CN104784690A - 一种纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属纳米生物医学技术领域，具体为一种纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂及其制备方法。该复合物光敏剂是由锐钛矿晶相的二氧化钛纳米颗粒包裹在含氨基的氧化硅层中，再静电耦合联接四磺化铝酞菁而形成的复合物。本发明制备过程简单，二氧化钛/铝酞菁具有水溶性好，吸收光谱宽，活性氧产量高，暗毒性低，肿瘤细胞光杀伤效率高等优点，因而该材料在生物医疗方面有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属纳米生物医学技术领域，具体涉及一种纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂及其制备方法。
背景技术
近20年，光动力学疗法发展为一种新的治疗恶性肿瘤的方法。相较于手术、化疗、放疗等传统治疗手段，光动力治疗具有侵入性小，针对性强，恢复快，可重复治疗等优点，因而备受瞩目。光动力治疗的原理是利用光敏剂在肿瘤中的聚集，吸收特殊波段的激发光，通过能量转换与光敏剂周围的氧分子和水分子产生活性氧，利用其强氧化性破坏癌细胞活性或诱导癌细胞凋亡或坏死。其激发光的选择从最初的非相干光源迅速发展为激光光纤系统，以提供充足的光照剂量。
光敏剂作为光动力治疗的关键一直是研究热点。早在1995年，美国食品与药品管理局（FDA）批准血卟啉（Photofrin）可以作为多种癌症的临床光敏剂药物，随后卟啉衍生物在多个国家被批准用作临床治疗。虽然血卟啉衍生物临床上的应用显示了一定的疗效，但也存在严重的问题：吸收波长偏紫外区域，自身光毒性大，是混合物，成分不稳定。因而，大量研究人员致力于研制新一代的光敏剂适合于临床应用，使其具备更宽的吸收光谱，产生更高的活性氧，自身毒性小，成分单一，具备更好的生物兼容性等优点，使其更适于临床应用。
酞菁衍生物现已被部分发达国家批准为临床光敏剂药物。铝酞菁是一种常用的光敏剂，它在670 nm 处有一个很强的吸收峰，并且具有很高的光杀伤作用。但是它表面带负电的磺化基团，致使它与带负电的细胞膜亲和性差，极大地影响了光敏剂被肿瘤细胞吞噬的效率。因此需要核实的纳米载体来提高光敏剂被肿瘤细胞摄入的效率。
宽带隙的半导体材料二氧化钛是一种优良的纳米载体材料，具备无毒性，高稳定性，良好的生物兼容性，已经被大量应用于牙医和整容医学，非常适合作为酞菁的载体。目前的研究虽然发现二氧化钛具备较好的光杀伤效应，但也暴露了各种问题，其一水溶性不佳，不易被细胞摄入，也不利于静脉注射后血液运输药物。其二吸收光谱在紫外波段，这个波段的光对生物系统损伤极大。因此，需要制备一种新的光敏剂作为候选药物，使其具备如下优点：细胞亲和性好，吸收光谱宽，活性氧产量高，暗毒性低，肿瘤细胞光杀伤效率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗恶性肿瘤的纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂及其制备方法，弥补上述两种组份材料的在光动力治疗中应用中存在的不足，同时具有水溶性好，吸收光谱宽，活性氧产量高，暗毒性低，肿瘤细胞光杀伤效率高等优点。
本发明提供的抗恶性肿瘤的纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂，是由锐钛矿晶相的二氧化钛纳米颗粒，包裹在含氨基的氧化硅层中，再静电耦合联接四磺化铝酞菁而形成的复合物，其结构式为：
其中，
上述纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂制备的具体步骤为：
（1）含氧基的硅烷偶联剂包裹上氨基保护剂；
（2）二氧化钛纳米颗粒与步骤（1）所得溶液反应，从而在所述的锐钛矿相二氧化钛纳米颗粒表面包裹带氨基保护端的二氧化硅层；
（3）步骤（2）得到的材料溶解在含卸除氨基保护的溶液中，从而在二氧化钛纳米颗粒表面包裹带氨基的二氧化硅层；
（4）将步骤（3）获得的二氧化钛悬浮液，利用其表面的带氨基氧化硅层与铝酞菁静电耦合联接。
本发明中，所述的硅烷偶联剂至少是含氧基，末端带有氨基的化合物。
本发明中，所述的氨基保护剂至少是一种烷氧羰基类氨基保护基。
本发明中，所述的二氧化钛至少是一种能够在紫外或可见光条件下产生活性氧自由基的二氧化钛纳米材料光敏剂，不限于纯二氧化钛颗粒或者掺杂氮、碳等其他原子得到可见条件吸收的二氧化钛纳米颗粒。
本发明中，所述的铝酞菁至少是一种在红光到近红外光照射下可以产生单线态氧等活性氧基团的酞菁类光敏剂。
本发明中，步骤（1）中，硅烷偶联剂/氨基保护剂的摩尔比例为1:1-1:2。
本发明中，步骤（2）中，所述的二氧化钛纳米材料通过末端带氨基的硅烷偶联剂进行氨基功能化。
本发明中，步骤（1）-（4）中，反应溶剂使用N，N-二甲基甲酰胺。
本发明中，所述二氧化钛纳米颗粒粒径为15 -25 nm，晶相为锐钛矿相。
本发明中，包含氧化硅层的二氧化钛纳米颗粒尺寸在20-40 nm， 表面电势值为20-40 mV。
本发明制备得到的光敏剂的整体尺寸在25-60 nm， 表面电势值为0-20 mV。
本发明制备得到的光敏剂， 包含锐钛矿相的纳米二氧化钛颗粒，三氧基丙乙基硅烷，四磺化铝酞菁。
本发明制备的复合物光敏剂， 其特征在于，制备得到的纳米材料的吸收光谱范围为400~720
nm。
作为典型例子，本发明制备方法的具体操作过程如下：
一、将芴甲氧羰酰-8氨基-3,6双乙氧基乙酸（FMOC-8
amino-3,6-dioxaoctanoic acid），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBOP）和N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）按照摩尔比例为1:（1-2）:（2-4）:（0.5-1）分别加入到反应溶剂N，N-二甲基甲酰胺中，充分搅拌12-24小时；
二、将1-2 mg二氧化钛溶解于5.7mL的N，N-二甲基甲酰胺中，或者按照配比等比例反应,用超声分散15-30
分钟；
三、将步骤二得到的二氧化钛悬浮液缓慢滴入步骤一得到的4.3-5 mL的FMOC-APTES溶液中，滴加过程中需要不停搅拌，并在室温下充分搅拌12-24小时；
四、将步骤三得到的溶液用5000-8000转每分钟的转速离心15-30分钟，沉淀物用四氢呋喃溶液洗涤2-6遍后，重新超声分散在N，N-二甲基甲酰胺中；
五、取步骤四获得的悬浮液，加入1-3%体积的哌啶，室温下搅拌12-24小时；
六、取步骤五得到的悬浮液，分别用N，N-二甲基甲酰胺溶剂和四氢呋喃溶剂洗涤2-6遍，并在通风橱干燥；
七、取步骤六得到的二氧化钛悬浮液，加入5.4-15.6
μg的铝酞菁，在避光条件下搅拌1-5小时，得到二氧化钛/铝酞菁的复合物光敏剂。
其中，所述的芴甲氧羰酰-8氨基-3,6双乙氧基乙酸的结构式为：
所述的3-氨丙基三乙氧基硅烷的结构式为：
所述的铝酞菁的结构式为：
。
本发明中制备得到的二氧化钛/铝酞菁具有良好的水溶性，吸收光谱宽，活性氧产量高，暗毒性低，肿瘤细胞光杀伤效率高等优点。
附图说明
图1是复合物光敏剂扫描电镜显微图像。
图2是二氧化钛/铝酞菁复合物的水相粒径分布图。
图3是二氧化钛/铝酞菁复合物的吸收光谱。
具体实施方式
下面通过具体实例进一步描述本发明：
实施例一： 把0.01mmol的芴甲氧羰酰，0.01 mmol的 3-氨丙基三乙氧基硅烷，0.02mmol六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基和0.005 mmol的N，N-二异丙基乙胺分别加入到10 mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），待充分溶解，室温下搅拌12小时以上。取2 mg二氧化钛溶解于5.7 mL的DMF中，用超声分散15 分钟并逐滴添加到4.3 mL的芴甲氧羰酰链接3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中，滴加过程中需要不停搅拌，并在室温下充分搅拌24小时以上。用8000转每分钟的转速离心20分钟弃去上清液，取沉淀物用N，N-二甲基甲酰胺溶剂洗涤两遍后，并重新超声分散在N，N-二甲基甲酰胺溶剂中。加入100 μL的哌啶，室温下搅拌12小时。获得的悬浮液依次用N，N-二甲基甲酰胺溶剂和四氢呋喃溶剂洗涤两遍，并干燥，重溶于去离子水中，超声分散得到100 μg·mL-1氨基化的二氧化钛悬浮液。分别加入5.4-15.6 μg的铝酞菁，在黑暗中搅拌2小时，得到二氧化钛/铝酞菁的复合物悬浮液。二氧化钛/铝酞菁的形态和尺寸分布通过透射电子显微成像见图1。二氧化钛/铝酞菁复合物的水相粒径分布图见图2。吸收光谱的特征曲线见图3。
实施例二：本发明所制备的光敏剂复合物，在光动力治疗，光动力诊疗或光动力消毒中的使用方法类似于已有技术中运用非本发明所述的酞菁或卟啉化合物制备的光敏剂或光敏剂的使用方法，但需配备适宜的光源，所述的适宜光源可以由普通光源提供可见光，或者特定波长的激光器提供。光源的波长范围可从400-800
nm。优选670 nm。
实施例三：二氧化钛/铝酞菁被肿瘤细胞摄入的效果
含有不同浓度的5-20 μg·mL-1二氧化钛/铝酞菁样品稀释至细胞培养液中， 在宫颈癌细胞中孵育1h后，用0.25%胰酶消化下来，随后用4%多聚甲醛固定细胞20分钟获得细胞悬浮液。利用流式细胞仪对每个实验组扫描共10000个细胞进行细胞内荧光强度的统计分析。用并且用630nm激光进行激发和660±20 nm滤色片采集荧光信号。
结果表明，用二氧化钛/铝酞菁样品培育细胞1小时，有近80%的细胞摄入了光敏剂复合物，极大地提高了铝酞菁短期被细胞摄取的效率，此项实例可提高复合物应用于光动力诊疗的效率。
实施例四：将本发明制备得到的二氧化钛/铝酞菁对人宫颈癌HeLa细胞和人鼻咽癌（KB）细胞进行体外抗肿瘤实验。
将人宫颈癌细胞或人鼻咽癌细胞在含有不同浓度的复合物的培养液中避光培育1小时，弃去旧培养液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞后，加入普通的培养液。光照组实验，利用可见光波段（400-800 nm）的光源对细胞进行照射，光照剂量为5-15 J⋅cm-2；不照光组，将细胞避光培育相同时间。光照结束后，所有细胞避光培育24小时，再选用2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（WST-8）染色，利用酶标仪探究细胞的存活率。
结果表明，不进行光照，本发明二氧化钛/铝酞菁光敏剂复合物对人宫颈癌细胞和人鼻咽癌细胞没有杀伤和生长抑制作用，表明他们没有暗毒性；但如果选取见光进行照射，本发明表现出显著的抗肿瘤效果。通过实例探究，二氧化钛/铝酞菁光敏剂的细胞存活率与其浓度成正比关系，可获得光照条件下的半致死浓度约为5~10 μg·mL-1，对两个细胞系的光杀伤作用均十分显著。
通过上述实施例可以评价二氧化钛/铝酞菁光敏剂体外抗肿瘤光杀伤作用。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1. 一种抗恶性肿瘤的纳米二氧化钛/铝酞菁复合物光敏剂，其特征在于是由锐钛矿晶相的二氧化钛纳米颗粒，包裹在含氨基的氧化硅层中，再静电耦合联接四磺化铝酞菁而形成的复合物，具有如下结构式：
其中，
。
2. 根据权利要求1所述的复合物光敏剂，其特征在于，所述二氧化钛纳米颗粒粒径为15 -25
nm，晶相为锐钛矿相。
3. 根据权利要求1所述的复合物光敏剂，其特征在于，包含氧化硅层的二氧化钛纳米颗粒尺寸在20-40
nm， 表面电势值为20-40 mV。
4. 根据权利要求1所述的复合物光敏剂，其特征在于，整体尺寸在25-60 nm，表面电势值为0-20 mV。
5. 如权利要求1-4之一所述的抗恶性肿瘤的纳米二氧化钛/铝酞菁的光敏剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）含氧基的硅烷偶联剂包裹上氨基保护剂；
（2）二氧化钛纳米颗粒与步骤（1）所得溶液反应，从而在所述的锐钛矿相二氧化钛纳米颗粒表面包裹带氨基保护端的二氧化硅层；
（3）步骤（2）得到的材料溶解在含卸除氨基保护的溶液中，从而二氧化钛纳米颗粒表面包裹带氨基的二氧化硅层；
（4）将步骤（3）获得的二氧化钛悬浮液，利用其表面的带氨基氧化硅层与铝酞菁静电耦合联接；
其中：
所述的硅烷偶联剂至少是含氧基，末端带有氨基的化合物；
所述的氨基保护剂至少是一种烷氧羰基类氨基保护基；
所述的二氧化钛至少是一种能够在紫外或可见光条件下产生活性氧自由基的二氧化钛纳米材料光敏剂；
所述的铝酞菁至少是一种在红光到近红外光照射下可以产生单线态氧等活性氧基团的酞菁类光敏剂。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中硅烷偶联剂/氨基保护剂的摩尔比例为1:1-1:2。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的二氧化钛纳米材料通过末端带氨基的硅烷偶联剂进行氨基功能化。
8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）-（4）中，反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。
9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体操作过程如下：
一、将芴甲氧羰酰-8氨基-3,6双乙氧基乙酸（FMOC），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBOP）和N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）按照摩尔比例为1:（1-2）:（2-4）:（0.5-1）分别加入到反应溶剂N，N-二甲基甲酰胺中，充分搅拌12-24小时；
二、将1-2 mg二氧化钛溶解于5.7 mL的N，N-二甲基甲酰胺中，或依照配比等比例反应,用超声分散15-30 分钟；
三、将步骤二得到的二氧化钛悬浮液滴入步骤一得到的4.3-10 mL的FMOC-APTES溶液中，滴加过程中不停搅拌，并在室温下充分搅拌12-24小时；
四、将步骤三得到的溶液用5000-8000转每分钟的转速离心15-30分钟，沉淀物用四氢呋喃溶液洗涤2-6遍后，重新超声分散在N，N-二甲基甲酰胺中；
五、取步骤四获得的悬浮液，加入1-3%体积的哌啶，室温下搅拌12-24小时；
六、取步骤五得到的悬浮液，分别用N，N-二甲基甲酰胺溶剂和四氢呋喃溶剂洗涤2-6遍，并在通风橱干燥；
七、取步骤六得到的二氧化钛悬浮液，加入5.4-15.6 μg的铝酞菁，在避光条件下搅拌1-5小时，得到二氧化钛/铝酞菁的复合物光敏剂。
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