CN104756714A - 一种在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，它包括对幼苗进行冷驯化处理；取叶圆片用液氮快速冷冻并用甲醇提取；以核糖醇作为内标；使用硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）进行衍生化处理；GC-MS分析和数据处理等步骤。本发明的方法既可用于稳定遗传群体抗冻性鉴定，也可用于变异单株抗冻性鉴定，该方法样品用量少，对植株伤害小，不影响后期生长和抽薹开花，有利于抗冻材料留种或进行杂交育种。同时，本发明在苗期开展鉴定工作，对土地、人工等要求更低，用时较短，且不受季节影响，适合较大批量抗冻种质资源的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及蔬菜的育种方法，特别涉及但不限于利用气相色谱-质谱联用法鉴定结球白菜抗冻单株的方法，属于园艺领域。
背景技术
低温和凝冻是限制越冬蔬菜生长发育以及产量形成的主要因素之一，选育抗冻耐抽薹结球白菜品种是解决长江流域大白菜冬春和早春反季节生产问题的关键。但传统的抗冻材料筛选方法需要在自然或人工零下低温条件下观察植物冻害指数，属于破坏性试验，适合遗传相对稳定群体的抗冻鉴定，不适用于单株材料，因而导致抗冻育种周期长、材料选择范围小，不利于抗冻品种的选育工作。
植物抗冻性是一种复杂的多基因控制的性状。研究表明，温带植物在零上低温（0~10℃）下经过数天或数周处理可提高其抗冻性，这一过程称为冷驯化（Cold acclimation）。冷驯化过程通过低温信号转导途径激活抗冻响应基因，促使植物体内发生一系列生理、生化及代谢变化，如膜脂中不饱和脂肪酸含量增加、渗透调节物质积累、活性氧清除能力加强以及脱落酸的积累等，进而诱导植物产生稳定的低温适应性。通过研究冷驯化对结球白菜抗冻生理过程的作用，发现可采用渗透调节物质苹果酸、果糖和甘露糖含量鉴定白菜抗冻性。气相色谱-质谱联用法灵敏度高、样品用量少，取样测定时对植株伤害小，适用于单株材料鉴定。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种在苗期筛选结球白菜抗冻育种材料，且不影响其后期生长和抽薹开花的方法。利用该方法可从杂交后代或自然群体中快速筛选出抗冻单株，用于进一步选育工作。该方法所需时间短，对植株破坏性很小，特别适合F1代和F2代群体抗冻单株的选择。
本发明采用如下技术方案：
1、将结球白菜种子常温浸种5h后播种到育苗盘中，栽培基质为泥炭、蛭石和珍珠岩的混合物，在人工气候箱中于20±1℃下育苗。待幼苗长至5~6片真叶时进行冷驯化处理。
2、冷驯化方法：将幼苗放入人工气候箱内4℃下进行冷驯化，处理期间光周期为光照12h，光照强度15000 Lx；暗期12h。即每天24小时中12小时光照，12小时黑暗。相对湿度控制在65%左右，试验处理10天。
3、用1cm打孔器在经冷驯化处理的结球白菜幼苗第3叶主脉两侧取叶圆片，称取100mg样品3份，分别置于2ml带螺纹帽的圆底管中，液氮快速冷却。用研磨棒在冰冻条件下将样品磨碎。
4、样品加入1400μl预冷在-20℃中的甲醇，摇匀10s。加入60μl核糖醇（0.2mg/ml）作为内标，摇匀10s。使用热混合器于70℃以950r/min速度提取10min，11000g离心10min。转移上清液到另一玻璃管中，加入750μl预冷却的氯仿（-20℃），摇匀10s。加入14000μl预冷却的双蒸水（-20℃），摇匀10s。2200g离心15min，转移上清液150μl到另一干净的1.5ml管中，将样品室温真空干燥。
5、衍生化处理：加40μl甲氧氨基化试剂，37℃反应2h，持续振荡。将70μl硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）加入样品反应管中，37℃振荡反应30min。转移衍生化好的样品到适合GC-MS分析的内衬管中。
6、GC-MS分析。GC-MS仪器型号：安捷伦公司（Agilent）7890A气相色谱仪，CTC Combi PAL自动进样器，安捷伦公司5975C质谱仪，DB-5MS毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm。气相色谱条件: GC进样口温度为280℃。采用升温程序: 初始柱温60℃, 保持4分钟; 以每分钟8℃升至315℃; 在315℃维持7分钟。质谱条件: 离子源为电子轰击EI源, 激发电压为70 eV, 离子源温度为300℃, 四级杆温度为150℃,扫描范围50–650 m·z–1, 扫描速度为每秒0.5 scans，扫描时间4.5–41.8分钟。进样量1μL。
7、数据处理。利用仪器自带的数据分析软件生成谱图并积分，NIST08和WILEY275标准质谱图库定性，采用内标法对苹果酸、果糖和甘露糖进行定量，3份样品取平均值，计算结球白菜苹果酸、果糖和甘露糖含量。
8、选取苹果酸含量大于1000μg/g·FW，甘露糖含量大于2000μg/g·FW，果糖含量大于1800μg/g·FW的结球白菜幼苗移栽到大田，行株距30×50cm，常规管理，用于杂交育种或留种。
9、本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种既可用于稳定遗传群体抗冻性鉴定，也可用于变异单株抗冻性鉴定的方法，该方法样品用量少，对植株伤害小，不影响后期生长和抽薹开花，有利于抗冻材料留种或进行杂交育种。同时，本发明在苗期开展鉴定工作，对土地、人工等要求更低，用时较短，且不受季节影响，适合较大批量抗冻种质资源的筛选。
本发明与已有技术的不同之处：
（1）本发明与中国热带农业科学院热带生物技术研究所张建斌等发明的《一种抗寒香蕉种质的筛选方法》相比：该发明采用愈伤组织低温筛选和分化芽低温筛选，且该方法是根据成活率进行筛选；而本发明针对结球白菜幼苗进行抗冻筛选，且采用气质联用法分析苹果酸、果糖和甘露糖含量作为筛选依据，样品用量少，对植株伤害小，不影响后期生长和抽薹开花，有利于抗冻材料留种或进行杂交育种。
（2）本发明与安徽农业大学李叶云等发明的《一种茶树抗寒性鉴定与评价的方法》相比：该发明采用传统测定越冬期不同品种茶树与抗寒相关的生理生化指标，并采用主成分分析法进行品种筛选，取样量大，方法烦琐，不适合于蔬菜苗期筛选，也不能在苗期鉴定变异单株；本方法采用气质联用法作为分析方法，分析苹果酸、果糖和甘露糖含量作为筛选依据，样品用量少，对植株伤害小，不影响后期生长和抽薹开花，有利于抗冻材料留种或进行杂交育种。
（3）本发明与浙江农林大学温国胜等发明的《一种木麻黄抗寒性鉴定与评价方法》相比：该发明采用叶绿素荧光参数作为抗寒性鉴定和评价依据；本方法采用气质联用法作为分析方法，分析苹果酸、果糖和甘露糖含量作为筛选依据。
本方法鉴定后的单株抗冻材料可继续生长、抽薹、开花，用于杂交育种或留种，且鉴定过程于苗期进行，材料占用空间小、筛选范围大、用时较短，为开展结球白菜抗冻耐抽薹生理育种工作，解决大白菜在凝冻条件下的生产问题提供了重要的技术基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
实施例1：
（1）材料：以现有的威-12-1、威-7-4、威-12-2、威-15-1、威-15-3、威-14-2、威-4-2、威-14-5大白菜品种为材料。将种子常温浸种5h后播种到育苗盘中，栽培基质为泥炭、蛭石和珍珠岩的混合物，在人工气候箱中于20±1℃下育苗。待幼苗长至5~6片真叶时进行冷驯化处理。
（2）将幼苗放入人工气候箱内4℃下进行冷驯化，处理期间光周期为光照12h，光照强度15000 Lx；暗期12h。相对湿度控制在65%左右，试验处理10天。用1cm打孔器在经冷驯化处理的结球白菜幼苗第3叶主脉两侧取叶圆片，称取100mg样品，置于2ml带螺纹帽的圆底管中，液氮快速冷却。用研磨棒在冰冻条件下将样品磨碎。
（3）样品加入1400μl预冷在-20℃中的甲醇，摇匀10s。加入60μl核糖醇（0.2mg/ml）作为内标，摇匀10s。使用热混合器于70℃以950r/min速度提取10min，11000g离心10min。转移上清液到另一玻璃管中，加入750μl预冷却的氯仿（-20℃），摇匀10s。加入14000μl预冷却的双蒸水（-20℃），摇匀10s。2200g离心15min，转移上清液150μl到另一干净的1.5ml管中，将样品室温真空干燥。
（4）加40μl甲氧氨基化试剂，37℃反应2h，持续振荡。将70μl硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）加入样品反应管中，37℃振荡反应30min。转移衍生化好的样品到适合GC-MS分析的内衬管中，取1μL于Agilent 5975C气质联用仪进样测定。利用仪器自带的数据分析软件生成谱图并积分，NIST08和WILEY275标准质谱图库定性，采用内标法对苹果酸、果糖和甘露糖进行定量，计算结球白菜苹果酸、果糖和甘露糖含量。
（5）选取苹果酸含量大于1000μg/g·FW，甘露糖含量大于2000μg/g·FW，果糖含量大于1800μg/g·FW的结球白菜幼苗移栽到大田，行株距30×50cm，常规管理，最后选择耐抽苔经济性状和抗病性较好的威-12-1、威-7-4、威-14-2三个自交系留种。用于杂交育种。
实施例2：
（1）材料：以实施例1鉴选出的特抗寒且耐抽苔经济性状较好的自交系：威-12-1、威-14-2、威-7-4分别与引进品种后代分离选育的4个优良自交系：dj-1、f-4、c-1、a-2配置杂交组合12个；及杂交组合F2代分离的后代单株10个，将其上述种子常温浸种5h后播种到育苗盘中，栽培基质为泥炭、蛭石和珍珠岩的混合物，在人工气候箱中于20±1℃下育苗。待幼苗长至5~6片真叶时进行冷驯化处理。
（2）将幼苗放入人工气候箱内4℃下进行冷驯化，处理期间光周期为光照12h，光照强度15000 Lx；暗期12h。相对湿度控制在65%左右，试验处理10天。用1cm打孔器在经冷驯化处理的结球白菜幼苗第3叶主脉两侧取叶圆片，称取100mg样品，置于2ml带螺纹帽的圆底管中，液氮快速冷却。用研磨棒在冰冻条件下将样品磨碎。
（3）样品加入1400μl预冷在-20℃中的甲醇，摇匀10s。加入60μl核糖醇（0.2mg/ml）作为内标，摇匀10s。使用热混合器于70℃以950r/min速度提取10min，11000g离心10min。转移上清液到另一玻璃管中，加入750μl预冷却的氯仿（-20℃），摇匀10s。加入14000μl预冷却的双蒸水（-20℃），摇匀10s。2200g离心15min，转移上清液150μl到另一干净的1.5ml管中，将样品室温真空干燥。
（4）加40μl甲氧氨基化试剂，37℃反应2h，持续振荡。将70μl硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）加入样品反应管中，37℃振荡反应30min。转移衍生化好的样品到适合GC-MS分析的内衬管中，取1μL于Agilent 5975C气质联用仪进样测定。利用仪器自带的数据分析软件生成谱图并积分，NIST08和WILEY275标准质谱图库定性，采用内标法对苹果酸、果糖和甘露糖进行定量，计算结球白菜苹果酸、果糖和甘露糖含量。
（5）选取苹果酸含量大于1000μg/g·FW，甘露糖含量大于2000μg/g·FW，果糖含量大于1800μg/g·FW的结球白菜幼苗移栽到大田，行株距30×50cm，常规管理。
Claims (6)
1.一种在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于它包括如下步骤：
（1）将结球白菜种子播种到育苗盘中育苗；待幼苗长至5~6片真叶时在人工气候箱内对幼苗进行冷驯化处理；
（2）在经冷驯化处理的结球白菜幼苗上取叶圆片，称取3份叶圆片样品，分别置于圆底管中用液氮快速冷冻；用研磨棒在冰冻条件下将样品磨碎，加入预冷却的甲醇摇匀；加入核糖醇作为内标摇匀；使用热混合器提取并进行离心处理；转移上清液到另一玻璃管中，加入预冷却的氯仿摇匀；加入预冷却的双蒸水摇匀；进行离心处理后转移上清液到另一干净的玻璃管中，将样品室温真空干燥；
（3）衍生化处理：向真空干燥过的样品中加入甲氧氨基化试剂反应并持续振荡；然后将硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺加入样品反应管中振荡反应；
（4）GC-MS分析：转移衍生化好的样品到适合GC-MS分析的内衬管中进行GC-MS分析；
（5）数据处理：将GC-MS分析获得的数据生成谱图并积分，采用内标法对样品中苹果酸、果糖和甘露糖进行定量，将3份样品取平均值，计算结球白菜苹果酸、果糖和甘露糖含量；选取苹果酸、果糖和甘露糖含量达标的结球白菜幼苗作为抗冻材料移栽到大田用于杂交育种或留种。
2.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：所述冷驯化处理是将幼苗放入人工气候箱内在4℃下进行冷驯化，处理期间光周期为光照12h，光照强度15000 Lx；暗期12h；相对湿度控制在65%左右，试验处理10天。
3.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：所述称取3份样品是在经冷驯化处理的结球白菜幼苗第3叶主脉两侧取叶圆片，称取100mg样品3份。
4.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：步骤（3）中衍生化处理的条件为：加玻璃管中的样品中40μl甲氧氨基化试剂，37℃反应2h，持续振荡；将70μl硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺MSTFA加入样品反应管中，37℃振荡反应30min。
5.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：步骤（4）中GC-MS分析气相色谱条件: GC进样口温度为280℃；采用升温程序: 初始柱温60℃, 保持4分钟; 以每分钟8℃升至315℃; 在315℃维持7分钟；质谱条件: 离子源为电子轰击EI源, 激发电压为70 eV, 离子源温度为300℃, 四级杆温度为150℃,扫描范围50–650 m·z–1, 扫描速度为每秒0.5 scans，扫描时间4.5–41.8分钟；进样量1μL。
6.根据权利要求1所述的在苗期鉴定抗冻结球白菜的方法，其特征在于：步骤（5）中筛选出的抗冻材料的标准为苹果酸含量大于1000μg/g·FW，甘露糖含量大于2000μg/g·FW，果糖含量大于1800μg/g·FW。
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