CN104758956A - 一种肿瘤靶向的t1-t2双核磁共振成像造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂及其制备方法和应用。所述造影剂包括透明质酸包覆的四氧化三铁复合磁性纳米粒子；所述透明质酸的分子式如下：其中，n为17～290的整数。所述造影剂的制备方法包括：(1)将透明质酸溶于去离子水，通入气体后，升温得到反应体系A；(2)将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸中，得溶液B；(3)将溶液B注入反应体系A中，调节pH至碱性，然后在高温下回流，得到反应体系C；(4)冷却反应体系C至室温，透析后得到所述造影剂。本发明还提供所述造影剂在体内和体外核磁共振中T1和T2加权成像中的应用。本发明的造影剂具有超顺磁性和突出的T1和T2弛豫增强效果，适合做T1-T2双核磁共振成像造影剂。
Description
技术领域
本发明涉及核磁共振成像造影剂材料领域，具体涉及一种肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
根据显影增强类型，目前使用的核磁共振造影剂分为两类：阳性造影剂和阴性造影剂。它们分别通过增强局部区域的1/T1或1/T2弛豫效率来达到图像信号增强画面变亮或画面变暗的效果。常用的阴性造影剂是铁，但很多由于粒径较大，性质不稳定，或由于制备方法的限制只能在有机相稳定，使得应用受限。此外，多数造影剂仅具有一种造影增强的效果，不能同时实现两种造影效果，使诊断疾病时的精确性受到限制。例如，核磁共振造影剂钆-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)，虽然已经被批准用于临床，但由于其螯合的钆离子容易释出，造成毒性，而且不具有长循环和靶向效果，使得应用受到限制；另外，这种造影剂虽然具有T1和T2同时造影效果，但是T1造影效果要明显好于T2造影效果；阴性造影剂SPIO的造影效果则相反。CN 104174037 A公开了一种具有T1、T2造影功能的掺混型造影剂的制备方法，该方法是以双头双亲有机分子做模板剂，在芳香酸存在的条件下，掺混稀土离子和ⅥB～ⅧB族离子，在自蒸压体系中制备的一种掺混型造影剂，其具有纳米级粒径和较好的T1、T2造影效果；但其并不能够长期稳定存在于水溶液中，操作复杂，成本也较高。
透明质酸(HA)是一种水溶性良好的天然高分子，大量存在于脊椎动物和细菌中，如人关节组织的细胞外基质，关节滑液，皮肤真皮及眼睛的玻璃体内等。HA也是一种线性多聚糖分子，单体是由糖苷键链接(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰-D-葡糖胺构成的二糖单元；根据二糖单元的数目不同，相对分子量基本在1×105～5×106Da之间。不同分子量的HA在生物体内扮演着不同的角色，如当相对分子量大于2×106时，HA具有很好的黏弹性、抑制炎性反应和润滑等功能；相对分子质量为(1～2)×106时，具有良好的保湿性和延缓药物释放作用；而分子量小于8×104时，具有抗肿瘤、促进血管生成和免疫调节等作用，可以用于肿瘤靶向治疗、促进血管修复与生成以及用于机体创伤修复。CN104162174 A公开了一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和热疗的应用，包括：(1)聚乙烯亚胺包覆的银纳米种子的制备；(2)“一步”水热法合成带有银种子的氧化铁纳米颗粒；(3)在金生长溶液中制备星形复合纳米颗粒；(4)星形复合纳米颗粒的表面进行聚乙烯亚胺和透明质酸修饰。该发明虽然操作简单，反应条件温和，易于纯化，但其只能用于T2加权成像，具有一定的局限性，精确度也不够。CN 103417992 A公开了一种四氧化三铁纳米颗粒靶向核磁共振造影剂的制备方法，包括：(1)水热法合成聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4-PEI)；(2)Fe3O4-PEI纳米颗粒表面修饰异硫氰酸荧光素；(3)将两种不同分子量的透明质酸分别连接在纳米颗粒的表面，得到四氧化三铁纳米颗粒靶向核磁共振造影剂。本发明反应条件温和，操作工艺简单，易于分离纯化；该发明制备的Fe3O4磁性纳米颗粒具有良好的胶体稳定性、生物相容性和肿瘤靶向性，但也只能用于T2加权成像。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种肿瘤靶向的具有T1和T2同时造影效果的T1-T2双核磁共振成像造影剂及其制备方法和应用；
本发明的目的之二在于提供一种在水溶液中性质稳定，易于纯化和保存的肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂及其制备方法和应用；
本发明的目的之三在于提供一种方法简单，条件温和，成本较低的肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂的制备方法。
第一方面，本发明提供一种肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂，所述造影剂包括透明质酸包覆的四氧化三铁复合磁性纳米粒子；所述透明质酸的分子式为：
其中，n为17～290的整数，n的取值例如可以是17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或290。若透明质酸的分子量过小，即聚合程度较低时，由于其造价昂贵，会增加反应成本和大规模工业生产的成本；若透明质酸的分子量过大，尤其是聚合单元n＞290时，透明质酸分子的靶向性较差，很难与肿瘤表面的靶向分子CD44结合；还会造成粘稠度过大，影响造影的效果；也会由于透明质酸的分子量过大或过小而影响本发明的复合磁性纳米粒子的粒径均一性。
优选地，所述复合磁性纳米粒子的粒径为2～10nm，例如可以是2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm。如果粒径大于10nm，复合磁性纳米粒子的T1成像效果将会减弱；如果粒径小于2nm，复合磁性纳米粒子的T2成像效果将会显著削弱。
优选地，所述复合磁性纳米粒子的水合粒径为10～100nm，例如可以是10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm或100nm。如果水合粒径大于100nm，复合磁性纳米粒子的T1成像效果将会减弱；如果水合粒径小于10nm，复合磁性纳米粒子的T2成像效果将会显著削弱。
优选地，所述复合纳米粒子的饱和磁化强度为2～15emu/g，例如可以是2emu/g、2.5emu/g、3emu/g、3.5emu/g、4emu/g、4.5emu/g、5emu/g、5.5emu/g、6emu/g、6.5emu/g、7emu/g、7.5emu/g、8emu/g、8.5emu/g、9emu/g、9.5emu/g、10emu/g、10.5emu/g、11emu/g、11.5emu/g、12emu/g、12.5emu/g、13emu/g、13.5emu/g、14emu/g、14.5emu/g或15emu/g。如果饱和磁化强度超过15emu/g，复合磁性纳米粒子的T1成像信号会削弱；如果饱和磁化强度小于2emu/g，复合磁性纳米粒子的T2成像信号会削弱。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的造影剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将透明质酸溶于去离子水，通入气体后，升温得到反应体系A；
(2)将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸中，得溶液B；
(3)将溶液B注入反应体系A中，调节pH至碱性，回流得到反应体系C；
(4)冷却反应体系C至室温，透析后得到所述造影剂。
优选地，所述四氧化三铁中的铁离子与透明质酸的质量比为(4.55～21.5)：100，所述质量比例如可以是4.55:100、5:100、5.5:100、6:100、6.5:100、7:100、7.5:100、8:100、8.5:100、9:100、9.5:100、10:100、10.5:100、11:100、11.5:100、12:100、12.5:100、13:100、13.5:100、14:100、14.5:100、15:100、15.5:100、16:100、16.5:100、17:100、17.5:100、18:100、18.5:100、19:100、19.5:100、20:100、20.5:100、21:100或21.5:100。限定二者的质量比是为了保证适量的分子量适中的透明质酸结合到四氧化三铁纳米颗粒的表面，形成粒径均一而适中的复合磁性纳米粒子；而避免了因透明质酸的分子量或四氧化三铁粒径过大或过小而引起的T1成像效果或T2成像效果的削弱。
优选地，步骤(1)所述透明质酸溶于去离子水后所得溶液的浓度为5～40g/L，例如可以是5g/L、7g/L、10g/L、12g/L、15g/L、17g/L、20g/L、22g/L、25g/L、27g/L、30g/L、32g/L、35g/L、37g/L或40g/L。所述浓度即为反应时所加入的透明质酸的量，浓度过大或过小会造成最终形成的复合磁性纳米粒子的粒径过大或过小，从而影响T1的成像效果或T2的成像效果。
优选地，步骤(1)所述气体为氮气或氩气；通入气体的目的是保护二价铁离子不被氧化，从而可以进行后续的反应。
优选地，步骤(1)所述通入气体的时间为20～50min，例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min或50min。
优选地，步骤(1)所述升温为升温至80～120℃，例如可以是80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃、102℃、104℃、106℃、108℃、110℃、112℃、114℃、116℃、118℃或120℃。只有在此温度范围内才能得到粒径均一的四氧化三铁纳米颗粒，否则会造成粒径不均一，成像效果不佳。
优选地，步骤(1)所述升温为油浴升温，以保证受热均匀且在80～120℃的范围内加热的液体不蒸发。
优选地，步骤(2)所述三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2：(1～2)，例如可以是2:1、2：1.1、2：1.2、2：1.3、2：1.4、2：1.5、2：1.6、2：1.7、2：1.8、2：1.9或2：2。根据四氧化三铁纳米颗粒中三价铁与二价铁的组成比例，三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2：1，单由于二价铁容易被氧化，所以将二者的摩尔比限定为2：(1～2)，以弥补被氧化的二价铁的损失。
优选地，步骤(2)所述三价铁盐为FeCl3·6H2O。
优选地，步骤(2)所述二价铁盐为FeCl2·4H2O或FeSO4·7H2O。
优选地，步骤(2)所述强酸溶液的浓度为0.5～3moL/L，例如可以是0.5moL/L、0.6moL/L、0.7moL/L、0.8moL/L、0.9moL/L、1moL/L、1.1moL/L、1.2moL/L、1.5moL/L、1.8moL/L、2moL/L、2.5moL/L或3moL/L。对于加入的强酸，例如可以是盐酸或硝酸等，以保证反应不产生沉淀；若加入弱酸则会产生沉淀，影响产品的制备。
优选地，步骤(3)所述调节pH所用试剂为碱；
优选地，所述碱为氨水；
优选地，所述氨水的质量分数为25～28％，例如可以是25％、25.1％、25.2％、25.3％、25.4％、25.5％、25.6％、25.7％、25.8％、25.9％、26％、26.1％、26.2％、26.3％、26.4％、26.5％、26.6％、26.7％、26.8％、26.9％、27％、27.1％、27.2％、27.3％、27.4％、27.5％、27.6％、27.7％、27.8％、27.9％或28％；
优选地，所述碱性为pH＝8～11，例如可以是8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5或11。
优选地，步骤(3)所述回流的时间为40～120min，例如可以是40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、105min、110min、115min或120min；所述回流的温度为80～120℃，例如可以是80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃、102℃、104℃、106℃、108℃、110℃、112℃、114℃、116℃、118℃或120℃。限定高温回流的时间和温度是为了保证形成一定粒径的复合磁性纳米粒子，若回流的时间太短和/或温度过低，则难以形成晶体；若回流的时间太长和/或温度过高，则形成的复合磁性纳米粒子的粒径过大，影响T1成像效果。
优选地，步骤(4)所述透析为用去离子水进行透析；
优选地，所述透析的温度为20～35℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃；
优选地，所述透析的时间为60～75h，例如可以是60h、61h、62h、63h、64h、65h、66h、67h、68h、69h、70h、71h、72h、73h、74h或75h。
作为优选技术方案，本发明所述的造影剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将透明质酸溶于去离子水，所述透明质酸的分子量为6,640～110,000Da；所得透明质酸水溶液的浓度为5～40g/L，通入氮气或氩气20～50min后，放于油浴中升温至80～120℃，得到反应体系A；
(2)将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸中，得溶液B；所述三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2：(1～2)；所述三价铁盐为FeCl3·6H2O；所述二价铁盐为FeCl2·4H2O或FeSO4·7H2O；所述强酸溶液的浓度为0.5～3moL/L；
(3)将溶液B注入反应体系A中，用质量分数为25～28％的氨水调节pH至pH＝8～11，然后在80～120℃下回流40～120min，得到反应体系C；
(4)冷却反应体系C至室温，在20～35℃下透析60～75h，得到所述造影剂。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的造影剂在体内和体外核磁共振T1和T2加权成像中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的造影剂具有超顺磁性和突出的T1和T2弛豫增强效果，T1和T2弛豫时间倒数在较大的浓度范围内随铁浓度变化的线性关系均良好，其中R1达到10.751mM-1s-1，明显高于现在商用造影剂的R1值(普遍在4mM-1s-1左右)。由于几乎所有的成像剂的弛豫时间倒数与浓度的线性关系仅在低浓度时比较好，浓度较高时则不符合线性关系，说明本发明的造影剂与之不同，是制备肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂的理想材料。
(2)本发明的造影剂粒径小，具有良好的穿透性且粒径均一，易于纯化，粒子表面为负电荷，对于肿瘤具有靶向性强；60天内在水中的稳定性良好，水合粒径尺寸在20～30nm之间，并无明显的波动。
(3)本发明的造影剂没有明显的细胞毒性，生物相容性良好。
(4)本发明的造影剂具有较好的长循环效果，功能发挥完毕后，能够被机体代谢。
(5)本发明的造影剂制备方法简单，条件温和，成本较低，易于推广和应用。
(6)本发明的造影剂能够冻干，以固体形式保存，保存期长；当用生理盐水复溶时，性质几乎不发生改变。
附图说明
图1为红外光谱图，其中(a)表示实施例1中的HA的红外光谱图；(b)表示实施例1中的T1-T2双核磁共振成像造影剂和无HA包覆的Fe3O4的红外光谱图。
图2表示实施例1中的HA-Fe3O4纳米粒子的水合粒径分布图。
图3表示实施例1中的HA-Fe3O4纳米粒子的表面电位图。
图4表示实施例1中的HA-Fe3O4纳米粒子的透射电镜图。
图5表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂纳米粒子的稳定性实验结果图。
图6表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的磁滞回线图。
图7表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的X射线衍射图谱。
图8中，(a)表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的T1弛豫时间倒数随铁浓度变化的线性关系图；(b)表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的T2弛豫时间倒数随铁浓度变化的线性关系图；(c)表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的T1和T2加权成像图片。
图9表示CCK-8法测试的MDA-MB-231细胞经过PBS缓冲液和实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂(Fe离子浓度范围在0～200μg/mL)处理24小时后的细胞活力柱状图。
图10表示经不同处理的MDA-MB-231细胞加入本发明的T1-T2双核磁共振成像造影剂后的普鲁士蓝染色结果图。
图11表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂在体内的T1和T2的核磁造影图像，其中，(a)为T1核磁造影图像，(b)为T2核磁造影图像。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中红外光谱检测所用仪器为红外光谱仪(Spectrum one，美国珀金-埃尔默公司)；测量粒径所用的仪器为动态光散射仪(Zetasizer NanoZS)；观测粒子形态用透射电镜(日本，JEM-1400，120kV)；饱和磁化率的测定采用物性测量系统(PPMS-9)；T1和T2弛豫能力测定采用多源磁共振仪(Philips Achieva3.0T TX)；加权成像采用小动物磁共振成像仪(BioSpec70/20USR，Bruker公司)。
实施例1
本实施例采用如下步骤制备T1-T2双核磁共振成像造影剂：
(1)将0.5g的HA溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气30min，油浴升温至102℃，得到反应体系A；其中，所用HA的分子式如下：
其中，n＝17～290，
(2)取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.0715g的FeCl2·4H2O溶于2mL浓度为1M的盐酸溶液中，得到溶液B；
(3)将溶液B注入到步骤(1)中的反应体系A，缓慢滴加质量分数27％的氨水15mL，至pH＝10；在高温下回流40min，得反应体系C；
(4)等步骤(3)中的反应体系C冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到T1-T2双核磁共振成像造影剂。
通过透射电镜观察，利用本法制备的造影剂的粒子为球形，水合粒径的峰值为25nm左右。
性能测试：
取实施例1制备的T1-T2双核磁共振成像造影剂进行红外图谱分析，结果如图1所示。其中，(a)表示实施例1中HA的红外图谱，(b)表示实施例1中的T1-T2双核磁共振成像造影剂粒子的红外图谱和无HA包覆的Fe3O4的红外谱图。从(b)中可以看出，与Fe3O4相比，T1-T2双核磁共振成像造影剂粒子的图谱在2909处出现HA上羟基的分子内缔合峰；在1037处出现HA上伯醇C-O的伸缩振动峰；在1609处出现-COO-的反对称伸缩振动峰。由此可以确定，HA已经包覆在了Fe3O4纳米颗粒上。
随后，对实施例1制备的T1-T2双核磁共振成像造影剂的HA-Fe3O4纳米粒子进行水合粒径分布分析，结果如图2所示。结果显示，本发明的粒子的粒径较小，具有良好的穿透性；另外，图中峰值十分突出，说明本发明的粒子粒径分布均一。图3为实施例1制备的粒子的表面电位图，可以看出粒子表面电位为负值，且峰值突出，说明HA已经成功包覆在了Fe3O4纳米颗粒上(若未包覆成功，电位值应为0)。图4为实施例1制备的粒子的透射电镜图，可以看出，粒子的粒径小且均一。
随后，对实施例1制备的T1-T2双核磁共振成像造影剂纳米粒子进行稳定性分析，结果如图5所示，从图中可以看出，本发明的粒子60天内在水中的稳定性良好，水合粒径尺寸在20～30nm之间，并无明显的波动。实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的磁滞回线如图6所示，可以看出，外加磁场强度在-10,000～10,000之间变化时，磁滞回线重合(若不重合，则会形成闭合的环)，说明本发明的粒子具有超顺磁性，适合做T1-T2双核磁共振成像造影剂。图7为实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的X射线衍射图谱，图谱中220、311、422和440处均出现峰值，表示本发明的粒子的晶型是Fe3O4，由此可见，利用本发明的方法可以制备包含HA-Fe3O4纳米粒子的T1-T2双核磁共振成像造影剂。
图8中，(a)表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的T1弛豫时间的倒数随铁浓度变化的线性关系图；(b)表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的T2弛豫时间的倒数随铁浓度变化的线性关系图；(c)表示实施例1的T1-T2双核磁共振成像造影剂的T1和T2加权成像图片。可以看出，本发明的粒子的T1和T2弛豫时间的倒数随铁浓度变化的线性关系均良好，其中R1达到10.751mM-1s-1，明显高于现在商用造影剂的R1值(普遍在4mM-1s-1左右)，说明本发明的粒子具有很高的T1和T2弛豫增强效果，是制备T1-T2双核磁共振成像造影剂的理想材料。
随后，通过CCK-8比色法测定实施例1制备的粒子的生物相容性，具体方法如下：
以MDA-MB-231细胞为模型，通过CCK-8比色法测定MDA-MB-231细胞的活力以检测实施例1制备的粒子的细胞毒性。MDA-MB-231细胞分别与不同Fe离子浓度的实施例1制备的粒子溶液(浓度分别取1.5μg/mL、3.1μg/mL、6.2μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)在37℃下共培养24h，然后使用CCK-8试剂盒测试在450nm处的吸光值，并根据此值计算细胞活力以检测实施例1所合成材料的毒性。从图9可以看出，第一列为对照组，即未加入Fe离子，细胞活力为100％；与对照组相比，实施例1制备的粒子从1.5μg/mL到200μg/mL实验浓度范围内对MDA-MB-231细胞的活力没有显著性影响，其细胞活力均在100％左右范围小幅度波动，说明没有明显的细胞毒性，这表明本发明的粒子在该浓度范围内具有良好的生物相容性。
随后，我们检测了实施例1制备的粒子对CD44高表达细胞系MDA-MB-231的靶向性，具体方法如下：
将一定密度的MDA-MB-231细胞接种在载玻片上，待其贴壁之后，实验组用10mg/mL的透明质酸预处理细胞1h，然后除去培养上清，对照组和实验组分别加入实施例1制备的粒子处理12h，然后将细胞用4％的多聚甲醛固定，用普鲁士蓝-核固红染色试剂盒进行染色，封片后在显微镜下观察细胞普鲁士蓝染色结果。由于HA的预处理，细胞系表面的CD44作为HA的特异性受体，会被HA饱和，因此如图10显示，经HA预处理的实验组MDA-MB-231细胞对本发明的造影剂材料摄入极少，没有观察到明显的内吞铁颗粒；而未经过HA处理的细胞表面有大量未饱和的CD44，能够通过HA分子粘附本发明的造影剂材料，在图中能明显看出有内吞的铁颗粒，由于CD44普遍在肿瘤细胞表面大量表达，因此能够证明实施例1制备的粒子对肿瘤细胞具有良好的靶向性。
最后，我们将实施例1制备的材料通过尾静脉注射进入小鼠体内，经过核磁成像系统完成T1-T2双重成像，具体操作如下：
以Balb/c雌性荷瘤小鼠为动物模型，将小鼠麻醉后，通过尾静脉注射200μLFe离子浓度为256.6μg/mL的实施例1制备的纳米材料，在不同的时间点分别进行T1和T2核磁成像扫描，成像结果如图11所示。T1扫描结果即图(a)显示，注射本发明的造影剂之后，随时间的增加，动物的肾脏、脾脏以及肿瘤部位明显变亮，T1信号增强，在30min时信号最强，而随时间的进一步增加，信号减弱，表明材料逐步被代谢掉。T2扫描结果即图(b)显示，注射本发明的造影剂之后，随时间的增加，动物的肾脏、脾脏以及肿瘤部位明显变暗，在30min时T2信号最强，同T1结果类似，随时间的进一步增加，信号减弱。成像结果表明本发明的材料适合用于T1和T2核磁双重造影，且具有长循环的效果，能够被机体代谢。
实施例2
本实施例采用如下步骤制备T1-T2双核磁共振成像造影剂：
(1)将0.25g的HA溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气20min，油浴升温至80℃，得到反应体系A；其中，所用HA的分子式如下：
其中，n＝17～290，
(2)取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.0804g的FeCl2·4H2O溶于2mL浓度为1M的盐酸溶液中，得到溶液B；
(3)将溶液B注入到步骤(1)中的反应体系A，缓慢滴加质量分数为25％的氨水15mL，至pH＝10；在高温下回流40min，得反应体系C；
(4)等步骤(3)中的反应体系C冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到T1-T2双核磁共振成像造影剂。
通过透射电镜观察，利用本法制备的造影剂的粒子为球形，水合粒径的峰值为25nm左右。
实施例3
本实施例采用如下步骤制备T1-T2双核磁共振成像造影剂：
(1)将2g的HA溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气50min，油浴升温至120℃，得到反应体系A；其中，所用HA的分子式如下：
其中，n＝17～290，
(2)取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.0537g的FeCl2·4H2O溶于2mL浓度为1M的盐酸溶液中，得到溶液B；
(3)将溶液B注入到步骤(1)中的反应体系A，缓慢滴加质量分数为28％的氨水15mL，至pH＝10；在高温下回流120min，得反应体系C；
(4)等步骤(3)中的反应体系C冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到T1-T2双核磁共振成像造影剂。
通过透射电镜观察，利用本法制备的造影剂的粒子为球形，水合粒径的峰值为25nm左右。
实施例4
本实施例采用如下步骤制备T1-T2双核磁共振成像造影剂：
(1)将1.125g的HA溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气35min，油浴升温至100℃，得到反应体系A；其中，所用HA的分子式如下：
其中，n＝17～290，
(2)取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.1073g的FeCl2·4H2O溶于2mL浓度为1M的盐酸溶液中，得到溶液B；
(3)将溶液B注入到步骤(1)中的反应体系A，缓慢滴加质量分数为26.5％的氨水15mL，至pH＝10；在高温下回流80min，得反应体系C；
(4)等步骤(3)中的反应体系C冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到T1-T2双核磁共振成像造影剂。
通过透射电镜观察，利用本法制备的造影剂的粒子为球形，水合粒径的峰值为25nm左右。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种肿瘤靶向的T1-T2双核磁共振成像造影剂，其特征在于，所述造影剂包括透明质酸包覆的四氧化三铁复合磁性纳米粒子；所述透明质酸的分子式为：
其中，n为17～290的整数。
2.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述复合磁性纳米粒子的粒径为2～10nm；
优选地，所述复合磁性纳米粒子的水合粒径为10～100nm；
优选地，所述复合纳米粒子的饱和磁化强度为2～15emu/g。
3.根据权利要求1或2所述的造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将透明质酸溶于去离子水，通入气体后，升温得到反应体系A；
(2)将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸中，得溶液B；
(3)将溶液B注入反应体系A中，调节pH至碱性，回流得到反应体系C；
(4)冷却反应体系C至室温，透析后得到所述造影剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁中的铁离子与透明质酸的质量比为(4.55～21.5)：100。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述透明质酸溶于去离子水后所得溶液的浓度为5～40g/L；
优选地，步骤(1)所述气体为氮气或氩气；
优选地，步骤(1)所述通入气体的时间为20～50min；
优选地，步骤(1)所述升温为升温至80～120℃；
优选地，步骤(1)所述升温为油浴升温。
6.根据权利要求3～5之一所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2：(1～2)；
优选地，步骤(2)所述三价铁盐为FeCl3·6H2O；
优选地，步骤(2)所述二价铁盐为FeCl2·4H2O或FeSO4·7H2O；
优选地，步骤(2)所述强酸溶液的浓度为0.5～3moL/L。
7.根据权利要求3～6之一所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述调节pH所用试剂为碱；
优选地，所述碱为氨水；
优选地，所述氨水的质量分数为25～28％；
优选地，所述碱性为pH＝8～11；
优选地，步骤(3)所述回流的时间为40～120min，所述回流的温度为80～120℃。
8.根据权利要求3～7之一所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述透析为用去离子水进行透析；
优选地，所述透析的温度为20～35℃；
优选地，所述透析的时间为60～75h。
9.根据权利要求3～8之一所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将透明质酸溶于去离子水，所述透明质酸的分子量为6,640～110,000Da；所得透明质酸水溶液的浓度为5～40g/L，通入氮气或氩气20～50min后，放于油浴中升温至80～120℃，得到反应体系A；
(2)将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸中，得溶液B；所述三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2：(1～2)；所述三价铁盐为FeCl3·6H2O；所述二价铁盐为FeCl2·4H2O或FeSO4·7H2O；所述强酸溶液的浓度为1moL/L；
(3)将溶液B注入反应体系A中，用质量分数为25～28％的氨水调节pH至pH＝10，然后在80～120℃下回流40～120min，得到反应体系C；
(4)冷却反应体系C至室温，在20～35℃下透析72h，得到所述造影剂。
10.根据权利要求1或2所述的造影剂在体内和体外核磁共振T1和T2加权成像中的应用。
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