CN104774851A - 春化基因Vrn-D1c、其鉴定引物及Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c及其鉴定引物和鉴定方法。鉴定Vrn-D1c基因型小麦的特异性引物对为：5’- CGACCCGGGCGGCACGAGTG -3’和5’- AGGATGGCCAGGCCAAAACG -3’；以待测小麦的基因组DNA为模板，用该引物进行PCR扩增，检测出扩增产物中出现786bp条带的为Vrn-D1c基因型小麦，反之则不是。本发明鉴定引物可应用于鉴定Vrn-D1c基因型小麦和小麦分子标记辅助选择育种等方面，可直接在分子水平上进行Vrn-D1c基因型的检测，对小麦发育基因的改良及优良品种的培育起到重要作用。

Description

春化基因Vrn-D1c、其鉴定引物及Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种与小麦开花和抽穗相关的基因，尤其涉及一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c、其鉴定引物及Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法。

背景技术

春化基因是决定小麦全生育期进度的重要基因，春化作用决定着小麦的开花期和抽穗期，对小麦在不同环境条件下的适应性具有显著的影响。对春化基因的研究一直是植物遗传研究的一个重要课题，特别是近年来植物基因组学的发展及新的高精度高通量分子生物学技术手段的应用，使得对植物的春化基因研究取得了巨大的进展。目前研究表明，春化作用的主效基因被定位在5号染色体的长臂上【Law, C.N., Worland, A.J., Giorgi, B. (1975). The genetic control of ear-emergence time by chromosomes 5A and 5D of wheat. Heredity. 36, 49-584；Yan, L., Loukoianov, A., Tranquilli, G., Helguera, M., Fahima, T., Dubcovsky, J. (2003). Positional cloning of the wheat vernalization gene VRN1. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 6263-6268】，并已经相继发现了多个春化作用主效基因等位变异类型，不同变异类型之间对春化作用的贡献也有明显差异，对开花期和抽穗期的影响也有明显的差异。产量是小麦育种中最为重要的育种目标，而产量不仅仅受与产量性状直接相关的基因所调控，而且还受到与小麦生育期和成熟期相关基因的影响。冬小麦品种需要春化处理才能够正常的开花和成熟，开花期和抽穗期的早晚影响着小麦的适应性和产量，因此，挖掘不同春化作用等位变异基因能够对小麦育种提供重要的信息。

而之前多项研究也均表明，春化作用的发现维持在DNA水平，不同等位变异主要是由于基因片段的插入、缺失和SNP，一般直接利用PCR技术直接用于鉴定和分析等位变异类型，因此，进一步明确该等位变异类型的分子机制，并开发相应的分子标记，从而使用分子标记筛选的方法进行性状改良将会大大加快我国的小麦育种进程。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c、其鉴定引物及Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法，本发明鉴定引物可用于鉴定该春化基因型小麦和小麦分子标记辅助选择育种等方面，可直接在分子水平上进行该春化基因型的检测，对小麦发育基因的改良及优良品种的培育起到重要作用。

为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：

分离鉴定出了一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

设计一种上述春化基因Vrn-D1c的检测引物，包括以下引物对：

上游引物：5’- CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3’；

下游引物：5’- AGGATGGCCAGGCCAAAACG-3’。

设计一种Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法，包括以下步骤：

1）以待测小麦的基因组DNA为模板，用上述检测引物进行PCR扩增；

2）检测所得扩增产物，出现786bp条带的待测小麦为Vrn-D1c基因型小麦，该小麦的基因组DNA中具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其启动子上游-601bp位点有174bp片段的插入，即SEQ ID NO.1的第157～330bp所示核苷酸序列；检测所得扩增产物，出现约612bp的条带的待测小麦为非Vrn-D1c基因型小麦，其基因组DNA中具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

对于上述的鉴定方法，所述PCR扩增中的反应体系由以下试剂组成：1.5mmol/L（终浓度）MgCl₂，0.3mmol/L（终浓度）dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5U Taq酶，加1×PCR缓冲液定容至25μL。

对于上述的鉴定方法，所述PCR扩增中反应程序为：先95℃预变性5min，然后94℃变性60s、58℃退火60s、72℃延伸1min，如此进行35个循环；最后，72℃延伸10 min。

对于上述的鉴定方法，所述扩增引物的检测方法为：取所得扩增产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统扫描成像并用计算机进行分析。

本发明的积极有益效果：

本发明公开了一个能导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c及其在小麦产量性状改良中的应用，含有Vrn-D1c基因的小麦品种主要表现在抽穗和开花较vrn-D1基因的小麦品种的早。例如，与具有vrn-D1基因的小麦品种鲁麦19相比，具有Vrn-D1c基因的小麦品种豫农876在春化条件下抽穗和开花早1.0天和0天，在未春化条件下抽穗和开花早44天和46天。因此，Vrn-D1c基因功能的发现能对利用基因工程技术改良小麦农艺性状和培育高产小麦品种起到十分重要作用，同时也有助于产量性状的遗传和分子生物学的进一步研究。

本发明提供的鉴定方法可以应用于高产小麦新品种培育和优异种质资源的创制，实现早期筛选，节省时间和资源。

附图说明

图1为本发明鉴定方法中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，从左向右，第1泳道为DNA ladder DL2000，第2、3和4泳道为小麦品种新麦18，第5和6泳道为小麦品种双吉2号，第7和8泳道为小麦品种双吉4号，第9为小麦品种京双16，第10泳道为小麦品种鲁麦14，第11泳道为DNA ladder DL2000；左右箭头依次为Vrn-D1c基因和vrn-D1基因。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不局限于下述具体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。

小麦材料为来自黄淮麦区的205份有代表性的当地大规模种植的普通小麦品种和高代品系，具体如下（ZM编号为国家种质资源库编号）：

新麦18：河南农业大学；参考文献：张清海、王志和、张桂兰，黄淮南片小麦申请推广品种及其选育，中国农业科技出版社，2000：1-401。

山农413863：河南农业大学；参考文献：马东钦、王晓伟、许兰杰、朱有朋、詹克慧、王冬梅，黄淮麦区部分小麦种质资源中矮秆基因的分布，河南农业大学学报，2009，43（2）。

鲁麦19：河南农业大学；参考文献：曹学昌，旱地小麦新品种鲁麦19号的选育及配套技术，山东农业科学，1993，4：23-23。

晋麦50：河南农业大学；参考文献：刘新月、张久刚、卫云宗，优质抗旱小麦新品种晋麦78号的选育，山西农业科学，2007，4：35-37。

偃展4110：河南农业大学；参考文献：邵玉华，播期、密度、施肥对偃展4110产量形成及产量的影响，安徽农学通报，2008，14：74-75。

豫农202：河南农业大学；参考文献：孙继冰，小麦新品种豫农202最佳播期研究，种业导刊，2009，6：20-21。“豫农202”为河南农业大学农学院小麦分子育种室2007年育成的小麦品种。

实施例1  不同品种小麦性状的调查

每年4～6月田间调查每个品种的抽穗期和开花期，结果为3年数据。调查结果见表1(表中，HD为抽穗时间，FD为开花时间)。

表1 小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表

。

表1续1 小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表

。

表1续2 小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表

。

表1续3 小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表

。

表1续4 小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表

。

实施例 2  应用特异性引物鉴定Vrn-D1c基因型小麦

5个小麦品种：新麦18、双吉2号、双吉4号、京双16和鲁麦14

每个品种的小麦取一粒种子，按照常规方法（Chen等，2011）提取小麦籽粒基因组DNA作为模板，用特异性引物进行PCR扩增。

特异性引物对如下：

上游引物：5’- CGACCCGGGCGGCACGAGTG -3’（ SEQ ID NO.3）；

下游引物：5’- AGGATGGCCAGGCCAAAACG -3’（ SEQ ID NO.4）。

    PCR反应体系的组成：1.5mmol/L MgCl₂，0.3mmol/L dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5U Taq酶，加1×PCR缓冲液（含10 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，50mmol/L KCl，1.0% Triton X-100）定容至25μL。

PCR反应程序：先95℃预变性5min；然后94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃延伸10 min。

PCR扩增结束后，取上述五种PCR扩增产物各10μL分别进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（采用1×TAE缓冲液；溴化乙锭（EB）染色，160V，0.5小时），电泳结束后用凝胶成像系统（MultiGenius Gel Documentation and Analysis System）扫描成像并用计算机进行分析，扩增电泳图见图1。

分析结果表明：4个小麦品种（双吉2号、双吉4号、京双16和鲁麦14）得到612bp的条带，为非Vrn-D1c基因型小麦，而小麦品种新麦18得到一条约800bp的条带。

对小麦品种新麦18得到的约800bp的条带连接pGEM-T载体，并进行测序验证，将测序结果与野生型5D染色体上的vrn-D1序列（NCBI编号：AY747606）进行比对，结果表明，小麦品种新麦18的vrn-D1位点均有174bp片段的插入，根据Fu等（2005）、Yan等（2004, 2006）和Chen等（2013）命名法，小麦品种新麦18属于Vrn-D1c基因型。

实施例3

采用实施案例2相同方法分别对山农413863、豫农876、偃展4110和豫农202进行鉴定，结果表明：偃展4110和豫农202扩增产物出现612bp条带，为非Vrn-D1c基因型小麦；山农413863和豫农876扩增产物出现约786bp的条带，其为Vrn-D1c基因型小麦。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南农业大学

<120>  春化基因Vrn-D1c、其鉴定引物及Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法

<130>  /

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  12777

<212>  DNA

<213>  小麦基因

<400>  1

gagtgcacgc tgcgcccgcc cgaccgcagc cgacctccca aacgggacaa gcgagacggc       60

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aggcgcaagg gacatctatg agacggccaa gatctgaggg aagaagacga gggatgtcaa     6600

acaagtcaaa tgcatcaagg atagagcaga tcaactccta gtgaaggaca aggagttcaa     6660

gcatagatgg cgggagtact ccgacaagct attcaatgga gagaatgaga gctctagcat     6720

tgagctctac gactcctttg atgatgcccg cagacattgt atgtgatgaa tctaggatgg     6780

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ggcctctaga aactttcgtg catagcagac agttaaaaca tgctaatgat gtaacagagg     6960

ttggtgtagt ccaaacttga catgggagga gtccctaaag agagatcgga agactgaagt     7020

atcacaaaga actagtcatg gacaggggtg catggaagtt agctatccac acgccaaaac     7080

cataagttgg tttcgagatt ttacgggttt cagctctacc ctacccaact tatttgggac     7140

taaaggcttt gttgttgttg ttgtatctct tgccttggtc ttagcaattt aacatgtgca     7200

tgttttttct tggaaggcaa aattgaatgc caagtttttc ctgaagttgt acattgtaca     7260

aattgatgtc tacaaattga tgtccttact ccatggcaca tcagttttcc cgtcgtatga     7320

tgatgcaaca atgaggtctt catggctcct gtcgccatat ctcttttagc tcgctccata     7380

cacgatcttg tggcctccat atttggaggt tcgggaggtc cagtatggag ctcgccccaa     7440

aaccaaccgc caacgtgggg tggaagtttt aagcttcctt ctgccgcctc ccgtcggatt     7500

tgaagcagct cggcctcgca cagaccacca gtgaccgaca cctgaccatt aatgccatgc     7560

ctgcgtcctc agattcttat ggcggtccat cggatggctg ccatgtggca ccatttcctt     7620

gcttgcgtgt gagcagattg aaggcgtgcg agtaggtcgc tgcagcgttt ctcacaggga     7680

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ggtgtctggg gcggcctgta aaaggtcggt gccctctgct ctcgcttcaa tcctatcttc     7800

gacgcctttt atccaatctc acacgcctcc aatccaccac cccttttgtc gtccacggca     7860

catccggagg agctctctct cgtcttcaat ttttggcatg aggtggagga gtagcccgcg     7920

gatcctttgg ccccctttag ggactagatg gacctagtcc tggaggaggc tgcgcagatg     7980

gaagcacaaa cggagcagca gatttgggcg ctagcacact cccgccgccg cggatgaatg     8040

gccggcctgg gactagatgg acctagtcct ggaggaggct gcgcagatgg aagcacaaac     8100

ggagcagcag atttgggcgc tagcacactc ccaccgccgc ggatgaatgg ccggcctggg     8160

acgacatcgc cgaggcgcat ttccaagtca tcgtggccaa cattgtcgca ttttacgcag     8220

gtggtggcag tggtcgtggc cgcaactagt ttaactaatt attaggcgtt ctatgaatgt     8280

aattcacatg tgactagtgt ttcgcccctg tttaggaatg aaatcgatgc ttctgaacca     8340

gttcaatgtg tttgttggat tttttttgga gaagaacatg tgacccaatg acaggtgggt     8400

cctactcgta gggcacgact ctctgtttgc gctttggata ggcatcctcc atatccatat     8460

ggagcgcatc aacgtggtga ctctgctaca gttgctctta cacacctcga tatgcaacat     8520

agctcaccat acttgatata cgtttagcca tccaatgatt gatcaattgg gtgttggtag     8580

aaggctagaa gcagagtcca tgccaaacca ctatgttaaa tgcctgacac acgggtcttt     8640

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ggatcacctt actatgtgca taatttcttt tcacatggga atttatgtgc tttggcattc     8760

aaagctttca tttgaaaatt tgctctacca cctatatttg taccgacaat acctctgcat     8820

gggcccacac attaggtttt aaaatggttg ttgtgttcgt gttgtcctac ttatctaggc     8880

atggctcttg cctagataac tgttgttggt cacacactta tatattatcg gtttgtgagt     8940

ctagttgatt ggataggtga gttgtttcac actcttgaac tgattttgac ttgatgacca     9000

ttgtaaccat ttgcaggtta taggttagca catagttcaa cactataact aattgttggt     9060

tcattccatg ttgcttaaaa tttgcctact ataggttata gggtagcgtc tgacaatttt     9120

ctgtgtgttg tgggtacttg tgtgacaact gaggacacga tgtttgtggt gaaagagaac     9180

acgttgacct ccacaaatag ttaggatgct gggtgaagcc tacgggaaga cagggagaag     9240

gtataggagg agaataacac gaggggtaat aagttaatga cttaaataca acagcaagga     9300

acatttctta aactgaagct ctagtgctat agttacatat atacttacct tgcctagcac     9360

aatcccatcc gaaacttctg ttttgctcat tttgttgagt ctatagacag aagaaaaggg     9420

tcactctatt ttcccaacaa aacttgaaca acaccagaac cttattgaag tcagtttcgt     9480

gttctttcta gctttgttgt atcttaccta tcatttacat catggtcaca gtgaaatgct     9540

ttgcaaacat attgaccaga tgctgtatac catatttgaa tctcatttgc atacgccgac     9600

atgaaacaac gtattacaaa aaagcttccg atatgtcaaa atgtatcata tatcaattct     9660

tgaaattgtg catatactgg acatagttaa tcttgtttac atgtacttcc aatgactaga     9720

tatttctttc tcttatgcag tatggacaaa attcttgaac ggtatgagcg ctactcttat     9780

gcagaaaagg ttctcgtttc aagtgaatct gaaattcagg taaaaatgaa aagcaaatgg     9840

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tggactgagg tccatttgat tctcctgtaa cttattagta gtttgtcttt gatgaatgct    10020

taggcatggt tgaataatgt aaccaaatac cacttgacca atttactttc atggctactg    10080

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tgactttaag tgttactaaa ttagtacgta gtaaactgca atgcatggct agatcagcaa    10200

ttctggatta gccggctgag ttttcgaagg gcttagcaac aaaaaatgac aagcgtatat    10260

attataatgg gtttaaaata ctatgtgtgc atcagtgaca atcacaatat tttgattgaa    10320

ataacaaaat gctttcctag attattaaga cttattacta gattggtcat tgatcttaag    10380

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tctatctgat tgacgacaaa cagattcagc atgtacatta gttctcatct ccaagttttc    10740

tgtattgttt gcgatattgc tgcagtttct tattacagct tgtctaaggc taaccatcta    10800

ggataaaaag tagatccttc agacttagaa gatccagtta ggctcaatat tcttattttt    10860

gtaactcaga gctccaggac ctcactttaa ttttttggcc aatttttgta caaaccaagt    10920

tgtagctcca attgagagat ccaaccagtt ctatctgatt gctgacaaac agattcagca    10980

tgtacatatg acgaggacta ttgaaacatg taattactaa cccaaaaaat attcctaatt    11040

tattttgtaa tatttacctc cactgcagca tttttaatat tacgagatat gatttttaca    11100

tctgatagta acacttgttg cggtgacaca attgatttta agttccgaaa atttaagttc    11160

actacacaga acaatccttc ctgatttatg ccccctggtg tcaatgttgt taaagtctct    11220

ttgttccttt ctgaactaac tcagcctatt tgtaccattt ccgtcatggt tccttcctgt    11280

tccactcaaa gttagtaatg caattgttat ttgcttgtgc agggaaactg gtgtcacgaa    11340

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attatggttg attgccagta tattatatac actctgaaga taaatgggac tgaatttcta    11460

catcctgcac ctgcaggcat ctgatgggag aggatcttga atctttgaat ctcaaggagt    11520

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tgacttaaat gatttgtaca gcaacacttt ttatataaaa aaaaaacact tgcagagaag    11640

ttcagcaaag tatatctgaa gtcagattct agactgagat attcacaata tgtatatgca    11700

ttttagtcat atgctcttca tagttaaaaa atgactattt ttttcttttt tttgtacttg    11760

cagaaccaac ttatgcacga atccatttct gagcttcaga agaaggtaag ctgccaacct    11820

tgcatacctg aaccggtatt cgaactggtc aacttgtcag gaaatcttag cttacttgtt    11880

tcaagttttg tgacattata acatgtatgc aagtaactgg tctacttgca cgaaacctca    11940

ttacatcgtt cttgctgcag gagaggtcac tgcaggagga gaataaagtt ctccagaagg    12000

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tattgacaca gatccctgtc ccttccccac agctcgtcga gaagcagaag gcccaggcgg    12120

cgcaacaaga tcagactcag cctcaaacaa gctcttcttc ttcttccttc atgatgaggg    12180

atgctccccc tgccgcagct accaggtgat gatgtacatc acaagtctat tcctattcag    12240

agttcaagga accatctttt gaattggtcg ggttgttcct tgcagcccac tttttgtctg    12300

aatatgcagt cctgtcgggc cacatttaag taacaaaata ctaacatact tgtgttcact    12360

ttggttgtgc agcattcatc cagcggcggc aggcgagagg gcaggggatg cggcagtgca    12420

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gtctggtgta tgttgcggtt gctagcacgc ctgacccctt ggaggggaaa ggaaaagaaa    12600

tcagagtaaa gtagcaagct gcagcgatgt gtatatttca ctttgtccac cccagtttcc    12660

ctcccagctg ggctcaattt accatgtaat ctatatgtag cttgagtgat gaattttcaa    12720

gtttccatga tacccgtctc tagtgggatg ttgtttatgt gaattaacct atcaaat       12777

 

<210>  2

<211>  12491

<212>  DNA

<213>  小麦基因

<400>  2

gagtgcacgc tgcgcccgcc cgaccgcagc cgacctccca aacgggacaa gcgagacggc       60

ccaaaacaag caaggaaagc agcctcctac tgtggcagcc cgcccccacg accgtcatct      120

cgccttccat tccatttccc tggacggacc agacccgctc tttcccttct actaggcata      180

gggtacagta gaatagtata aaaggaaaat tgtgctcttt ttttgctctg tggtgtgcgt      240

ttgtggcgag agaaaatgat ttggggaaag caaaatcggg agattcgcac gtacgatcgt      300

tcgacacgtc gacgccgggc gggcccgggg tggggcatcg tgtggctgca agaccgcggg      360

gccccgcggg gcgggccggg ccaatggatg ctcgacagcg gctatgctcc agaccagccc      420

ggtattgcat accgcgctcg gggccagatc cctttaaaaa cccctccccc cctgccggaa      480

ccctcgtttt ggcctggcca tcctccctct cctccccctc tcttccaacc acctgacagc      540

catggctccg ccccctcgcc tccgcctgcg cctgtcggag tagccgtcgc ggtctgccgg      600

tgttggaggg taggggcgta gggttggccc ggttctcgag cggagatggg gcgcgggaag      660

gtgcagctga agcggatcga gaacaagatc aaccggcagg tgaccttctc caagcgccgc      720

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atcatcttct ccaccaaggg aaagctctac gagttctcca ccgagtcatg gtaaattaag      840

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tctggcccag cggacgaccc ggccgacccc agggccttct ccatttccgc cggggctgtt      960

tggttgattc cgtttgctcg ctcgctgttt ccatccgatt ctgccgtggc tgcttgctcg     1020

tttttcttag aatcgatggg ggagttagcg ttccgcgcgg ccgcgatttc tggctatggg     1080

ggtagggcgt gcgatgggtc gccgcgctat tttatgctcc gccagcgccg ggaaggttgt     1140

tcatctggcg tattttgggg aaattttggt cccggaggcg ccaggtggca ccccaagtgg     1200

aaaggttagg acggtaatct cttgatattt ttatcgggct ggggatattt acgtaaaaaa     1260

attatatggg gttaaagtga catcacaatt tagcatgcta cctcgtcttc tcatttggaa     1320

tcttactaga cgctacaata cctggttgtc tgcctcatca aatccgtgct tgctgcttga     1380

acaaatgaac ctcgtcatct cggttatttc cagaattttg ttccacaggc tttgctatca     1440

ttcgaattgc tagctccggc cttgcggcca ttttgttgat tgcttggaga tactgtctac     1500

ggtacgcgcg gagacaagag tcacttgact agctaatgca tggaataatt gtctgcagcc     1560

gatgaaactc cggcatgaag agtcaaacca aaaagtagag agtttcttcc aattaaaaaa     1620

tgagagtttc tgcagacctt ttccctttga accgtcttag tttgcctgtt atatttgttg     1680

gtgctggcga tggttcttga caaagtaaag gagtcaataa aatcacggag actgatccat     1740

tctttccccc acacgctgac attagtccat gttagttatc catttctgcc tgcttccata     1800

aatcccgtcc cgcgtagtac tagatcaacc tgcacggttt caaactaaga aatatcatac     1860

catcggaagg accgctactg cttagtaaat atccattgtt gtttgtaatc ttgctgagaa     1920

agcaacatta ccatttgctt catggcaagg acctgtatgt tgaggtgcta aatctcttct     1980

ggttctgtac cactgagggt atgagtggcg ctaatggaaa agggtaagca aagtttgatc     2040

ggcttacctt cagcctcctt ggttgtttga cgcataggtg cttgcatgca tgtatcaagc     2100

tggtcacgtg atgaaaacgc gtaagaatca aagtcagtta aattaagata taaacagatg     2160

cagtcatatt ttaagctagt gctgcactga acttcagtat ctcagatcaa agaattgaat     2220

aatgctaccc cctgtttctg tgctgttcag ttggaaaaga ctgccatgaa catccaaatt     2280

ggtagccatg catttatcag cttgccggct ttattttctt cgctctcgtt ccttttcatt     2340

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cctcaatctc cttatcagtc ggttaattta ccacacttaa caaaggtcca aagctgacat     2760

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agtccacaaa cgacatatag acaatcacct agaaccgtta tttagacttt atatctgctc     3060

attacatgta ttaaatccat gaaatagtgg aagctgaata ggcatacgat atagttgaag     3120

ctcgacagat gacttaataa gtgtcatatc tattaaccat ttcacatatt tttacatttt     3180

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gcacgtacat gtaagcagat cctatcgact tccgtggatc cgctgatgga atcgccctca     3300

ggatttcacg gcatagtctt gatatgtcac gaactagttg ttagtttatt tatttatttt     3360

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gtcgtctatg tgttattttt ctccacataa atagttcacc cccccccccc ccccacacac     5280

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ctagttgaag ctattagata attggacaca tgtatagaca cgatggatgg gaaatatcgt     5460

aggtaccact aaccatgtac taaagtaggg acctaaaaca tcttatatta gcttacaaat     5520

ttagtagtta ttacgaagaa gaaacattgt ttcagatgcc tacacccatt gtttttaagg     5580

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ctcaattcta cttcttagaa ctctctaagg catcaccttg cctaatgcct tagcgcttag     6060

gcagtgaggc accccctccc ccagcgcctt gcctcgcctt accaccttta aaacattgcc     6120

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gcaacgcgag cagtgagtga atcatgggat cgggcatatg aggacctcta ccagcgctga     6240

ggggtcggga aggaaggcgc aagggacatc tatgagacgg ccaagatctg agggaagaag     6300

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atgtagagtt ggggtagcat cgattgaagg gaagcttgtc gaacgtctaa gatggcttgg     6600

atatatacaa agtaggcctc tagaaacttt cgtgcatagc agacagttaa aacatgctaa     6660

tgatgtaaca gaggttggtg tagtccaaac ttgacatggg aggagtccct aaagagagat     6720

cggaagactg aagtatcaca aagaactagt catggacagg ggtgcatgga agttagctat     6780

ccacacgcca aaaccataag ttggtttcga gattttacgg gtttcagctc taccctaccc     6840

aacttatttg ggactaaagg ctttgttgtt gttgttgtat ctcttgcctt ggtcttagca     6900

atttaacatg tgcatgtttt ttcttggaag gcaaaattga atgccaagtt tttcctgaag     6960

ttgtacattg tacaaattga tgtctacaaa ttgatgtcct tactccatgg cacatcagtt     7020

ttcccgtcgt atgatgatgc aacaatgagg tcttcatggc tcctgtcgcc atatctcttt     7080

tagctcgctc catacacgat cttgtggcct ccatatttgg aggttcggga ggtccagtat     7140

ggagctcgcc ccaaaaccaa ccgccaacgt ggggtggaag ttttaagctt ccttctgccg     7200

cctcccgtcg gatttgaagc agctcggcct cgcacagacc accagtgacc gacacctgac     7260

cattaatgcc atgcctgcgt cctcagattc ttatggcggt ccatcggatg gctgccatgt     7320

ggcaccattt ccttgcttgc gtgtgagcag attgaaggcg tgcgagtagg tcgctgcagc     7380

gtttctcaca gggagacgcg ccctttgact accccacatt agctgcctcc cgcctcccca     7440

agtgcctcgc tagtggtgtc tggggcggcc tgtaaaaggt cggtgccctc tgctctcgct     7500

tcaatcctat cttcgacgcc ttttatccaa tctcacacgc ctccaatcca ccaccccttt     7560

tgtcgtccac ggcacatccg gaggagctct ctctcgtctt caatttttgg catgaggtgg     7620

aggagtagcc cgcggatcct ttggccccct ttagggacta gatggaccta gtcctggagg     7680

aggctgcgca gatggaagca caaacggagc agcagatttg ggcgctagca cactcccgcc     7740

gccgcggatg aatggccggc ctgggactag atggacctag tcctggagga ggctgcgcag     7800

atggaagcac aaacggagca gcagatttgg gcgctagcac actcccaccg ccgcggatga     7860

atggccggcc tgggacgaca tcgccgaggc gcatttccaa gtcatcgtgg ccaacattgt     7920

cgcattttac gcaggtggtg gcagtggtcg tggccgcaac tagtttaact aattattagg     7980

cgttctatga atgtaattca catgtgacta gtgtttcgcc cctgtttagg aatgaaatcg     8040

atgcttctga accagttcaa tgtgtttgtt ggattttttt tggagaagaa catgtgaccc     8100

aatgacaggt gggtcctact cgtagggcac gactctctgt ttgcgctttg gataggcatc     8160

ctccatatcc atatggagcg catcaacgtg gtgactctgc tacagttgct cttacacacc     8220

tcgatatgca acatagctca ccatacttga tatacgttta gccatccaat gattgatcaa     8280

ttgggtgttg gtagaaggct agaagcagag tccatgccaa accactatgt taaatgcctg     8340

acacacgggt ctttatctag ttcctttttg acatgcacct tagtgtgtta ttttctaggg     8400

ttgcctcacc attgggatca ccttactatg tgcataattt cttttcacat gggaatttat     8460

gtgctttggc attcaaagct ttcatttgaa aatttgctct accacctata tttgtaccga     8520

caatacctct gcatgggccc acacattagg ttttaaaatg gttgttgtgt tcgtgttgtc     8580

ctacttatct aggcatggct cttgcctaga taactgttgt tggtcacaca cttatatatt     8640

atcggtttgt gagtctagtt gattggatag gtgagttgtt tcacactctt gaactgattt     8700

tgacttgatg accattgtaa ccatttgcag gttataggtt agcacatagt tcaacactat     8760

aactaattgt tggttcattc catgttgctt aaaatttgcc tactataggt tatagggtag     8820

cgtctgacaa ttttctgtgt gttgtgggta cttgtgtgac aactgaggac acgatgtttg     8880

tggtgaaaga gaacacgttg acctccacaa atagttagga tgctgggtga agcctacggg     8940

aagacaggga gaaggtatag gaggagaata acacgagggg taataagtta atgacttaaa     9000

tacaacagca aggaacattt cttaaactga agctctagtg ctatagttac atatatactt     9060

accttgccta gcacaatccc atccgaaact tctgttttgc tcattttgtt gagtctatag     9120

acagaagaaa agggtcactc tattttccca acaaaacttg aacaacacca gaaccttatt     9180

gaagtcagtt tcgtgttctt tctagctttg ttgtatctta cctatcattt acatcatggt     9240

cacagtgaaa tgctttgcaa acatattgac cagatgctgt ataccatatt tgaatctcat     9300

ttgcatacgc cgacatgaaa caacgtatta caaaaaagct tccgatatgt caaaatgtat     9360

catatatcaa ttcttgaaat tgtgcatata ctggacatag ttaatcttgt ttacatgtac     9420

ttccaatgac tagatatttc tttctcttat gcagtatgga caaaattctt gaacggtatg     9480

agcgctactc ttatgcagaa aaggttctcg tttcaagtga atctgaaatt caggtaaaaa     9540

tgaaaagcaa atggtttgct ttcctttagc tatgaagtaa atttttgccg atatcagatg     9600

atctgaaatt tattagtagg ccactatatt ttgaatgatt tccatgagct atgaatttaa     9660

ttgacttgca actatggact gaggtccatt tgattctcct gtaacttatt agtagtttgt     9720

ctttgatgaa tgcttaggca tggttgaata atgtaaccaa ataccacttg accaatttac     9780

tttcatggct actgaactag actagcgtgc tgattcctac atactgcctt tgcgagaact     9840

agaaaaatgt gatctgactt taagtgttac taaattagta cgtagtaaac tgcaatgcat     9900

ggctagatca gcaattctgg attagccggc tgagttttcg aagggcttag caacaaaaaa     9960

tgacaagcgt atatattata atgggtttaa aatactatgt gtgcatcagt gacaatcaca    10020

atattttgat tgaaataaca aaatgctttc ctagattatt aagacttatt actagattgg    10080

tcattgatct taagttctta agatcaaccg ttgaatctcc agaccttccg atcgtattat    10140

gctgctaatg gccattaagg ataaccccat gacattagtt ctcatctcca atttttctgt    10200

attgtttgcg atattgctgc agtttcttat tacagcttgt ctaaggctaa ccatctagga    10260

taaaaagtag atcctgcaga cttagaagat ccagttaggc tcaatattct tatttttgta    10320

actcagagct ccaggacctc acgccaattt ttgtacaaac caagttgtag ctccaattga    10380

gagatccaac cagttctatc tgattgacga caaacagatt cagcatgtac attagttctc    10440

atctccaagt tttctgtatt gtttgcgata ttgctgcagt ttcttattac agcttgtcta    10500

aggctaacca tctaggataa aaagtagatc cttcagactt agaagatcca gttaggctca    10560

atattcttat ttttgtaact cagagctcca ggacctcact ttaatttttt ggccaatttt    10620

tgtacaaacc aagttgtagc tccaattgag agatccaacc agttctatct gattgctgac    10680

aaacagattc agcatgtaca tatgacgagg actattgaaa catgtaatta ctaacccaaa    10740

aaatattcct aatttatttt gtaatattta cctccactgc agcattttta atattacgag    10800

atatgatttt tacatctgat agtaacactt gttgcggtga cacaattgat tttaagttcc    10860

gaaaatttaa gttcactaca cagaacaatc cttcctgatt tatgccccct ggtgtcaatg    10920

ttgttaaagt ctctttgttc ctttctgaac taactcagcc tatttgtacc atttccgtca    10980

tggttccttc ctgttccact caaagttagt aatgcaattg ttatttgctt gtgcagggaa    11040

actggtgtca cgaatatagg aaactgaagg cgaaggttga gacaatacag aaatgtcaaa    11100

agtaatttgt aatgattatg gttgattgcc agtatattat atacactctg aagataaatg    11160

ggactgaatt tctacatcct gcacctgcag gcatctgatg ggagaggatc ttgaatcttt    11220

gaatctcaag gagttgcagc aactggagca gcagctggaa agctcactga aacatatcag    11280

atccaggaag gtactgactt aaatgatttg tacagcaaca ctttttatat aaaaaaaaaa    11340

cacttgcaga gaagttcagc aaagtatatc tgaagtcaga ttctagactg agatattcac    11400

aatatgtata tgcattttag tcatatgctc ttcatagtta aaaaatgact atttttttct    11460

tttttttgta cttgcagaac caacttatgc acgaatccat ttctgagctt cagaagaagg    11520

taagctgcca accttgcata cctgaaccgg tattcgaact ggtcaacttg tcaggaaatc    11580

ttagcttact tgtttcaagt tttgtgacat tataacatgt atgcaagtaa ctggtctact    11640

tgcacgaaac ctcattacat cgttcttgct gcaggagagg tcactgcagg aggagaataa    11700

agttctccag aaggaagtaa gcccgttgtc accttatggt ccaaccggtc taaattgttt    11760

cgtatagcaa attttattga cacagatccc tgtcccttcc ccacagctcg tcgagaagca    11820

gaaggcccag gcggcgcaac aagatcagac tcagcctcaa acaagctctt cttcttcttc    11880

cttcatgatg agggatgctc cccctgccgc agctaccagg tgatgatgta catcacaagt    11940

ctattcctat tcagagttca aggaaccatc ttttgaattg gtcgggttgt tccttgcagc    12000

ccactttttg tctgaatatg cagtcctgtc gggccacatt taagtaacaa aatactaaca    12060

tacttgtgtt cactttggtt gtgcagcatt catccagcgg cggcaggcga gagggcaggg    12120

gatgcggcag tgcagccgca ggccccaccc cggacggggc ttccactgtg gatggtgagc    12180

cacatcaacg gctgaagggc ttccagccca tataagcgta ctattcagta gagagtaaca    12240

agttgcaccg gccagtctgg tgtatgttgc ggttgctagc acgcctgacc ccttggaggg    12300

gaaaggaaaa gaaatcagag taaagtagca agctgcagcg atgtgtatat ttcactttgt    12360

ccaccccagt ttccctccca gctgggctca atttaccatg taatctatat gtagcttgag    12420

tgatgaattt tcaagtttcc atgatacccg tctctagtgg gatgttgttt atgtgaatta    12480

acctatcaaa t                                                         12491

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cgacccgggc ggcacgagtg                                                   20

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

aggatggcca ggccaaaacg                                                   20

Claims (7)

1.一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述春化基因Vrn-D1c的检测引物，包括以下引物对：

上游引物：5’- CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3’；

下游引物：5’- AGGATGGCCAGGCCAAAACG-3’。

3.一种Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法，包括以下步骤：

1）以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2所述检测引物进行PCR扩增；

2）检测所得扩增产物，出现786bp条带的待测小麦为Vrn-D1c基因型小麦；检测所得扩增产物，不出现786bp条带的待测小麦为非Vrn-D1c基因型小麦。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增中的反应体系由以下含量的原料组成：1.5mmol/L MgCl₂，0.3mmol/L dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5U Taq酶，加1×PCR缓冲液定容至25μL。

5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增中反应程序为：先95℃预变性5min，然后95℃变性60s、58℃退火60s、72℃延伸1min，如此进行35个循环；最后，72℃延伸10 min。

6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述扩增引物的检测方法为：取所得扩增产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统扫描成像并用计算机进行分析。

7.一种Vrn-D1基因型小麦的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2所述检测引物进行PCR扩增；

2）检测所得扩增产物， 出现612bp条带的待测小麦为vrn-D1基因型小麦。