplate Reader读板机，490nm检测。
HSA:CPZ复合物也按相同实验步骤以作对照。
图5为ATF-HSA:CPZ复合物在两种肿瘤细胞中的细胞摄取情况（A）和对两种肿瘤细胞光动力治疗的效果（B）。ATF-HSA:CPZ复合物在两种肿瘤细胞中的摄取量高于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（约2倍）并且呈时间依赖性，证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。ATF-HSA:CPZ复合物对两种肿瘤细胞的光动力治疗效果好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（约2倍）并且呈浓度依赖性，证明ATF-HSA:CPZ复合物在体外较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向光动力治疗效果。
ATF-HSA:CPZ体内对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞成像与光动力学治疗：
按标准实验步骤建立雄性昆明种小鼠H22肝癌模型：将H22肝癌细胞（购自中国科学院上海细胞生物学研究所，uPAR高水平表达）首先接种在雄性昆明种小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司）腹腔内，约5-7d后取其腹水瘤液。用无菌生理盐水将腹水H22细胞瘤液调整至浓度为1.0×107细胞/ml的悬液，在无菌条件下，接种于各受试鼠背部皮下，0.2ml/只。将建模成功的小鼠随机分为3组，每组15只，分别为：ATF-HSA:CPZ实验组1组（剂量为0.05mg CPZ/kg小鼠体重），HSA:CPZ对照组1组（剂量为0.05mg CPZ/kg小鼠体重），生理盐水阴性对照组（剂量为0.1ml/10g小鼠体重）。待小鼠背部肿瘤长至约150mm3，按上述所示剂量尾静脉注射给药，给药后，每组小鼠均采用脱毛剂将各组小鼠肿瘤接种部位周围脱毛，按一定检测时间，利用小鼠活体成像FMT2500TM LX仪（购自美国PerkinElmer公司）对小鼠进行体内肿瘤成像与ATF-HSA:CPZ浓度测量。
图6为ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型中的成像结果。ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型中对肿瘤的成像效果明显好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物，另外，ATF-HSA:CPZ复合物在肿瘤部位的靶向蓄积与成像明显好于非肿瘤部位，证明ATF-HSA:CPZ复合物在体内较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向成像效果。ATF-HSA:CPZ复合物中CPZ分子在小鼠肝癌H22模型中肿瘤部位的浓度明显高于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物中的CPZ分子浓度，另外，ATF-HSA:CPZ复合物在肿瘤部位的靶向蓄积浓度明显高于非肿瘤部位，证明ATF-HSA:CPZ复合物在体内较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向选择性。
另将其他建模成功的小鼠随机分为3组，每组8只，分别为：ATF-HSA:CPZ实验组1组（剂量为0.05mg CPZ/kg小鼠体重），HSA:CPZ对照组1组（剂量为0.05mg CPZ/kg小鼠体重），生理盐水阴性对照组（剂量为0.1ml/10g小鼠体重）。待小鼠背部肿瘤长至约150mm3，按上述所示剂量尾静脉注射给药。给药24h后，每组小鼠均采用脱毛剂将各组小鼠肿瘤接种部位周围脱毛，利用波长680nm，每日光剂量为50J/cm2的光源对实体瘤部位进行光动力学治疗。每天光照治疗前，使用游标卡尺测量肿瘤长、宽、高，按π/6×(长×宽×高)公式计算肿瘤体积，并使用天平测量小鼠重量。
图7为ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型中对肿瘤光动力治疗结果。ATF-HSA:CPZ复合物在小鼠肝癌H22模型中对肿瘤光动力治疗的效果明显好于对照组中不含ATF的HSA:CPZ复合物（约2倍）和生理盐水（约4倍），证明ATF-HSA:CPZ复合物在体内较对照组对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞具有很好的靶向光动力治疗效果。
Claims (10)
1.一种融合蛋白药物载体，该载体包含uPA氨基端片段。
2.权利要求1的融合蛋白药物载体，该载体还包含人血清白蛋白。
3.权利要求2的融合蛋白药物载体，该载体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的融合蛋白药物载体。
4.编码权利要求3的融合蛋白药物载体的基因。例如其序列是SEQ ID NO.2。
5.包含权利要求4的基因的表达载体，例如pPICZαA表达载体。
6.包含权利要求4的基因或权利要求5的表达载体的表达体系。所述表达体系优选是真核细胞，例如巴斯德毕氏酵母（Pichia pastoris）X-33。
7.权利要求1-3任一项的融合蛋白药物载体与药物分子结合形成的融合蛋白药物载体:药物分子复合物，优选药物分子为CPZ，例如融合蛋白药物载体:CPZ复合物。
8.制备权利要求7的融合蛋白药物载体:药物分子复合物的方法，其特征在于：所述方法将药物分子完全包裹在药物载体内部，避免药物分子或药物载体的聚集。例如，所述方法包括步骤
（1）将要装载的药物分子稀释，优选至其尚未形成聚集体时的浓度，即药物分子单体较多时的终浓度；
（2）在含有少量有机溶剂的情况下，例如10%DMSO，将终浓度低于上述药物分子终浓度的权利要求1的融合蛋白药物载体与所述药物分子混合孵育；
（3）纯化和浓缩以获得高浓度、高纯度的融合蛋白药物载体:药物分子复合物，以分离掉多余的药物分子。
9.权利要求7的融合蛋白药物载体:药物分子复合物用于对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞光学成像中的用途。优选地，所述复合物选自融合蛋白药物载体:CPZ复合物。
10.权利要求7的融合蛋白药物载体:药物分子复合物用于制备对具uPAR高水平表达的肿瘤细胞的光动力治疗药物中的用途。优选地，所述复合物选自融合蛋白药物载体:CPZ复合物。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |