CN104774928A

CN104774928A - 人rrs1基因的应用以及抑制剂

Info

Publication number: CN104774928A
Application number: CN201510119345.3A
Authority: CN
Inventors: 朱向莹; 张晓慧; 沈克; 谢胜华; 徐述; 曹跃琼
Original assignee: SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI GENECHEM TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: CN104774928B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了人RRS1基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用以及抑制剂。本发明以人RRS1基因为目标，通过选取合适的靶基因序列，以RNA干扰的方式设计出具有高效抑制RRS1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是结肠癌肿瘤细胞的增殖的核酸分子、重组载体以及慢病毒等抑制剂，提供了人RRS1基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用，丰富了肿瘤治疗途径。

Description

人RRS1基因的应用以及抑制剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人RRS1基因的应用以及抑制剂。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程。

RRS1编码203个氨基酸残基，是一种新型的、保守的的真核细胞核蛋白基因，有报道表明在亨廷顿病的实验动物模型中早期表现为RRS1高表达，同时纹状体特异性的高清标准，和多聚谷氨酰胺依赖性。但是，关于RRS1在肿瘤相关领域未见相关研究报道，特别是针对结肠癌的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的在于提供人RRS1基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用，特别是在针对结肠癌的肿瘤中。

本发明的另外一个目的是提供一种抑制人RRS1基因的核酸分子，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调RRS1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是结肠癌肿瘤细胞的增殖。

本发明的另外一个目的是提供一种抑制人RRS1基因的重组载体，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调RRS1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是结肠癌肿瘤细胞的增殖。

本发明的另外一个目的是提供一种抑制人RRS1基因的慢病毒，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调RRS1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是结肠癌肿瘤细胞的增殖。

本发明的另外一个目的是提供所述核酸分子、重组载体和慢病毒在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，特别是针对结肠癌的肿瘤中。

本发明的另外一个目的是提供一种预防或治疗肿瘤的药物，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调RRS1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是结肠癌肿瘤细胞的增殖。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

人RRS1基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用。

作为优选，所述肿瘤为结肠癌。

作为优选，所述药物为RNA干扰药物。

以人RRS1基因为目标，选择其中合适的靶序列，以此为基础可筛选或制备出能够高效特异性抑制RRS1基因的转录或翻译，或能够高效特异性抑制RRS1蛋白的表达或活性的分子，从而进一步抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化、存活等，而所述分子即肿瘤治疗或预防药物。

其中所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。更进一步地，所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)，以及核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。所述核酸分子中包含有人RRS1基因的启动子序列或RRS1基因的信息序列。

当所述分子为核酸分子时，特别是siRNA或shRNA时，其可以互补人RRS1基因转录的mRNA，以RNA干扰方式抑制其转录，而前述的人RRS1基因中靶序列即为mRNA所对应的人RRS1基因上的DNA序列。

作为优选，siRNA或shRNA中的一条链包含与靶序列相同的RNA序列，即序列中碱基A、C、G保持和靶序列一致，对应的碱基T更换为U，进一步地，所述靶序列选自SEQ ID NO：1-5任意一项。

所述将RRS1基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将RRS1基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备中，特别是应用于结肠癌诊断药物的制备中。

通过免疫组织化学的方法检测RRS1基因在肿瘤组织、正常组织和肿瘤周围正常组织中的表达水平。申请人发现RRS1基因在肿瘤组织中的表达量显著高于正常组织和肿瘤周围正常组织。提示RRS1基因可能作为一种癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，RRS1基因的表达水平可能成为肿瘤诊断的标志。

基于上述技术思路，本发明还提供了多种人RRS1的抑制剂，包括：

一种抑制人RRS1基因的核酸分子，所述核酸分子为siRNA或shRNA，且包含与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列；优选地，所述核酸分子包含与人RRS1基因中19-23个连续核苷酸序列相同的RNA序列；更优选地，所述核酸分子包含与人RRS1基因中19、20或21个连续核苷酸序列相同的RNA序列。

进一步优选，所述siRNA中的第一条链包含与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列，第二条链与第一条链互补；更进一步优选地，所述第一条链核苷酸序列包含与如SEQ ID NO：1-5任意一项所示的核苷酸序列相同的RNA序列；最优选地，所述第一条链核苷酸序列如SEQ ID NO：6-10任意一项所示，即分别与SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列相同的RNA序列，具体如下：

SEQ ID NO：6(对应于SEQ ID NO：1)：5’-CCGCUGCCUUCAUUGAGUUUA-3’；

SEQ ID NO：7(对应于SEQ ID NO：2)：5’-CCGUCUGUAAACCAAGGACUA-3’；

SEQ ID NO：8(对应于SEQ ID NO：3)：5’-CAGAGAAGUUGCAACGCAUCA-3’；

SEQ ID NO：9(对应于SEQ ID NO：4)：5’-CGUCUGUAAACCAAGGACUAU-3’；

SEQ ID NO：10(对应于SEQ ID NO：5)：5’-CCGGGAAUGAGUUCUAUUCUU-3’。

进一步优选，所述shRNA包括正义链和反义链，以及连接正义链和反义链的茎环结构(loop)，所述正义链和反义链互补，且所述正义链序列包含与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列；更进一步优选地，所述正义链核苷酸序列包含与如SEQ ID NO：1-5任意一项所示的核苷酸序列相同的RNA序列，所述茎环结构的序列如SEQ ID NO：16-23任意一项所示序列；最优选地，所述正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：11-15任意一项所示，即包含了分别与如SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列相同的RNA序列，具体如下：

SEQ ID NO：11(对应于SEQ ID NO：1)：5’-CCGCUGCCUUCAUUGAGUUUACUCGAGUAAACUCAAUGAAGGCAGCGG-3’；

SEQ ID NO：12(对应于SEQ ID NO：2)：5’-CCGUCUGUAAACCAAGGACUAAAGCUUUAGUCCUUGGUUUACAGACGG-3’

SEQ ID NO：13(对应于SEQ ID NO：3)：5’-CAGAGAAGUUGCAACGCAUCACCACCUGAUGCGUUGCAACUUCUCUG-3’

SEQ ID NO：14(对应于SEQ ID NO：4)：5’-CGUCUGUAAACCAAGGACUAUAAGCUUAUAGUCCUUGGUUUACAGACG-3’

SEQ ID NO：15(对应于SEQ ID NO：5)：5’-CCGGGAAUGAGUUCUAUUCUUCCACACCAAGAAUAGAACUCAUUCCCGG-3’

其中下划线部分表示茎环结构的序列，也可任意选自SEQ ID NO：16-23任意一项所示序列。

当核酸分子为shRNA时，其可经酶切加工后成为siRNA。需要说明的是，所述与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同(或与如SEQ ID NO：1-5任意一项所示的核苷酸序列相同)的RNA序列等相似的描述语句是指，siRNA或shRNA序列中碱基A、C、G保持和靶序列一致，靶序列中对应的碱基T更换为U。

同时，本发明还提供一种抑制人RRS1基因的重组载体，包含能转录出本发明所述核酸分子的序列以及载体，所述序列嵌入载体中。需要说明的是，所述能转录出本发明所述核酸分子的序列即与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸靶序列相同，优选SEQ ID NO：1-5任意所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO：11-15任意所示序列相同的DNA序列(仅将SEQ ID NO：11-15中的U替换为T)。

优选地，所述载体为慢病毒载体；更优选地，所述慢病毒载体包含启动子和/或编码被检测到的标记物的核苷酸序列；进一步优选地，所述被检测到的标记物为绿色荧光蛋白；最优选地，所述慢病毒载体为pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。上述慢病毒载体均为本领域公知载体，可通过试剂公司购得。

本发明还提供一种抑制人RRS1基因的慢病毒，由本发明所述重组载体经细胞包装后获得。优选地，所述细胞为人胚肾293T细胞。

此外，将本发明所述慢病毒处理结肠癌RKO细胞，分别检测RRS1基因的沉默效率和抑制RKO细胞增殖能力，结果显示，经过本发明所述慢病毒处理的RKO细胞RRS1mRNA的表达水平下调了79.2％，同时增殖速度显著减缓，远低于对照组RKO细胞的增殖速度，活力细胞数目下降了83.1％，表明RRS1基因沉默导致RKO细胞增殖能力被显著抑制。

基于此，本发明提供了所述核酸分子、所述重组载体或所述慢病毒在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。优选地，所述肿瘤为结肠癌。

基于应用，本发明还提供了一种预防或治疗肿瘤的药物，包含本发明所述核酸分子、所述重组载体或所述慢病毒，以及药学上可接受的赋形剂。

优选地，所述赋形剂选自载体、稀释剂、湿润剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂中的一种或两种以上。更优选地，所述赋形剂选自糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水中的一种或两种以上。

优选地，所述药物为片剂、丸剂、粉剂或溶液剂。

由以上技术方案可知，本发明以人RRS1基因为目标，通过选取合适的靶基因序列，以RNA干扰的方式设计出具有高效抑制RRS1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是结肠癌肿瘤细胞的增殖的核酸分子、重组载体以及慢病毒等抑制剂，提供了人RRS1基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用，丰富了肿瘤治疗途径。

附图说明

图1所示为pGCSIL-GFP载体质粒图谱；

图2所示为阴性对照和本发明慢病毒对结肠癌RKO细胞中RRS1mRNA的表达水平的影响的试验结果，其中纵坐标英文表示RRS1mRNA的表达水平，横坐标英文表示对照和本发明RRS1-siRNA慢病毒；

图3所示为阴性对照和本发明慢病毒对结肠癌RKO细胞增殖能力的影响的试验结果，其中纵坐标表示细胞增殖倍数，RRS1-siRNA表示本发明RRS1-siRNA慢病毒，control表示阴性对照；

图4所示为阴性对照和本发明慢病毒对结肠癌RKO细胞增殖能力的影响的试验结果，其中纵坐标表示细胞数量，RRS1-siRNA表示本发明RRS1-siRNA慢病毒，control表示阴性对照。

具体实施方式

本发明公开了人RRS1基因的应用以及抑制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施方式中，本发明的设计思路为：

从Genbank中调取人RRS1基因序列，选取合适的靶序列，即siRNA靶点；合成针对RRS1基因的有效siRNA靶点序列、两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达RRS1基因siRNA的RNAi质粒，即重组载体；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(例如共转染人胚肾细胞293T等包装病毒的细胞)，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默RRS1基因的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了5个干扰RRS1基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO：1-5所示)，构建了特异干扰人RRS1基因的慢病毒。

本发明发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低RRS1基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本发明研究表明，RRS1基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，RRS1基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的RRS1基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面就本发明提供的人RRS1基因的应用以及抑制剂做详细说明。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：制备抑制人RRS1基因的慢病毒

1、筛选针对人RRS1基因的有效的siRNA靶点

从Genbank调取RRS1(NM_015169)基因信息；选取针对RRS1基因的有效的siRNA靶点。表1列出了其中5条针对RRS1基因的有效siRNA靶点序列，如SEQ ID NO：1-5所示。

表1 靶向于人RRS1基因的siRNA靶点序列

SEQ ID NO	TargetSeq
		1	CCGCTGCCTTCATTGAGTTTA
2	CCGTCTGTAAACCAAGGACTA
		3	CAGAGAAGTTGCAACGCATCA
4	CGTCTGTAAACCAAGGACTAT
		5	CCGGGAATGAGTTCTATTCTT

2、慢病毒载体的制备

针对siRNA靶点(以SEQ ID NO：1为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物，上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO：24)；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO：25)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：1有效siRNA靶点序列的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-RRS1-siRNA，该载体可转录出如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列，而经过酶切即可转化成SEQ ID NO：6所示的siRNA序列。

构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：26)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3),其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-RRS1-siRNA。

表3 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体

表4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl)	2.0
10×buffer	5.0

100×BSA	0.5
		Age I(10U/μl)	1.0
EcoR I(10U/μl)	1.0
		dd H₂O	40.5
Total	50.0

表5 载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA(100ng/μl)	1.0	1.0	1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)	1.0	-	1.0
				10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0
T4噬菌体DNA连接酶	1.0	1.0	1.0
				dd H₂O	16.0	17.0	16.0
Total	20.0	20.0	20.0

表6-1 PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		10×buffer	2.0
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1.0
		ddH₂O	15.2
Total	20.0

表6-2 PCR反应体系程序设定

3.包装RRS1-siRNA慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-RRS1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。

转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。

将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml。由于慢病毒载体自身带有绿色荧光蛋白的报告基因，24h后可置于荧光显微镜下观察两组细胞GFP的表达情况，确定慢病毒质粒是否已被293T细胞包装。继续培养48h后，收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中，将病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子，将过滤杯插到滤过液收集管中；(3)合好后，做好平衡，放在转头上，4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的shRNA的正义链的序列如SEQ IDNO:11所示。对照慢病毒的包装过程同RRS1-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-RRS1-siRNA载体。

按照上述相同的方法，也可获得针对SEQ ID NO：2-5有效siRNA靶点序列相对应的核酸分子、重组载体以及慢病毒，即能够产生如SEQ ID NO：12-15所示的核苷酸序列，而经过酶切即可转化成SEQ ID NO：7-10所示的siRNA序列。

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测RRS1基因的沉默效率

处于对数生长期的结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，RKO：10)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7，42℃反应1h)然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活。

采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。RRS1基因的引物如下：上游引物TCCCAGGAGTGTCTACAACCT(SEQ ID NO：27)和下游引物CAGCCCTATGCGTTCACAAC(SEQ ID NO：28)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3’(SEQ ID NO：29)和下游引物5’CCCTACCGGACACCAGAGTAA-3’(SEQ ID NO：30)。按表8中的比例配置反应体系。

表7 逆转录反应体系

试剂	体积(μl)
		5×RT buffer	4.0
10mM dNTPs	2.0
		RNasin	0.5
M-MLV-RTase	1.0
		DEPC H₂O	3.5
Total	11.0

表8 Real-time PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		SYBR premix ex taq:	10.0
上游引物(2.5μM)：	0.5
		下游引物(2.5μM)：	0.5
cDNA	1.0
		ddH₂O	8.0
Total	20.0

设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了RRS1mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果(图2)表明，结肠癌RKO细胞中RRS1mRNA的表达水平下调了79.2％。

此外，针对SEQ ID NO：2-5有效siRNA靶点序列相对应的慢病毒侵染结肠癌RKO细胞，其中RRS1mRNA的表达水平均下调了80％左右。

实施例3：检测侵染了RRS1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，RKO：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪(ThermoFisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图3和图4所示)。结果表明，慢病毒侵染组结肠癌RKO细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了83.1％，表明RRS1基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

此外，针对SEQ ID NO：2-5有效siRNA靶点序列相对应的慢病毒侵染结肠癌RKO细胞的试验结果显示，慢病毒侵染组结肠癌RKO细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目下降了80-85％，表明RRS1基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.人RRS1基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。

3.一种抑制人RRS1基因的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为siRNA或shRNA，且包含与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列。

4.根据权利要求3所述核酸分子，其特征在于，所述siRNA中的第一条链包含与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列，第二条链与第一条链互补。

5.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于，所述第一条链核苷酸序列包含与如SEQ ID NO：1-5任意一项所示的核苷酸序列相同的RNA序列。

6.根据权利要求5所述核酸分子，其特征在于，所述第一条链核苷酸序列如SEQ ID NO：6-10所示。

7.根据权利要求3所述核酸分子，其特征在于，所述shRNA包括正义链和反义链，以及连接正义链和反义链的茎环结构，所述正义链和反义链互补，且所述正义链序列包含与人RRS1基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列。

8.根据权利要求7所述核酸分子，其特征在于，所述正义链核苷酸序列包含与如SEQ ID NO：1-5任意一项所示的核苷酸序列相同的RNA序列。

9.根据权利要求8所述核酸分子，其特征在于，所述正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：11-15所示。

10.根据权利要求7所述核酸分子，其特征在于，所述茎环结构的序列如SEQ ID NO：16-23任意一项所示。

11.一种抑制人RRS1基因的重组载体，其特征在于，包含能转录出权利要求3-10任意一项所述核酸分子的序列以及载体，所述序列嵌入载体中。

12.根据权利要求11所述重组载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。

13.根据权利要求12所述重组载体，其特征在于，所述慢病毒载体包含启动子和/或编码被检测到的标记物的核苷酸序列。

14.一种抑制人RRS1基因的慢病毒，其特征在于，由权利要求11所述重组载体经细胞包装后获得。

15.权利要求3-10任意一项所述核酸分子、权利要求11-13任意一项所述重组载体或权利要求14所述慢病毒在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

16.根据权利要求15所述应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。

17.一种预防或治疗肿瘤的药物，其特征在于，包含权利要求3-10任意一项所述核酸分子、权利要求11-13任意一项所述重组载体或权利要求14所述慢病毒，以及药学上可接受的赋形剂。