CN104749000A - 沼生植物根际分泌物提取装置及方法 - Google Patents

Abstract

一种沼生植物根际分泌物提取装置及方法，包括：植物生长箱和与之相连的分泌物萃取箱，其中：植物生长箱的输入端接收植物生长养分，输出端与分泌物萃取箱相连，通过分泌物萃取箱对根际分泌物进行吸附采集；本发明通过气水的真空作用形成闭合循环，植物的根际分泌物被去离子水携带出植物生长箱，在萃取箱通过树脂的交换吸附作用将根际分泌物萃取并富集。本发明能够真正实现栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准确收集根际分泌物的方法和装置。

Description

沼生植物根际分泌物提取装置及方法

技术领域

本发明涉及一种植物生态和环境领域的技术，具体涉及一种沼生植物根际分泌物提取装置及方法。

背景技术

长期以来，由于受测试手段和实验条件的限制，有关根际分泌物研究方法的进展非常缓慢。随着显微技术的广泛应用，人们对根际分泌物及根土界面的研究日趋活跃。20世纪70年代至80年代，现代仪器分析方法的飞速发展，促进了根际分泌物的研究，特别是近十几年来，伴随着根际分泌物在植物营养、设施园艺、农业生态与环境等领域的广泛应用，掀起了根际分泌物研究的高潮。

现有的根际分泌物的收集方法尚无系统划分，以植株根系所在的培养系统，可将根际分泌物收集方法分为：根际淋洗收集、溶液培收集、基质培(蛭石培、砂培、琼脂培等)收集及土培收集；以是否在灭菌条件下进行可分为：无菌体系收集和开放体系收集；根据是否在原位条件下进行又可分为：原位收集和扰动收集。其中，在灭菌条件下收集的根际分泌物数量能准确反映植物根系分泌有机和无机物质的含量；在土培条件原位收集的根际分泌物则能直接反映根际分泌的实际情况。因而采取何种收集方式很大程度上取决于采集目的。

根际分泌物收集之后，要进一步分离纯化，才能进行有效分析。在分离纯化过程中要根据待测组分的理化及生物学性质，选择合理的分离纯化方法。用的几种方法有：离子交换法、衍生化与萃取法、分子膜与超速离心法。

对于根际分泌物的收集：根系淋洗法不可取，因是将根系挖出后淋洗，根系已受损伤，收集的根际分泌物中更多的是根系本身的内含物和伤流液；溶液培收集则使根际基本处于一个厌氧环境，收集的根际分泌物不能代表正常生长状态的情况；如解决了微生物的影响，基质培如沙培法和琼脂固定定位培养法将是当前效果较好的根际分泌物收集法；因其基本上能代表植物的自然生长状态。与其他收集方法相比，土培收集所得根际分泌物接近于植物自然生长状态下的实际状况。而且土壤存在机械阻力，根际分泌作用比较旺盛，因而土培条件下单位植株干重产生根际分泌物的量要高于其他收集的根际分泌物的量。但土培法的缺点是：尽管根际土壤溶液取样器(RHIzON SMS)能原位直接抽提土壤溶液，但是其PVC管含有30％的增塑剂和少量的稳定剂，痕量的物质能进入样品，所取的溶液常含有大量的土壤有机质，因此会对样品造成较大的污染和干扰。另外，土壤是一个非常复杂的多相体系，土壤溶液化学的影响因素还没有弄清，再加之土壤中存在时空变异，这给采集具有代表性的土壤溶液增加了许多困难。

为了抵消土培方法造成的干扰，能真正实现在现实栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准确收集和研究根系分泌物，本发明采用循环水连续根际分泌物收集装置能够较好地富集纯化根际分泌物。该装置基于离子交换法：此法是利用根际分泌物待测组分与杂质的极性差异，采用特定的填料作固定相，利用待测组分和杂质在固定相上的交换能力不同，从而达到与杂质分离的目的。因此，层析柱填料选择十分重要。树脂是常用的层析柱填料，其型号有：XAD系列、Amerblite系列、DEAE纤维素和琼脂糖等。原理是：收集一定时期的根际分泌物时，启动所述沼生植物根际分泌物提取装置，三通阀通气通水，充气泵充入一定流速的气体，气泡将带动连续的去离子水进入瓶中，从而装有植物的无底瓶中的液体就会循环流动，形成封闭连续循环根际分泌物收集装置。根际分泌物在经过装有树脂的玻璃柱时就会吸附在树脂表面。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103843601A，公开(公告)日2014.06.11，公开了一种组合循环式根系分泌物采集装置，包括收集槽、横梁支撑件、定植板、定植孔、软管和揉动泵组成，收集槽由横堵板、纵向板、底板组成，横堵板平行位于两端、纵向板平行位于两侧、底板位于收集槽底部构成收集槽的长方形框架，底板一角设有出液管，在出液管对角线上的纵向板上设有进液管，底板下面四个角上设有支脚，横梁支撑件与横堵板平等排列，其长度小于横堵板长度，相邻的两块横梁支撑件分别交错与两侧的纵向板连接在一起，横梁支撑件底部与底板相接在一起，横梁支撑件上放置定植板，长宽跟收集槽内部尺寸大小一致，定植板沿横向和纵向设有多个定植孔，定植板一角设有加液管，定植管设在定植孔内，软管将揉动泵和出液管、进液管连接起来。但该技术容易导致收集的根际分泌物中含有系统中微生物产生的分泌物，因此该技术中所提及的根际分泌物实际上包括两部分：植物分泌物和微生物分泌物。但对于植物研究而言，需要仅分析植物分泌物，而排除微生物分泌物的干扰。因此，该技术在这方面无法满足要求。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提出一种沼生植物根际分泌物提取装置及方法，通过气水的真空作用形成闭合循环，植物的根际分泌物被去离子水携带出植物生长箱，在萃取箱通过树脂的交换吸附作用将根际分泌物萃取并富集。本发明能够真正实现栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准确收集根际分泌物的方法和装置。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明涉及一种沼生植物根际分泌物提取装置，包括：植物生长箱和与之相连的分泌物萃取箱，其中：植物生长箱的输入端接收植物生长养分，输出端与分泌物萃取箱相连，通过分泌物萃取箱对根际分泌物进行吸附采集。

所述的植物生长箱的输入端和所述的分泌物萃取箱的出水端之间设有循环供气机构，该循环供气机构包括：连接植物生长箱的输入端和分泌物萃取箱的出水端的管路以及与该管路相连的充气泵，通过空气的气提真空作用，使得分泌物萃取箱的出水重新回流至植物生长箱。

本发明涉及上述装置的沼生植物根际分泌物收集方法，将待测定的沼生植物培养于所述装置中，并在其开始产生根基分泌物后向分泌物萃取箱中装入树脂，启动循环供气机构实现内循环流动，实现根际分泌物的采集。

所述的装置在培养前预先经过消毒处理，优选经H₂O₂蒸汽灭菌器进行灭菌处理。

所述的待测定的沼生植物，洗净，使根系上不含泥。

所述的沼生植物选择植物生长期的幼苗。

所述的培养是指：将待测定的沼生植物放入生长箱后加入1500mL去离子水。

所述的采集是指：当根际分泌物在经过装有树脂的玻璃柱时就会吸附在树脂表面，具体为：回收各层树脂，然后用甲醇、pH4.0HCl溶液、pH＝8.0氢氧化钠溶液分别冲洗出根分泌物；然后用定性滤纸每部分根分泌物溶液进行真空浓缩，最后定容过滤后待检。

所述的冲洗进行6次，每1次25mL。

所述的真空浓缩是指：在真空减压条件下于60℃水浴槽中浓缩至15mL。

所述的定容过滤是指：洗涤定容至20mL，过0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜。

技术效果

与现有技术相比，本发明针对沼生植物的根际分泌物进行收集及提取。所涉及的根际分泌物收集方法与装置是在无菌条件下进行，可避免微生物分泌物对根分泌物的影响。由于收集的过程也是根际分泌物分泌的过程，且不扰动植物生长箱中的植物，因此本装置可真正实现在现实栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准确收集和研究根系分泌物。

附图说明

图1为本发明所适用于沼生植物根际分泌物提取的方法和装置；

图中：1为植物生长箱、2为根际分泌物萃取箱、3为第一出水口，内部设有玻璃棉、4为第二出水口、内部设有玻璃棉、5为流量调节阀、6为射流装置、7为充气泵、8为管道、9为进水管、10为放空管、11为穿孔板、12为固定爪钳、13为固定架。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

如图1所示，本实施例包括：植物生长箱1和根际分泌物萃取箱2，其中：植物生长箱1的下方设有第一出水口3，流量调节阀5位于植物生长箱1出水口与根际分泌物萃取箱2之间的管路上。根际分泌物萃取箱2的下方设有第二出水口4，放空管10和射流装置6位于根际分泌物萃取箱2出水管路上，根际分泌物萃取箱2出水管路的尾端设在植物生长箱1的上方正中央。

所述的生长箱1的尺寸为100mm*100mm*150mm，内部设有石英砂，设有高度100mm，箱体内种植即将提取根际分泌物的沼生植物，箱体外覆盖铝箔，避免光照的影响。

所述的植物生长箱1也可由棕色玻璃瓶改制而成，用不锈钢锯将玻璃瓶底部锯掉，并用砂布将棱角磨平，洗净后用铝箔包好。在瓶口橡皮塞中部打一直径为7mm的孔，外面涂一层硅酮，以防橡皮塞中有机成分的溶出。

所述的植物生长箱1底部通过第一出水口3与分泌物萃取箱2相连，该第一出水口3的管径为8mm。

所述的植物生长箱1和第一出水口3之间设有玻璃棉，玻璃棉经2mol/L的HCl浸泡24h，用自来水、去离子水冲洗干净，用玻璃棒将玻璃棉压成所需的形状和厚度，设有到第一出水口3口上部。

所述的第一出水口3与分泌物萃取箱2之间设有用来调节流量的阀门。

所述的分泌物萃取箱2的尺寸为50mm*50mm*150mm，分泌物萃取箱2外部设有铝箔，内部设有用于吸附采集的树脂。

所述的树脂包括：为HZ816中性大孔吸附树脂、714强阴离子吸附树脂、732强阳离子吸附树脂，分别收集中性、酸性及碱性部分根分泌物，三种树脂的用量均为分泌物萃取箱2容积的1/3。

分泌物萃取箱2底部的第二出水口4设有避免树脂随水流出的玻璃棉。

所述的第一出水口3和第二出水口4与各自箱体之间设有穿孔板11，穿孔板11下出水口内均匀设有玻璃棉。穿孔板上孔径为5mm。

所述的放空管10上设有阀门。

本实施例中的根际分泌物收集装置总尺寸为200mm*200mm*500mm，可放入无菌室操作，确保分泌物提取时不受外来细菌干扰。

本实施例采用上述装置进行芦苇根际分泌物的提取，包括以下步骤：

1)用自来水将根际分泌物收集装置冲洗干净后，再用去离子水冲洗根际分泌物收集装置。分泌物收集循环装置的各组件采用H₂O₂蒸汽灭菌器进行灭菌处理；

2)选择根系较发达的芦苇幼苗，在无菌室中将其栽植于植物生长箱中。加入1500mL去离子水。每日浇水，一个月后植物适应新环境，根系粗壮。

3)当植物在植物生长箱生长一段时间后，植物生长状态稳定并已经有一定量的根际分泌物产生。此时，将中部的循环阀门拧开，先用蒸馏水洗4次，然后再用去离子水洗2次，将已分泌的根际分泌物淋洗掉。然后将玻璃柱、充气泵及其它配件装上，分别收集中性、酸性及碱性部分根分泌物，各树脂装填厚度均为50mm。

所述的树脂装填三种，分别为HZ816中性大孔吸附树脂；714强阴离子吸附树脂；732强阳离子吸附树脂。

所述的树脂经以下预处理：

①取250g HZ816中性大孔吸附树脂于1000mL烧杯中，以去离子水浮选；然后用3‐5％的盐酸浸泡2小时，用去离子水洗至中性；接着用3‐5％的氢氧化钠浸泡4小时，用去离子水洗至中性。之后用高于树脂层10cm左右的无水乙醇浸泡24小时，同样操作做3次。最后补无水乙醇至刻线，以免蒸发作用使树脂层裸露。

②取250g 732强阳离子树脂于1000mL烧杯中，以去离子水浮选；然后用pH4.0HCl溶液淋洗杂质，最后用pH＝4.0盐酸缓冲液溶胀浸泡直至装柱。

③取250g 714强阴离子树脂于1000mL烧杯中，以去离子水浮选；然后用pH＝8.0氢氧化钠溶液淋洗杂质，最后用pH＝8.0氢氧化钠缓冲液溶胀浸泡直至装柱。

4)启动所述沼生植物根际分泌物提取装置，在真空气压的作用下，去离子水进入植物生长箱中，液体在整个装置内循环流动，形成根分泌物封闭收集循环，开始正式收集根际分泌物，收集分泌物的时间为5天。

所述的分泌物淋洗液循环水流速度控制为1L/h

5)收集完成后，将玻璃柱取下，抽出玻璃管中树脂内多余的水分。回收各层树脂。用甲醇、pH4.0HCl溶液、pH＝8.0的氢氧化钠溶液分别洗出根分泌物(洗6次，每1次25mL)。用定性滤纸每部分根分泌物溶液分别在真空减压条件下于60℃水浴槽中浓缩至15mL，然后洗涤定容至20mL，过0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜，将滤液在冰箱(5℃)中保存直至测定。

经检测，经过本装置收集的分泌物可有效分析出分泌物中的蛋白质、糖类和氨基酸成分。实施例中经分析检测，芦苇中的根际分泌的营养物质中，总糖平均含量为35.29μg/mL，蛋白质平均含量为48.73μg/mL，总氨基酸平均含量为56.24μg/mL。

为了保证根际分泌物的收集数量与质量，建议分泌物收集时间以5天为宜，收集过程无需人工，操作简单方便，本装置安装方便，不易维修，可连续使用，每次采集过程中的能耗只需要水射器真空启动。按水量1.5L，水泵功率30w计算，每天运行24h，每天耗能(30/1000)*24＝0.72Kw.h，收集一次根际分泌物按5天计，则共耗电3.6度，每度电约0.6元，则需2.16元电费完成一次根际分泌物收集。

Claims (9)

1.一种沼生植物根际分泌物提取装置，其特征在于，包括：植物生长箱和与之相连的分泌物萃取箱，其中：植物生长箱的输入端接收植物生长养分，输出端与分泌物萃取箱相连，通过分泌物萃取箱对根际分泌物进行吸附采集；

所述的植物生长箱的输入端和所述的分泌物萃取箱的出水端之间设有循环供气机构，该循环供气机构包括：连接植物生长箱的输入端和分泌物萃取箱的出水端的管路以及与该管路相连的充气泵，通过空气的气提真空作用，使得分泌物萃取箱的出水重新回流至植物生长箱。

2.根据权利要求1所述的沼生植物根际分泌物提取装置，其特征是，所述的植物生长箱内部设有石英砂，箱体内种植沼生植物，箱体外覆盖铝箔，避免光照的影响。

3.根据权利要求1或2所述的沼生植物根际分泌物提取装置，其特征是，所述的植物生长箱为棕色玻璃瓶制成，植物生长箱底部通过第一出水口与分泌物萃取箱相连，植物生长箱和第一出水口之间设有玻璃棉。

4.根据权利要求1所述的沼生植物根际分泌物提取装置，其特征是，所述的分泌物萃取箱外部设有铝箔，内部设有用于吸附采集的树脂，分泌物萃取箱底部的第二出水口设有避免树脂随水流出的玻璃棉。

5.根据权利要求4所述的沼生植物根际分泌物提取装置，其特征是，所述的树脂包括：为HZ中性大孔吸附树脂、强阴离子吸附树脂、强阳离子吸附树脂，分别收集中性、酸性及碱性部分根分泌物，三种树脂的用量均为分泌物萃取箱容积的1/3。

6.根据权利要求3或4所述的沼生植物根际分泌物提取装置，其特征是，所述的玻璃棉经HCl浸泡，并经冲洗干净后压成所需的形状和厚度。

7.一种根据上述任一权利要求所述装置的沼生植物根际分泌物收集方法，其特征在于，将待测定的沼生植物培养于所述装置中，并在其开始产生根基分泌物后向分泌物萃取箱中装入树脂，启动循环供气机构实现内循环流动，实现根际分泌物的采集。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述方法具体包括以下步骤：

1)用自来水将根际分泌物收集装置冲洗干净后，再用去离子水冲洗根际分泌物收集装置；分泌物收集循环装置的各组件采用H₂O₂蒸汽灭菌器进行灭菌处理；

2)选择根系较发达的芦苇幼苗，在无菌室中将其栽植于植物生长箱中，加入1500mL去离子水，每日浇水并持续一个月。

3)当植物生长状态稳定并产生根际分泌物时，将中部的循环阀门拧开，先用蒸馏水洗4次，然后再用去离子水洗2次，将已分泌的根际分泌物淋洗掉后，分别收集中性、酸性及碱性部分根分泌物，各树脂装填厚度均为50mm；

4)启动所述沼生植物根际分泌物提取装置，在真空气压的作用下，去离子水进入植物生长箱中，液体在整个装置内循环流动并形成根分泌物封闭收集循环，收集分泌物的时间为5天；

5)收集完成后回收各层树脂，用甲醇、pH4.0HCl溶液、pH＝8.0的氢氧化钠溶液分别洗出根分泌物，再用定性滤纸每部分根分泌物溶液分别在真空减压条件下于60℃水浴槽中浓缩至15mL，然后洗涤定容至20mL，过0.45μm的醋酸纤维微孔滤膜即得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的树脂经以下预处理：

①取250g HZ816中性大孔吸附树脂于1000mL烧杯中，以去离子水浮选；然后用3‐5％的盐酸浸泡2小时，用去离子水洗至中性；接着用3‐5％的氢氧化钠浸泡4小时，用去离子水洗至中性；之后用高于树脂层10cm左右的无水乙醇浸泡24小时，同样操作做3次；最后补无水乙醇至刻线，以免蒸发作用使树脂层裸露；

②取250g 732强阳离子树脂于1000mL烧杯中，以去离子水浮选；然后用pH4.0HCl溶液淋洗杂质，最后用pH＝4.0盐酸缓冲液溶胀浸泡直至装柱；

③取250g 714强阴离子树脂于1000mL烧杯中，以去离子水浮选；然后用pH＝8.0氢氧化钠溶液淋洗杂质，最后用pH＝8.0氢氧化钠缓冲液溶胀浸泡直至装柱。