CN104761622A - 关于Jaggedl激动剂多肽及其应用 - Google Patents

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罗瑞雪
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本发明关于Jaggedl激动剂多肽及其应用，涉及药物领域，具体涉及具有促进Jaggedl与Notch的结合，治疗恶性肿瘤的多肽。其序列为NSFTDDCRRSDGHCRRELDPM，是全新的序列，它们可以在体外抑制黑色素瘤细胞和肝癌干细胞的增殖，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。

Description

关于Jaggedl激动剂多肽及其应用
技术领域
本发明涉及Jaggedl激动剂多肽及其应用，具体涉及具有促进Jaggedl与Notch的结合，治疗恶性肿瘤的多肽。
背景技术
肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增值维持着肿瘤细胞群的生命力；肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。
研究发现，肿瘤干细胞中Notch信号表达比正常细胞高，抑制Notch活性后虽然还有有活性的肿瘤干细胞，但已经不能形成肿瘤.而对照组的肿瘤下细胞能够形成肿瘤，并且抑制Notch活性后肿瘤下细胞数量明显降低。所以Notch信号在肿瘤干细胞形成肿瘤过程中能够降低肿瘤干细胞向恶性肿瘤转变的能力。
Jaggedl是在哺乳动物中Notch信号转导通路的配体，Jaggedl和相邻细胞的Notch结合后，Notch被蛋白酶体切割，释放出具有核定位信号的胞质区ICN(intracellular domain of Notch)，进入细胞核与CLS(一类DNA结合蛋白)结合，调节基因表达。提高Jaggedl与Notch的结合亲和力，促进Jaggedl与Notch的结合，可以有效降低肿瘤干细胞的活性，抑制肿瘤的生长，从而达到治疗肿瘤的效果。
目前，没有成熟开发的Jaggedl激动剂多肽问世，用于治疗恶性肿瘤。
本专利中的Jaggedl激动剂多肽已证明在黑色素瘤病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。
发明内容
发明目的
本发明提供全新的序列，该序列为Jaggedl激动剂，对恶性肿瘤具有很好的 疗效。
技术方案
Jaggedl激动剂多肽，其特征在于其序列为NSFTDDCRRSDGHCRRELDPM。
所述的Jaggedl激动剂多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
所述的Jaggedl激动剂多肽在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
所述的Jaggedl激动剂多肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
一种检测肿瘤的试剂盒，其含有权利要求1所述的Jaggedl激动剂多肽。 
所述的试剂盒，其特征在于还有
(1)包被液：pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液；
(2)PBS缓冲液：pH7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲液；
(3)抗体稀释液：pH7.4的0.02mol/LPBS和0.2％BSA；
(4)封闭液：pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液和2.0％BSA
(5)洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.05％Tween-20；
(6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液； 
(7)终止液：2mol/L硫酸溶液； 
(8)Notch抗体；
(9)山羊抗小鼠IgG。
有益效果
利用固相合成法化学合成Jaggedl激动剂多肽，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外促进Jaggedl与Notch的结合，治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤。我们发现的Jaggedl激动剂多肽可以同时抑制黑色素瘤细胞增殖活力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。
具体实施方式
实施例1
Jaggedl激动剂多肽对体外培养人黑色素瘤细胞的生长和存活IC50。
采用MTT比色法。将对数生长的人黑色素瘤细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物Jaggedl激动剂多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式人黑色素瘤细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实验药物的IC50为4.59μM，阳性对照药的4.43μM，显示本发明与紫杉醇有相同的治疗效果。
实施例2
Jaggedl激动剂多肽对体外培养人肝癌干细胞的生长和存活IC50。
采用MTT比色法。将对数生长的人肝癌干细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物Jaggedl激动剂多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式人肝癌干细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实验药物的IC50为6.73μM，阳性对照药的6.51μM，说明Jaggedl激动剂多肽具有显著的抑制肿瘤活性。
实施例3
用肿瘤模型检测Jaggedl激动剂多肽的体内活力。
建立黑色素瘤肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽(上海生工合成)设3个剂量：0.5、1.0、2.0mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，Jaggedl激动剂多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，5、10、20mg/Kg，及阳性组生存率达到依次为96％，89.0％，85％和56％。说明Jaggedl激动剂多肽具有良好的安全性。
实施例4 含有Jaggedl激动剂多肽的ELISA试剂盒检测 
酶连免疫吸附实验(ELISA)试剂盒包括如下试剂：
(1)包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)。称取0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml；
(2)PBS缓冲液：0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)。称取0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml；
(3)抗体稀释液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.2％BSA。称取0.2gBSA加入配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml；
(4)封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)和2.0％BSA。2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml；
(5)洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.05％Tween-20。将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀；
(6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液； 
(7)终止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98％浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存；
(8)Jaggedl激动剂多肽 
(9)Notch抗体(一抗)由上海生工合成。
(10)二抗(山羊抗小鼠IgG)购自艾美捷科技有限公司
使用方法： 
1、血清样本制备：取3只荷瘤裸鼠，进行眼眶取血，每只200μL，迅速离心12000rpm 3min，取上清，按体积比1：2加PBS，80℃水浴30min，12000rpm 3min取上清，-20℃冻存备用。。
2、Notch抗体为包被抗体，将Notch抗体溶于包被稀释液中，浓度为100μg/mL。96孔酶标板每孔加入100μL，4℃包被过夜。弃去包被液，加入封闭液200μL，37℃封闭1h。弃去封闭液，分别加入样品稀释液稀释的血清样本100μL(稀释比1：50)和Jaggedl激动剂多肽100μL(10μg/ml)及上述血清样本50μL和Jaggedl激动剂多肽50μL的混合物，分成3组，37℃孵育1h。弃去血清，PBST和自来水间隔洗涤三次。洗涤后，每孔加入样品稀释液稀释酶标二抗100μL(稀释比1：10000)，37℃孵育1h。弃去二抗，洗涤。洗涤后，每孔加入100μL底物液(50μL底物A，50μL底物B)，37℃反应30min后，加入50μL 2M H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm波长测定每孔的光密度值OD450nm。结果：Jaggedl激动剂多肽可以和Notch抗体结合，并可以竞争血清中Notch蛋白，故说明Jaggedl激动剂多肽用竞争法检测Notch，实现肿瘤预测，
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  苏州普罗达生物科技有限公司
 
<120>  关于Jaggedl激动剂多肽及其应用
 
<130> 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  21
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  1
 
Asn Ser Phe Thr Asp Asp Cys Arg Arg Ser Asp Gly His Cys Arg Arg
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Leu Asp Pro Met
            20     
 

Claims (6)

1.Jaggedl激动剂多肽，其特征在于其序列为NSFTDDCRRSDGHCRRELDPM。
2.如权利要求1所述的Jaggedl激动剂多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求1所述的Jaggedl激动剂多肽在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
4.如权利要求1所述的Jaggedl激动剂多肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
5.一种检测肿瘤的试剂盒，其含有权利要求1所述的Jaggedl激动剂多肽。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还有
(1)包被液：pH9.6的0.05mol／L碳酸盐缓冲液；
(2)PBS缓冲液：pH7.4的0.02mol／L磷酸盐缓冲液；
(3)抗体稀释液：pH7.4的0.02mol／LPBS和0.2％BSA；
(4)封闭液：pH9.6的0.05mol／L碳酸盐缓冲液和2.0％BSA
(5)洗涤液：0.02mol／LPBS(pH7.4)和0.05％Tween-20；
(6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液；
(7)终止液：2mol／L 硫酸溶液；
（8）Notch抗体；
（9）山羊抗小鼠IgG。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6433138B1 (en) * 1996-05-31 2002-08-13 Maine Medical Center Research Institute Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids

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Title
刘之力等: "Notch信号通路与皮肤肿瘤的研究现状", 《国际皮肤性病学杂志》 *
王伟敏等: "Notch信号通路在肝癌发生和发展中的研究进展", 《中国临床医学》 *
郑杰: "《肿瘤的细胞和分子生物学》", 28 February 2011 *

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