CN104739541A - 家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学动物模型技术领域，具体为一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法。作为一种研究工具，该模型复制肾移植低温机械灌注过程，其特点是采用了在体自体肾移植方式，构建步骤包括：术前准备；麻醉、固定、备皮，常规开腹；夹闭肾蒂腹腔探查；再灌注；在体模拟肾脏体外低温机械灌注（MP）保存；血管缝合；膀胱造瘘；右肾切除；关闭腹腔；术后维持。本模型消除了由同种异体的供肾所导致的免疫排斥反应，同时由于并未将肾脏完全离体，这使得血管缝合变得简单，缝合时间缩短，血管损伤减少，当用于研究MP机制时，减少了这些因素的干扰，且该模型操作简单、可重复性好。

Description

家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法

技术领域

    本发明属于医学动物模型技术领域，具体涉及一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型的构建方法。

背景技术

肾移植是治疗终末期肾病最有效的手段。据统计，中国目前每年进行肾移植5000例左右【1】，但日益严重的供肾匮乏困扰着广大患者及移植医生。为此，卫生部自2010年起开始启动心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death，DCD)试点工作，运行良好，自2015年1月1日起，公民逝世后器官捐献已成为供体的唯一来源。但DCD相比于脑死亡供者(donor after brain death, DBD) 来说存在一些缺点【2】。例如，DCD供体器官热缺血时间较长，导致术后移植物原发性无功能（primarynonfunction，PNF）或功能延迟恢复(delayed graft function，DGF)的发生率高【3】。此外，供肾保存方式对移植后肾功能恢复亦有影响。多个移植中心报道传统静态冷储保存的DCD供肾移植受者移植肾功能延迟恢复(delayed graft function，DGF)发生率高达40％ ～90％【4-5】。DGF是肾移植术后早期常见并发症，常导致受者和移植肾长期存活率降低【6】，发生DGF受者1年生存率低于未发生DGF受者(74％与90％)【7】。鉴于此，随着边缘供者和DCD供肾的增加，传统的静态冷储（cold storage，CS）已经无法应对新形势下的保存需求，故新的保存策略肾脏低温机械灌注（machine perfusion，MP）得到推崇。多个国际随机临床试验均证实，MP相比CS来说，可以明显降低脑死亡、DCD和扩大标准供体（ECD）的DGF发生率、提高移植物的1年生存率和3年生存率。

从理论上讲, MP可能促进毒素的排泄和提供营养；MP也可以减少血管痉挛但是没有直接证据；MP能够将灌注液从肾动脉灌入到肾脏内部，起到冲刷血管，保护血管床的作用。但MP的保护机制仍然不为人所知。为了进一步研究机制，稳定可靠、重复性高的动物模型成为首选。目前，低温机械灌注模型多以猪、犬等大型动物为研究对象，如：Anja Gallinat、Nader Vaziri 等人分别做过同种异体猪肾移植和Susanne Lindell等人用犬来研究UW液的保护供肾的作用【8-10】。Hauet T等人于2000年在J Am Soc Nephrol发表过一篇关于猪的自体肾移植的模型制作方法的文章，他选用的手术方式为自体肾移植，其意义在于消除了由同种异体的供肾所导致的免疫排斥反应，排除免疫系统的干扰，但存在缝合时间长，血管损伤大的缺陷，对于观察MP的保护机制仍有影响【11】。另外，参照临床肾移植的整个过程，是否能在小型动物上模拟人体DCD肾移植全过程？家兔，相较于大小鼠，其实验难度减少，虽然Gregory M. Fahy 和Suja E. Ali做过家兔肾脏常温灌注【12】，但未见有利用家兔为模型基础来研究低温机械灌注机制的报道。因此，我们提出了家兔肾脏在体低温机械灌注模型，希望能够为将来MP机制的研究提供稳定的模型基础。

参考文献：

1、全国器官移植概况暨数据质量核查[DB/OL]。中国肾移植科学登记系统，2011[2013-01-10]。http://www.haven.net.cn/main/index.do.

2、Deng, R., Gu, G., Wang, D., et al. Machine perfusion versus cold storage of kidneys derived from donation after cardiac death: a meta-analysis. PLoS. One. 8, e56368 (2013).

3、Tsoulfas, G., Nagelschmidt, M., Minor, T., et al. Commentary on: Lipid peroxidation in machine perfusion of older donor kidneys. J. Surg. Res. 185, e43-4 (2013).

4、Farney AC, Singh RP, Hines MH , et a1. Experience in renal and extrarenal transplantation with donation after cardiac death donors with selective use of extracorporeal support.  J Am Coll Surg, 206(5): 1028-1037(2008).

5、Barlow AD, Metcalfe MS, Johari Y, et al. Case-matched comparison of long-term results of non-heart beating and heart-beating donor renal transplants．Br J Surg, 96(6): 685-691(2009).

6、Halloran PF, Hunsicker LG. Delayed graft function: state of the art. Am J Transplant, 1(2): 115-120(2001).

7、Moers C, Smits JM, Maathuis MH, et a1. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Ensl J Med, 360(1): 7-19(2009)．

8、Gallinat, A., Fox, M., Lüer, B., et al. Role of pulsatility in hypothermic reconditioning of porcine kidney grafts by machine perfusion after cold storage. Transplantation 96, 538-42 (2013).

9、Vaziri, N., Thuillier, R., Favreau, F.D., Eugene, M., Milin, S. & Chatauret, N.P. Analysis of machine perfusion benefits in kidney grafts: a preclinical study. J. Transl Med. 25, 9-15 (2011).

10、Lindell, S., Nobel, M., Rankin, M., et al.  Optimal pH for simple cold storage or machine perfusion of dog kidneys with UW solution. Transpl. Int. 11, 208-11 (1998).

11、Hauet, T., Goujon, J.M., Vandewalle, A., et al. Trimetazidine reduces renal dysfunction by limiting the cold ischemia/reperfusion injury in autotransplanted pig kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 11, 138–148 (2000).

12、Fahy, G.M. & Ali, S.E. Cryopreservation of the mammalian kidney II. demonstration of immediate ex vivo function after introduction and removal of 7.5 M cryoprotectant. Cryobiology 35, 114-31 (1997).

发明内容

本发明的目的在于提供一种不将肾脏完全离体，使得血管缝合变得简单，而且缝合时间缩短，血管损伤减少的家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法。

本发明提供的家兔肾脏在体低温机械灌注模型由下述方法构建。构建方法的具体步骤如下：

1、术前准备

每次挑选两只3.2-3.8kg的雄性家兔在术前36-48h撤去饲槽，术前禁食36-48h，但需要给予充足水分。

2、术中操作

2.1麻醉  抓取禁食后的雄性家兔，称取体重。按3ml/kg右耳缘静脉注射1%的戊巴比妥钠溶液。待家兔出现角结膜反应消失或迟钝，钳夹反射消失，呼吸平稳，身体紧张度降低时，表示麻醉完成。固定头皮针，建立静脉通道，静注5%葡萄糖溶液，维持家兔基础体温（38±0.5℃）。

2.2固定 将加热板放在手术台上，温度设定为45.0℃。将家兔放在加热板上，采取仰卧位固定家兔四肢和头部，保持呼吸通畅。

2.3 备皮 自剑突至耻骨联合腹部正中切口的备皮，同时将左腹部及左腰部充分备皮。左股内侧备皮，贴上电刀负极板。同时将肛温探头插入肛门，注意将粪便排出后插入。

2.4 洗手、消毒、铺巾。

2.5 开腹 连接好电刀、吸引器后常规开腹，采用腹部正中切口，自剑突下至耻骨联合上3-5cm，将皮肤划开。发现出血时，可采用纱布按压法和电凝法止血，少用结扎法。待皮肤切口出血止住后，再用电刀沿腹白线切开肌肉。注意切开肌层时一定要稍稍提起肌肉，防止损伤腹腔脏器。肌层出血较多，血液易渗出，常采用电凝止血或切口缝扎法止血。确定血液不再渗出为止。

2.6夹闭肾蒂 腹腔探查：用棉垫和纱布保护切口边缘，将腹腔内脏器稍向右扒开，并用纱布遮盖，并用45.0℃温生理盐水时刻保湿保温，防止肠道坏死和脱水粘连。暴露左肾并游离左输尿管。钝性分离肾动静脉，注意分离静脉时，动作轻柔，防止拉伤撕破。分离动脉时，要确定有无动脉畸形或多支动脉，动脉鞘要分离干净，分离长度为1.5-2cm。分离完成后，用动脉夹先夹闭输尿管再同时夹闭肾动静脉，在夹闭的一瞬间，同时开始计时。夹闭时间为25min或35min。用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温（38±0.5℃）。从左耳缘静脉抽取血液，进行血气分析。

2.7 再灌注  在到达25min或35min之前1min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，在到达25min或35min那一刻松开两个动脉夹。观察肾脏颜色质地，理应见到肾脏变红变软，无瘀斑，动脉恢复搏动。注意保护肠道。并开始计时。用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温。再灌注时间为1h。

2.8 模拟肾脏体外低温机械灌注保存（MP组） 在到达1h之前，提前30min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，注意保护肠道。此时将5%葡萄糖溶液换成羟乙基淀粉溶液，静注。做腹部横向切口，切缘与左肾蒂平行，长度为7-9cm，使横向切口与原切口呈横“T”形，并止血。止血完成后，右耳缘静脉推注0.3ml（1875 IU）肝素。推注完成后开始准备肾动脉穿刺装置（静脉留置针、输液器及4℃肝素化的枸橼酸肾脏保护液）。游离左肾，将左肾与周围组织分离，切勿将输尿管及肾蒂切断。并结扎止血，防止周围组织渗血。在1h到达的时刻，用动脉夹同时夹闭肾动静脉，再用另一只动脉夹夹闭输尿管。然后在肾动脉上带上两根3-0慕思线备用。左手牵近心端的线，右手使用静脉留置针穿刺肾动脉。准备碎冰、4℃枸橼酸肾脏保存液及肾袋。穿刺完成后，打开输液器，待肾脏颜色变白后，用留置针的针头轻轻点刺肾静脉，此时有水柱涌出。观灌注速度，防止留置针滑脱或阻塞。然后结扎远心端，注意不要过紧或过松，防止滑脱。再结扎近心端。将肾套在肾袋内，向肾袋内注入4℃枸橼酸肾脏保存液同时收住肾袋口，不宜过紧，防止留置针阻塞。注意观察流注速度,确定流注速度未变化后，适当移动兔子的位置，使左肾能从横向切口中牵出体外，切记不要拉断肾动静脉和输尿管。将保存有肾脏的肾袋脱出家兔左侧体外，在体保存在装有冰水混合物的圆盘中。此时可以装上lifeport灌注仪，进行低温机械灌注保存。完成后，缝合“T”型伤口和腹部正中切口皮肤，恢复腹温。时刻观察lifeport灌注仪的灌注流量及机器运转状况（压力为60mmHg，流量控制在15-20ml/min）。此时可以将羟乙基淀粉溶液换成5%葡萄糖溶液，速度为5秒/滴。在体进行肾脏机械灌注4h, 在这4h内监测家兔生命体征，时刻保持盘子内有充足的碎冰。确定引流管通畅。保存到第2h时，进行第二次血气分析。

2.9 血管缝合  在到达4h之前，提前20min检测第三次血气分析，同时准备50ml 4℃乳酸林格氏溶液，5ml碳酸氢钠，2ml肝素，2ml呋噻米，50ml肝素氯化钠和50ml 4℃生理盐水。提前5min打开正中切口及左腹横向切口，撤去lifeport灌注仪，停止灌注。同时换上羟乙基淀粉，静注1秒/滴。向肾脏中注入4℃乳酸林格氏溶液50ml以冲走残留于肾脏中的枸橼酸肾脏保存液。使用10-0带针缝合线先进行静脉缝合，再将动脉留置针取出后用10-0带针缝合线进行动脉缝合。在缝合血管时，要时刻注意肠道的保湿保温。并留意兔子的生命体征。血管缝合完毕后，肾动静脉远心端夹闭试漏，即打开两只动脉夹，确定动静脉有无出血，有无狭窄。恢复肾脏血供。此时耳缘静脉推注0.2ml肝素、0.5ml呋塞米和慢推5ml 5%碳酸氢钠。观察兔子的生命体征和肾脏状况。进行第四次血气分析。逐层细致关闭左腹横向切口。此时，准备造瘘管。

2.10 膀胱造瘘  确定造瘘位置，使用荷包缝合法，不要拉伤膀胱。此时耳缘静脉推注0.5ml呋塞米。

2.11 右肾切除  分离右肾蒂并双重结扎，分离输尿管并双重结扎，游离肾周围组织，结扎止血。剪断肾蒂和输尿管。右肾切除，止血。此时耳缘静脉推注0.5ml呋塞米。

2.12 关闭腹腔  清点器械，腹腔冲洗后逐层细致关闭腹腔。此时应将羟乙基淀粉换成乳酸林格氏溶液，静注5秒/滴。松开家兔固定装置，用吹风机将兔子吹干，尽快恢复体温。

3、术后维持

术后24h内监测兔子的生命体征，尿量及血气分析。及时纠正酸碱平衡紊乱，补足血容量，有助于恢复左肾脏功能。

与现有方法比较：

1、本模型采用经左肾动脉穿刺在体行低温机械灌注这一创新性的策略，后显微缝合穿刺点再灌注肾脏，模拟了临床DCD肾移植的全过程，消除了由同种异体肾移植所导致的免疫排斥反应，排除了免疫的因素。

2、本模型并未将肾脏完全离出体外，这使得血管缝合变得简单，而且缝合时间缩短，血管损伤减少，明显减轻了冷缺血损伤。

3、本模型使用的动物为家兔，相较于大小鼠，其实验难度减少；相较于猪、犬等大型动物，在体低温机械灌注模型其实验时间缩短，更有利于动物的存活。

4、本模型经一定程度的热缺血后再灌注1小时，此时间点行肾功能检测，保证所有样本在同一起点，具有均衡可比性。

5、本模型经过左肾热缺血不同时间的比较，建立了不同热缺血情况的低温保存体系。

因此，我们提出的家兔肾脏在体低温机械灌注模型，能够为MP机制的研究提供稳定的模型，可以用于低温机械灌注与冷保存的机制及应用研究；低温机械灌注液和器官保存液的基础和应用研究；模拟临床的肾脏缺血再灌注的基础和应用研究及不同DCD供肾的低温保存策略的基础和应用研究。

附图说明

图1为热缺血25分钟或35分钟低温MP组和CS组24小时生存率比较示意图；

由图显示，MP25min和CS25min两组分别比较24小时生存率均为100%,差异无统计学差异（p＞0.05）(图1A). 而MP35min和CS35min组的24小时生存率，前者为100％，后者为80％，差异有统计学意义（p＜0.05）(图1B) （n=5）。

图2为再灌注24小时后各组早期肾功能比较示意图；

由图显示，MP25min组24小时尿量高于CS25min组，两者差异有统计学意义（p＜0.05）；CS35min组24小时尿量也明显低于MP35min组尿量，两者差异有统计学意义（p＜0.05）(图2A)，各组柱状图误差线控制在均数的10%以内，具有很高的稳定性（n=5）； MP25min、MP35min组24小时肌酐明显低于各组的对照组CS组，差异有统计学意义(p＜0.05) (图2B)。

图3为术后24小时各组肾小管的厚度比较示意图；

各组肾脏HE染色示意图（图3A-3D），MP25min组近曲小管和远曲小管的厚度比CS25min组近曲小管和远曲小管的厚度低，差异有统计学意义(p＜0.05) (图3E)。MP35min组近曲小管和远曲小管的厚度比CS35min组近曲小管和远曲小管的厚度低，差异有统计学意义(p＜0.05) (图3F)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

材料与方法：

1 材料

1.1试剂

（1）健康雄性家兔24只（中国武汉万千佳禾实验动物养殖中心，SPF级、12-16周龄、体重3.5±0.3kg）。

（2）0.9％氯化钠溶液（中国武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，国药准字H42020474，批号1410070301）

（3）5％葡萄糖氯化钠注射液（中国石家庄四药有限公司，国药准字 H13022490，批号1407301403）

（4）1％活力碘（中国武汉运作精细化工有限公司）

（5）戊巴比妥（德国默克公司）

（6）头孢他啶（中国海南海灵化学制药有限公司，国药准字H20023524，批号1409053）

（7）乳酸钠林格注射液（中国石家庄四药有限公司，国药准字 H20044961，批号1404221703）

（8）呋塞米（中国广东南国药业有限公司，国药准字H44022506，批号1408131）

（9）葡萄糖酸钙（中国安阳九州药业，国药准字H41023479，批号1407660260）

（10）碳酸氢钠注射液（国药集团容生制药有限公司，国药准字H36020283，批号2014092915）

（11）羟乙基淀粉注射液（中国南京正大天晴制药有限公司，国药准字H20065430，批号1409253）

（12）离体肾保存用枸橼酸嘌呤溶液（中国上海长征医院）

（13）盐酸多巴胺（中国广州白云山明兴制药有限公司）

（14）肝素（中国万邦药业，批号1407102）

1.2器材

（1）一次性口罩（中国新乡市康民卫材开发有限公司）

（2）棉垫，纱布，棉球（中国新乡市康民卫材开发有限公司）

（3）一次性手术铺巾，一次性手术衣（中国新乡市康民卫材开发有限公司）

（4）1ml, 2.5ml, 5ml, 10ml, 20ml注射器 （中国江西洪达医疗器械集团有限公司）

（5）头皮针（中国江苏苏云医疗器械）

（6）敷贴(中国湖北五湖医疗器械集团有限公司)

（7）胶布（中国明尼苏达矿业制造医用器材有限公司）

（8）缝合线（强生中国医疗器材有限公司）注意，3-0用于缝皮肤，4-0用于结扎血管

（9）缝合针（中国上海浦东金环医疗用品股份有限公司）注意，三棱针用于缝合皮肤，圆针用于缝合肌肉和结缔组织

（10）显微器械（中国宁波市成和显微器械厂）

（11）带线缝合针（中国宁波医用缝针有限公司，批号130603）

（12）血气分析仪 （Abbott Point of Care inc. IL 60064,USA, SN 2-52661）

（13）Lifeport灌注仪  （Organ Recovery systems, IL, USA, SN LKT 1233508, REF LKT 100P）

（14）手术器械（中国上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂）

（15）JR-1/2智能恒温控制仪（中国成都泰盟科技有限公司）

（16）手术台（中国兴化市同昌不锈钢制品厂）

（17）DK-A动物专用高频电刀（中国合肥金脑人光电仪器有限责任公司）

2 方法

2.1 实验分组

健康成年新西兰家兔20只，雄性，体重(3.5±0.3) kg，选择体重超过3.0kg（最好大于3.2kg）是家兔术后存活的保障之一，12-16 周龄，随机分为MP组和CS组。进一步按照家兔左肾热缺血25min、35min，各组分别命名为MP25min组、CS25min组、MP35min组、CS35min组，各组5只家兔。

2.2家兔肾脏在体低温机械灌注模型和在体低温保存模型的建立

2.2.1术前准备

每次挑选两只3.2-3.8kg的雄性家兔在术前36-48h撤去饲槽，术前禁食36-48h，防止有意外死亡情况，但需要给予充足水分。手术开始前将手术器械经高温高压消毒后，放在铺有一次性无菌铺巾单的托盘上。动物加热电板及小型动物手术电刀提前装好。打开室内空调，手术室温度保持在25℃，湿度保持在50-70%。打开手术无影灯。严格的术前禁食以及洁净的实验室环境是实验成功的必备条件，未禁食的家兔容易在术中发生肠系膜淤血，肠道肿胀术后难以恢复，并且易发生肠道粘连性梗阻，导致家兔水电解质紊乱和酸中毒，存活率降低。

2.2.2术中操作

   （1）麻醉  抓取禁食后的雄性家兔，称取体重。使用规格为20ml的注射器和头皮针，按3ml/kg右耳缘静脉注射1%的戊巴比妥钠溶液。待家兔出现角结膜反应消失或迟钝，钳夹反射消失，呼吸平稳，身体紧张度降低时，表示麻醉完成。固定头皮针，建立静脉通道，静注5%葡萄糖溶液5秒/滴。维持家兔基础体温（38±0.5℃）。

   （2）固定  将加热板放在手术台上，温度设定为45.0℃。将家兔放在加热板上，采取仰卧位固定家兔四肢和头部，保持呼吸通畅。

   （3）备皮  自剑突至耻骨联合腹部正中切口的备皮，同时将左腹部及左腰部充分备皮。左股内侧备皮，贴上电刀负极板。同时将肛温探头插入肛门，注意将粪便排出后插入，否则探头弯曲后，温度测量不精确。

   （4）洗手  术者按临床无菌要求洗手，穿一次性无菌手术衣。

   （5）消毒  使用无菌纱布，活性碘浸湿后，采用叠瓦式消毒法充分消毒手术部位皮肤，重复3次。

   （6）铺巾  取一次性无菌孔巾，将腹部铺巾露出手术部位。并铺上一次性无菌中单，在铺巾中央剪出足以暴露手术视野大小的窗孔。

   （7）开腹  连接好电刀、吸引器后常规开腹，采用腹部正中切口，自剑突下至耻骨联合上3-5cm，将皮肤划开。发现出血时，可采用纱布按压法和电凝法止血，少用结扎法。待皮肤切口出血止住后，再用电刀沿腹白线切开肌肉。注意切开肌层时一定要稍稍提起肌肉，防止损伤腹腔脏器。肌层出血较多，血液易渗出，常采用电凝止血或切口缝扎法止血。确定血液不在渗出为止。

   （8）夹闭肾蒂  腹腔探查：用棉垫和纱布保护切口边缘，将腹腔内脏器稍向右扒开，并用纱布遮盖，并用45.0℃温生理盐水时刻保湿保温，防止肠道坏死和脱水粘连。暴露左肾并游离左输尿管。钝性分离肾动静脉，注意分离静脉时，动作轻柔，防止拉伤撕破。分离动脉时，要确定有无动脉畸形或多支动脉，动脉鞘要分离干净，分离长度为1.5-2cm。分离完成后，用动脉夹先夹闭输尿管再同时夹闭肾动静脉，在夹闭的一瞬间，同时开始计时。观察肾脏颜色质地，理应见到肾脏变暗变硬，动脉停止搏动。夹闭时间为25min/35min。用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温（38±0.5℃）。从左耳缘静脉抽取血液，进行第一次血气分析。

   （9） 再灌注  在到达25min/35min之前1min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，在到达25min/35min那一刻松开两个动脉夹。观察肾脏颜色质地，理应见到肾脏变红变软，无瘀斑，动脉恢复搏动。注意保护肠道。并开始计时。用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温。再灌注时间为1h。

   （10） 模拟肾脏体外保存（CS组） 在到达1h之前，提前30min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，注意保护肠道。此时将5%葡萄糖溶液换成羟乙基淀粉溶液，静注3秒/滴。做腹部横向切口，切缘与左肾蒂平行，长度为7-9cm，使横向切口与原切口呈横“T”形。并止血。止血完成后，右耳缘静脉推注0.3ml（1875 IU）肝素，为供肾肝素化，防止在夹闭肾动静脉后，残余在肾脏中的血液凝固，开放后造成栓塞。推注完成后开始准备肾动脉穿刺装置（静脉留置针、输液器及4℃肝素化的枸橼酸肾脏保护液）。游离左肾，将左肾与周围组织分离，切勿将输尿管及肾蒂切断。并结扎止血，防止周围组织渗血。在1h到达的时刻，用动脉夹同时夹闭肾动静脉，再用另一只动脉夹夹闭输尿管。然后在肾动脉上带上两根3-0慕思线备用。左手牵近心端的线，右手使用静脉留置针穿刺肾动脉。准备碎冰、4℃枸橼酸肾脏保存液及肾袋。穿刺完成后，打开输液器，待肾脏颜色变白后，用留置针的针头轻轻点刺肾静脉，此时有水柱涌出。观灌注速度，防止留置针滑脱或阻塞。开始倒计时4h。然后结扎远心端，注意不要过紧或过松，防止滑脱。再结扎近心端。将肾套在肾袋内，向肾袋内注入4℃枸橼酸肾脏保存液同时收住肾袋口，不宜过紧，防止留置针阻塞。注意观察流注速度。将保存有肾脏的肾袋脱出家兔左侧体外，在体保存在装有冰水混合物的圆盘中。缝合“T”型伤口，在体保存肾脏4h。

（11）模拟肾脏体外保存（MP组） 完成步骤（10）后，开始准备引流管和lifeport灌注仪。适当移动兔子的位置，使左肾能从横向切口中牵出体外，切记不要拉断肾动静脉和输尿管。确定流注速度未变化后，放置引流管，缝合横向切口皮肤，关闭左腹，且不可影响流注速度。将肾脏放在盛有碎冰的无菌盘子内，并用碎冰掩埋肾脏。时刻保持肾脏低温。此时可以装上lifeport灌注仪。进行低温机械灌注保存。完成后，缝合腹部正中切口皮肤，恢复腹温。时刻观察lifeport灌注仪的灌注流量及机器运转状况（压力为60mmHg，流量控制在15-20ml/min）。此时可以将羟乙基淀粉溶液换成5%葡萄糖溶液，速度为5秒/滴。在这4h内监测家兔生命体征，时刻保持盘子内有充足的碎冰。确定引流管通畅。保存到第2h时，进行第二次血气分析。

   （12）血管缝合  在到达4h之前，提前20min检测第三次血气分析，同时准备50ml 4℃乳酸林格氏溶液，5ml碳酸氢钠，2ml肝素，2ml呋噻米，50ml肝素氯化钠和50ml 4℃生理盐水。提前5min打开正中切口及左腹横向切口（MP组需要撤去lifeport灌注仪，停止灌注。）同时换上羟乙基淀粉，静注1秒/滴。向肾脏中注入4℃乳酸林格氏溶液50ml以冲走残留于肾脏中的枸橼酸肾脏保存液。使用10-0带针缝合线先进行静脉缝合，再将动脉留置针取出后用10-0带针缝合线进行动脉缝合。在缝合血管时，要时刻注意肠道的保湿保温。并留意兔子的生命体征。血管缝合完毕后，肾动静脉远心端夹闭试漏，即打开两只动脉夹，确定动静脉有无出血，有无狭窄。恢复肾脏血供。此时耳缘静脉推注0.2ml肝素、0.5ml呋塞米和慢推5ml 5%碳酸氢钠，为了降低供肾栓塞的发生率。观察兔子的生命体征和肾脏状况。进行第四次血气分析。逐层细致关闭左腹横向切口。此时，准备造瘘管。

   （13）膀胱造瘘  确定造瘘位置，使用荷包缝合法，不要拉伤膀胱。此时耳缘静脉推注0.5ml呋塞米。

   （14）右肾切除  分离右肾蒂并双重结扎，分离输尿管并双重结扎，游离肾周围组织，结扎止血。剪断肾蒂和输尿管。右肾切除，止血。此时耳缘静脉推注0.5ml呋塞米。

   （15）关闭腹腔  清点器械，腹腔冲洗后逐层细致关闭腹腔。此时应将羟乙基淀粉换成乳酸林格氏溶液，静注5秒/滴。松开家兔固定装置，用吹风机将兔子吹干，尽快恢复体温。收拾实验器械及仪器设备，打扫灌注实验室，紫外消毒备用。

2.3术后维持

术后24h内监测兔子的生命体征，尿量及血气分析。及时纠正酸碱平衡紊乱，补足血容量，有助于恢复左肾脏功能。

2.4收取标本

术后24h后，测量尿量。收集家兔的血液于有抗凝剂添加管中，2000 rpm离心5 min收集血浆，于全自动生化分析仪上检测尿素氮(BUN)、尿肌酐(Cr)的含量；收集组织标本行HE染色检测。

2.5统计学分析

应用SPSS13.0统计软件分析，数据经正态检验，均符合正态分布。计量资料以均数±标准差(X±S)表示，组间分析采用单因素方差分析，组内分析采用重复测量设计的方差分析，检验水准α= 0.05，p<0.05为差异有统计学意义。

结果

1、24小时存活率

实验结束后一小时，家兔苏醒，观察家兔24小时后家兔存活率。MP25min和CS25min两组分别比较24小时生存率均为100%,差异无统计学差异（p＞0.05）。而MP35min和CS35min组的24小时生存率，前者为100％，后者为80％，差异有统计学意义（p＜0.05）。

2、再灌注24h后各组早期肾功能比较

留取各组家兔相应时间点的尿液并测量体积，结果显示，正常家兔24小时尿量为50±5 ml，CS25min组尿量为50±10 ml，MP25min组尿量为150±10 ml，两者差异有统计学意义（p＜0.05）；CS35min组尿量为35±8 ml，MP35min组尿量为110±20 ml，两者差异有统计学意义（p＜0.05）；

各组家兔术后抽血，生化分析仪进行血肌酐检测。结果显示，CS25min组肌酐为480±23 μmol/L，MP25min组肌酐为300±14 μmol/L，两者差异有统计学意义(p＜0.05)；CS35min组肌酐为511±44 μmol/L，MP35min组肌酐为355±71 μmol/L，两者差异有统计学意义(p＜0.05)。

3、肾小管上皮细胞的厚度

通过HE染色检测，MP25min组近曲小管（9.655±1.877 μm）和远曲小管(6.154±1.23 μm)的厚度比CS25min组近曲小管（12.566±1.877 μm）和远曲小管(8.755±1.43 μm)的厚度低，差异有统计学意义。MP35min组近曲小管（12.338±1.833 μm）和远曲小管(10.870±1.686 μm)的厚度比CS35min组近曲小管（18.377±2.108 μm）和远曲小管(14.075±2.662)的厚度低，差异有统计学意义(p＜0.05)。同时，随着热缺血时间的增加，热缺血35分钟肾小管水肿程度比热缺血25分钟大，差异有统计学意义(p＜0.05)。

结论

    通过家兔肾脏在体低温机械灌注（MP）模型和在体冷保存（CS）模型的比较，不同的热缺血时间，对家兔肾脏损伤程度不一。图1和图2显示，当供肾热缺血为25min时，两组24小时生存率都为100%，但机械灌注组血肌酐水平小于冷保存组，且图2显示，各组柱状图误差线控制在均数的10%以内，具有很高的稳定性；随着热缺血时间的延长，家兔肾脏损伤程度加重，传统冷保存组24小时生存率降低，机械灌注组24小时生存率为100%。结合图2肌酐水平和图3的组织学水平检测，可以证实，机械灌注的保存效果优于传统冷保存，且各组组内差异较小，显示出该模型很高的稳定性。家兔肾脏在体低温机械灌注模型可以用于研究MP的机制。

Claims (2)

1.一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）术前准备

每次挑选两只3.2-3.8kg的雄性家兔在术前36-48h撤去饲槽，术前禁食36-48h，但需要给予充足水分；

（2）麻醉、固定、备皮，常规开腹

（3）夹闭肾蒂 腹腔探查

    用棉垫和纱布保护切口边缘，将腹腔内脏器稍向右扒开，用纱布遮盖，用45.0℃生理盐水时刻保湿保温；暴露左肾并游离左输尿管；钝性分离肾动静脉，注意分离静脉时，动作轻柔，防止拉伤撕破；分离动脉时，要确定有无动脉畸形或多支动脉，动脉鞘要分离干净，分离长度为1.5-2cm；分离完成后，用动脉夹先夹闭输尿管再同时夹闭肾动静脉，在夹闭的一瞬间，同时开始计时,夹闭时间为25min或35min；用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温（38±0.5℃）；从左耳缘静脉抽取血液，进行血气分析；

（4）再灌注

    在到达夹闭时间之前1min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，在到达夹闭时间那一刻松开两个动脉夹；观察肾脏颜色质地，理应见到肾脏变红变软，无瘀斑，动脉恢复搏动，注意保护肠道，并开始计时，用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温，再灌注时间为1小时；

（5）模拟肾脏体外低温机械灌注保存

    在到达1小时之前，提前30min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，注意保护肠道，此时将5%葡萄糖溶液换成羟乙基淀粉溶液，静注，做腹部横向切口，切缘与左肾蒂平行，长度为7-9cm，使横向切口与原切口呈横“T”形，并止血，止血完成后，右耳缘静脉推注0.3ml（1875 IU）肝素，推注完成后开始准备肾动脉穿刺装置（静脉留置针、输液器及4℃肝素化的枸橼酸肾脏保护液）；游离左肾，将左肾与周围组织分离，切勿将输尿管及肾蒂切断，并结扎止血，防止周围组织渗血；在1h到达的时刻，用动脉夹同时夹闭肾动静脉，再用另一只动脉夹夹闭输尿管，然后在肾动脉上带上两根3-0慕思线备用，左手牵近心端的线，右手使用静脉留置针穿刺肾动脉；准备碎冰、4℃枸橼酸肾脏保存液及肾袋；穿刺完成后，打开输液器，待肾脏颜色变白后，用留置针的针头轻轻点刺肾静脉，此时有水柱涌出，观灌注速度，防止留置针滑脱或阻塞，然后结扎远心端，注意不要过紧或过松，防止滑脱，再结扎近心端；将肾套在肾袋内，向肾袋内注入4℃枸橼酸肾脏保存液同时收住肾袋口，不宜过紧，防止留置针阻塞；注意观察流注速度，确定流注速度未变化后，适当移动兔子的位置，使左肾能从横向切口中牵出体外，切记不要拉断肾动静脉和输尿管；将保存有肾脏的肾袋脱出家兔左侧体外，在体保存在装有冰水混合物的圆盘中，此时可以装上lifeport灌注仪，进行低温机械灌注保存，完成后，缝合“T”型伤口和腹部正中切口皮肤，恢复腹温，时刻观察lifeport灌注仪的灌注流量及机器运转状况（压力为60mmHg，流量控制在15-20ml/min），此时可以将羟乙基淀粉溶液换成5%葡萄糖溶液，在体进行肾脏机械灌注4h, 在这4h内监测家兔生命体征，时刻保持盘子内有充足的碎冰，确定引流管通畅，保存到第2h时，进行第二次血气分析；

（6）血管缝合

    在到达4h之前，提前20min检测第三次血气分析，同时准备50ml 4℃乳酸林格氏溶液，5ml碳酸氢钠，2ml肝素，2ml呋噻米，50ml肝素氯化钠和50ml 4℃生理盐水；提前5min打开正中切口及左腹横向切口，撤去lifeport灌注仪，停止灌注，同时换上羟乙基淀粉，静注1秒/滴；向肾脏中注入4℃乳酸林格氏溶液50ml以冲走残留于肾脏中的枸橼酸肾脏保存液；使用10-0带针缝合线先进行静脉缝合，再将动脉留置针取出后用10-0带针缝合线进行动脉缝合，在缝合血管时，要时刻注意肠道的保湿保温，并留意兔子的生命体征，血管缝合完毕后，肾动静脉远心端夹闭试漏，即打开两只动脉夹，确定动静脉有无出血，有无狭窄，恢复肾脏血供，此时耳缘静脉推注0.2ml肝素、0.5ml呋塞米和慢推5ml 5%碳酸氢钠，观察兔子的生命体征和肾脏状况，进行第四次血气分析；逐层细致关闭左腹横向切口，此时，准备造瘘管；

（7）膀胱造瘘

    确定造瘘位置，使用荷包缝合法，不要拉伤膀胱，此时耳缘静脉推注呋塞米；

（8）右肾切除

    分离右肾蒂并双重结扎，分离输尿管并双重结扎，游离肾周围组织，结扎止血，剪断肾蒂和输尿管，右肾切除，止血，此时耳缘静脉推注呋塞米；

（9）关闭腹腔

    清点器械，腹腔冲洗后逐层细致关闭腹腔，此时应将羟乙基淀粉换成乳酸林格氏溶液，静注；松开家兔固定装置，用吹风机将兔子吹干，尽快恢复体温；

（10）术后维持

术后24h内监测兔子的生命体征，尿量及血气分析，及时纠正酸碱平衡紊乱，补足血容量，有助于恢复左肾脏功能。

2.一种由权利要求1所述方法构建的家兔肾脏在体低温机械灌注模型。