CN104744576B - 对舞毒蛾有杀虫活性的Bt蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了对舞毒蛾有杀虫活性的Bt蛋白及其应用，所述蛋白来源于苏云金芽胞杆菌，选自Cry1Ac蛋白、Cry2Ab蛋白、Cry1Ca蛋白或Vip3Aj蛋白中的至少一种。此外，本发明还提供了将上述的Bt蛋白进行两两配比得到的Bt蛋白组合。上述对舞毒蛾具有杀虫活性的蛋白将为舞毒蛾的有效控制提供新的材料，同时新基因的发掘将为转基因植物的培育和基因工程杀虫剂的生产提供有效的基因来源。另外，上述对舞毒蛾高毒力的Bt蛋白组合，不但可以提高杀虫活性，而且能有效解决和抑制Bt单价基因在应用过程中存在的杀虫谱窄、害虫易产生抗性等问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及几种对舞毒蛾具有杀虫活性的Bt蛋白、Bt蛋白组合及其应用。
背景技术
舞毒蛾Lymantria dispar(Linnaeus)具有分布广、食性杂、危害重、幼虫顺风迁移等特点，是世界性的农林业害虫。它起源于欧亚大陆，目前主要分布在亚洲、欧洲和北美洲，在温带全北区曾引发大范围的暴发。舞毒蛾在国内几乎各省均有分布，幼虫以树叶为食，危害多种针阔叶树种和果树，其寄主多达500多种，尤其是杨树、柳树、桦树、枫树、栎树等，甚至危害苹果、梨、柑桔等农作物。有效控制舞毒蛾种群密度，使林木免受危害，是一项长期而艰巨的任务。
苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(简称Bt)产生的伴胞晶体对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种农林害虫具有特异的杀虫活性，并且具有对人畜无害，不污染环境等优点，使Bt制剂成为目前世界上产量最多、应用最成功的微生物杀虫剂。Bt蛋白特异性强、种类繁多，筛选对舞毒蛾具有高毒力的Bt蛋白和基因，将为舞毒蛾的有效控制提供新的材料，同时新基因的发掘将为转基因植物的培育和基因工程杀虫剂的生产提供有效的基因来源。
另外，不同Bt蛋白基因的协同增效作用不但可以提高杀虫活性，而且能有效解决和抑制Bt单价基因在应用过程中存在的杀虫谱窄、害虫易产生抗性等问题。Cry蛋白间的协同增效作用已在多种农林业害虫身上得到证实，但未见针对舞毒蛾的Bt蛋白的协同增效研究，因此，在筛选出高毒力Bt蛋白的基础上，探索几种蛋白对舞毒蛾的协同毒力作用将进一步提高对舞毒蛾的防治效果，将会为工程菌的构建和转基因抗虫作物的培育提供优良的杀虫基因组合，延缓抗性产生。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供了几种对舞毒蛾具有杀虫活性的Bt蛋白，以期解决舞毒蛾生物防治资源的匮乏。
为实现上述目的，采用如下技术方案：
本发明提供了对舞毒蛾有杀虫活性的Bt蛋白，所述蛋白来源于苏云金芽胞杆菌，所述蛋白选自Cry1Ac蛋白、Cry1Ca蛋白、Cry2Ab蛋白或Vip3Aj蛋白中的至少一种。
本发明的一个优选方面，上述对舞毒蛾有杀虫活性的Bt蛋白是如下序列组成的蛋白：其中，Cry1Ac蛋白是如下1)或2)：
1)序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；
2)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸组成的且具有1)相同功能的蛋白；
Cry1Ca蛋白是如下3)或4)：
3)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
4)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸组成的且具有3)相同功能的蛋白；
Cry2Ab蛋白是如下5)或6)：
5)序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白；
6)在序列表中序列3的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸组成的且具有5)相同功能的蛋白；
Vip3Aj蛋白是如下7)或8)：
7)序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白；
8)在序列表中序列4的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸组成的且具有7)相同功能的蛋白。
本发明的再一个目的是提供了将上述Bt蛋白进行两两配比得到的Bt蛋白组合。
本发明的一个优选的方面是，上述Bt蛋白组合是对舞毒蛾具有协同增效杀虫效果的Bt蛋白组合。
进一步地，所述蛋白组合选自Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白组合、Cry1Ac蛋白和Cry1Ca蛋白组合或Cry1Ac蛋白和Vip3Aj蛋白组合的至少一种。
更近一步地，所述Bt蛋白组合选自Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白组合或Cry1Ac蛋白和Cry1Ca蛋白组合的至少一种。
再更一步优选地，所述Bt蛋白组合选自Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白组合。
本发明还提供了上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白组合在制备舞毒蛾杀虫剂上的应用。
本发明还提供了上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白组合在制备转基因植物上的应用。
本发明还提供了含有上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白组合的杀虫剂或生物制剂。
本发明还进一步提供了含有上述的Bt蛋白和/或Bt蛋白组合的转基因植物。
本发明提供的对舞毒蛾具有杀虫活性的几种Bt蛋白将为舞毒蛾的有效控制提供新的材料，同时新基因的发掘将为转基因植物的培育和基因工程杀虫剂的生产提供有效的基因来源。
本发明还进一步的提供了通过上述方法筛选得到的对舞毒蛾高毒力的几种Bt蛋白组合，不但可以提高杀虫活性，而且能有效解决和抑制Bt单价基因在应用过程中存在的杀虫谱窄、害虫易产生抗性等问题，因此有望对其进行多基因转基因作物的研发，治理具有一定抗药性的害虫。也将为工程菌的构建和转基因抗虫作物的培育提供优良的杀虫基因组合。
附图说明
图1为十一种蛋白SDS-PAGE电泳结果图；其中，从左至右依次为：1为Cry1Ab蛋白，2为Cry1Ac蛋白，3为Cry1Ah蛋白，4为Cry2Ab蛋白，5为Cry1Ca蛋白，6为Cry9Ee蛋白，7为Vip3A蛋白，8为Vip3Ag蛋白，9为Vip3Aj蛋白，10为Cry1Bb蛋白，11为Cry1Be蛋白，标记物。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
本发明所用的菌株均来自中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室。
本发明所用到的培养基和试剂：
液体LB培养基：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠，pH7.0，121℃，灭菌20min；
牛肉膏蛋白胨培养基：0.3％牛肉膏、0.5％大豆蛋白胨、50mmol/L Tris-Base，pH7.2，121℃，灭菌20min；
裂解液：50mmol/L Na2CO3和EDTA，pH9.5，121℃灭菌20min；
Tris-HCl缓冲液：20mmol/L，pH8.0，121℃灭菌20min；
Na2CO3：50mmol/L，pH9.5，121℃灭菌20min；
实施例1
1、蛋白制备及定量
1)Cry1Bb、Cry1Be、Cry9Ee、Vip3Ag、Vip3Aj、Vip3Aa蛋白在大肠杆菌中的表达
37℃，230rpm，活化菌种12h；1％接种于200mL LB培养基(加入1/1000相应的抗生素)，37℃，220rpm培养至OD600值为0.5；加入诱导物IPTG，终浓度为0.5mM，150rpm，30℃诱导12小时；4℃，12000rpm离心10min收集菌体，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)悬浮；超声破碎菌体，功率80％，超声10min(超3s停5s)；4℃，12000rpm离心10min；收集上清及沉淀分别检测，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)悬浮；SDS-PAGE电泳分析，电泳结果见图1。
2)Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1Ca、Cry1Ac、Cry1Ah蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达
30℃，230rpm，活化菌株12h；1％接种于300mL牛肉膏蛋白胨培养基(加入1/1000相应的抗生素)，30℃，220rpm培养约20-24h，镜检观察视野中50％以上的菌体裂解则停止培养；4℃，8000rpm离心10min收集菌体后，分别用预冷1M NaCl和无菌水洗涤；菌体加入裂解液和裂解液体积3％的β-巯基乙醇(pH9.5-10)，110rpm裂解4-8h(冰盒中)；4℃，12000rpm离心20min，取上清并加上清1/7体积的4M NaAc-HAc(pH 4.5)，沉淀1-4h(4℃)；4℃，12000rpm离心15min，沉淀用预冷无菌水洗2遍，溶于50mmol/L Na2CO3(pH 9.5)；SDS-PAGE电泳分析，电泳结果见图1。
3)定量
使用National Institutes of Health开发的imagej(1.44)软件分析蛋白SDS-PAGE图谱并定量，具体使用方法参看ImageJ User Guide 1.44，定量结果如下：Cry2Ab-1.27μg/μl、Cry1Ah-1.5μg/μl、Cry1Ca-2.4μg/μl、Cry1Ac-4.0μg/μl、Cry1Ab-8.1μg/μl、Vip3Aa-14μg/μl、Cry1Bb-0.7μg/μl、Cry1Be-2.5μg/μl、Cry9Ee-0.7μg/μl、Vip3Aj-13.9μg/μl、Vip3Ag-5.6μg/μl。
2、舞毒蛾饲养
舞毒蛾卵块(来自中国林业科学院昆虫病毒研发中心)用10％甲醛消毒1h，清水洗净，晾干后放在人工饲料上，在塑料养虫盒上打孔，放在光照恒温培养箱中等待孵化(日照长度16h，温度25℃，湿度70％-80％)，孵化后选取三日龄幼虫作为试验饲喂对象。
3、初筛
每种Bt蛋白按10ppm和100ppm(1ppm＝1μg/g)两种浓度混拌饲料，每种浓度设3个重复，每个重复饲喂20头幼虫。因十一种Bt蛋白分别以Tris-HCl作为溶剂，所以本试验以Tris-HCl(20mmol/L pH8.0)、Na2CO3(50mmol/L pH9.5)作为对照。将三日龄幼虫用软刷轻扫到人工饲料上面，在光照恒温培养箱中饲养。每日观察，统计5日的舞毒蛾死亡率，统计结果见表1：
表1 对舞毒蛾幼虫高毒力Bt蛋白的初筛结果
从上表中的结果发现，对照组饲喂的舞毒蛾幼虫生长良好，部分已进入二龄，而含Bt蛋白的饲料饲喂的幼虫则表现出不同程度的生长不良和死亡现象。测试的11种Bt蛋白中，Cry1Ac和Cry1Ab在两种饲喂浓度下均表现优越，100ppm时的校正死亡率分别达到98.24％和100％，同时Cry2Ab、Cry1Ca、Cry1Be和Vip3Aj四种蛋白也表现出一定的杀虫潜力，100ppm时的校正死亡率均在40％左右。此外，从观察结果可知，食用Bt蛋白死亡的幼虫身体发黑、溃烂，存活的幼虫和对照相比食量减少，生长速度减慢，活动量减少。
4、复筛及致死中浓度测定
根据上述初筛的结果，选取Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ca、Vip3Aj四种蛋白测定致死中浓度(LC50)。每种蛋白依照初筛时的结果进一步设置5到6个浓度梯度，每种浓度设3个重复，每个重复饲喂20头幼虫。对照组设置及蛋白混拌方法参照3的初筛方法。统计7日死亡率，最后使用spss软件计算(LC50)，统计结果见表2：
表2 四种Bt蛋白对舞毒蛾幼虫生物活性测定结果
从上表中可见：Cry1Ac蛋白7日的实测LC50达到了2.471μg·g-1，表现出了较强的杀虫活性；同比之下Cry2Ab和Cry1Ca两种蛋白的实测LC50分别为29.190μg·g-1和42.448μg·g-1，也具有一定的杀虫活性；Vip3Aj杀虫活性较弱，为101.264μg·g-1。
5、协同增效研究
在复筛结果的基础上，将Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ac+Cry1Ca、Cry1Ac+Vip3Aj、Cry2Ab+Cry1Ca分别按1:1比例混配后再次对舞毒蛾幼虫进行活性分析，获得混配蛋白的实测LC50值。
根据试验结果计算预期LC50值和协同毒力指数，采用Tabashnik公式法计算，公式如下：
协同毒力指数＝预期LC50/实测LC50
一般认为，预期LC50与实测LC50的毒力比在0.5-2.6之间属相加作用，大于2.6属增效作用，小于0.5时属拮抗作用。
混配蛋白的实测LC50、预期LC50及协同毒力计算结果见表3：
表3 混配蛋白对舞毒蛾幼虫生物活性测定结果
生物活性测定的结果表明，Cry1Ac和Cry2Ab蛋白组合对舞毒蛾幼虫的LC50为0.642μg·g-1，Cry1Ac和Cry1Ca蛋白组合对舞毒蛾幼虫的LC50为0.758μg·g-1，Cry1Ac+Vip3Aj蛋白组合对舞毒蛾幼虫的LC50为1.063μg·g-1，三个组合都表现出对舞毒蛾的高毒力。上表中的结果显示Cry1Ac+Cry2Ab混配蛋白协同毒力指数最高，为7.098，大于2.6,说明有较好的协同增效作用；Cry1Ac+Cry1Ca和Cry1Ac+Vip3Aj混配蛋白协同毒力指数分别为6.162和4.539，说明也具有协同增效作用；而Cry2Ab+Cry1Ca混配蛋白协同毒力指数0.753在0.5-2.6之间仅属相加作用，说明无增效作用。
Claims (8)
1.Bt蛋白组合，其特征在于，所述蛋白组合选自1：1质量比的Cry1Ac蛋白和Cry1Ca蛋白组合或1：1质量比的Cry1Ac蛋白和Vip3Aj蛋白组合的至少一种；
其中，Cry1Ac蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；Cry1Ca蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示；Vip3Aj蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的Bt蛋白组合，其特征在于，所述Bt蛋白组合为Cry1Ac蛋白和Cry1Ca蛋白组合。
3.根据权利要求1所述的Bt蛋白组合在防治舞毒蛾中的应用，所述Bt蛋白组合是对舞毒蛾具有协同增效杀虫效果的Bt蛋白组合。
4.Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白组合在防治舞毒蛾中的应用，所述Bt蛋白组合是对舞毒蛾具有协同增效杀虫效果的Bt蛋白组合；
Cry1Ac蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；Cry2Ab蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
5.权利要求1所述的Bt蛋白组合在制备舞毒蛾杀虫剂上的应用。
6.Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白组合在制备舞毒蛾杀虫剂上的应用；
Cry1Ac蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；Cry2Ab蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
7.权利要求1所述的Bt蛋白组合在制备用于防治舞毒蛾的转基因植物上的应用。
8.含有权利要求1所述的Bt蛋白组合的杀虫剂或生物制剂。
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