CN1047390A - 用检查母体血液的非侵入性方法发现唐氏综合症的方法和设备 - Google Patents

Abstract

一种用于确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合症胎儿明显危险的方法和设备。该方法包括测量孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位的含量。将人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量单独地或与其它指标一起地与一组基准数据进行比较。一个计算机化的设备、最好用由一组标准数据通过线性判别分析处理得到的一个概率密度函数、来进行判断。

Description

本发明涉及一种在产前检查中发现胎儿唐氏综合症（21三染色体）的方法。该方法还涉及到其它罕见的、但可检测到的染色体的三染色体如13三染色体和18三染色体。更具体地说，本发明涉及一种通过测量孕妇血液中人绒毛膜促性腺激素（HCG）的游离β-亚单位的含量来提高检查唐氏综合症中的发现率的方法。

唐氏综合症，亦称21三染色体，是严重精神发育迟缓的最普遍的先天性原因。唐氏综合症通常采用一种包括羊膜穿刺术和染色质组型的诊断方法来确定。但这种诊断方法是侵入性的，会对孕妇和胎儿带来危险。羊膜穿刺术和染色质组型不作为对所有孕妇进行常规检查的方法，当使用这种侵入性诊断方法证明会给孕妇带来危险时，可以采用一种或多种检查方法代替这种侵入性方法进行诊断。

唐氏综合症的发生率随母亲年龄的增加而急速增加。以往对于唐氏综合症的产前研究一直集中于年龄在35岁以上的孕妇，在这个年龄段，唐氏综合症的危险接近或超过用于发现唐氏综合症的诊断方法所带来的危险。因此，产前检查的标准方法一直包括以孕妇年龄为基准挑选出作羊膜穿刺诊断的孕妇。但年龄並不是充分的检查依据。因为对5%的最可能处于危险中的孕妇、即年龄为35岁或更大的孕妇进行羊膜穿刺和染色质组型只能发现所有唐氏综合症妊娠的20%左右。並且由于在实际临床实践中，只有大约一半的年龄在35岁或以上的孕妇作羊膜穿刺和染色质组型，所以在产前发现的唐氏综合症妊娠低于10%。

1984年，有人发现了母体血液中低的α-胎儿蛋白（AFP）含量与胎儿唐氏综合症之间的联系。例如参见“An    association    between    low    maternal    serum    alpha-fetoprotein    and    fetal    Chromosomal    abnormalities”;（母体血清α-胎儿蛋白的低含量与胎儿染色体异常之间的伴随关系）;Merkatz，Macri等人著;Am.J.Obstet.Gynecol.148：886，1984;该公开内容通过引用被结合到本申请中。该文中记载了其它一些三染色体、特别是13三染色体和18三染色体，也与母体血液中AFP含量低有关。这些其它的染色体中的三染色体的发生率（分别为五千分之一和六千六百分之一）远低于21三染色体（唐氏综合症）一般的先验患病率。但由于这些其它的染色体中的三染色体与MSAFP含量低有关，因此，这些染色体的异常也可利用本文所描述的母体血液AFP和HCG的游离β-亚单位和可能的其它指标的检查方案被发现。本领域的专业人员显然也可以用这里描述的用于21三染色体的方案用于发现13三染色体和18三染色体。母体血液中AFP含量低与胎儿唐氏综合症有关联这一发现使我们有可能在那些唐氏综合症发病率约为80%的年轻的、看来似乎不患病的家庭中采用非侵入性的血液检查试验来发现唐氏综合症病例。据估计，采用以母体血液AFP（作为一个检查指标）低为基础的检查试验会使胎儿唐氏综合症的产前发现率达到总病例的20%左右。

另一种检查方法包括测量母体血液中非结合的雌三醇（UE）的含量。例如参见“Maternal    blood    screening    for    Down    syndrome    in    early    pregnancy”（母亲血液检查在早期妊娠时发现唐氏综合症）;Wald等人著;British    Journal    of    Obstetrics    and    Gynocology（BMJ）Volume    95，April    1988，其公开内容通过引用被结合到本申请中。但对UE的测量值仅为检查提供一个粗劣的基准。

最近，发现母体血液中HCG含量的提高、HCG的α-亚单位含量的提高（HCG由两个亚单位组成，以下分别称α-HCG和β-HCG）与胎儿唐氏综合症之间的关联性。例如参见“Abnormal    Maternal    Serum    Chorionic    Gonadotropin    Levels    in    Pregnancies    With    Fetal    Chromosome    Abnormalities”（胎儿染色体异常妊娠中母体血清的绒毛膜促性腺激素含量异常）;Bogart    Pandian和Jones;Prenatal    Diagnosis，Vol，7，623-630（1987），其公开的内容通过引用被结合到本申请中。在Bogart的文章中，估计了利用母体血液中HCG和HCG的α-亚单位含量的提高来发现大约68%的染色体异常的胎儿。而这些结论是通过对怀孕18-25周的妊娠进行研究而得到的，而且这些患病病例似乎是那些事先已被识别为可能患唐氏综合症的妇女。

如上所述，一般来说，通过测定母体血液中的HCG值的检查方法通常仅涉及对HCG的测量，附加地还涉及对α-HCG的测量。虽然这些检查方法确能发现唐氏综合症，但是还需要和希望一种发现更高百分比的胎儿唐氏综合症病例的方法。

本发明人发现了先前不知道的母体血液中游离β-HCG含量的提高与胎儿唐氏综合症之间的关联性。还发现了先前不知道的母体血液中游离β-HCG含量及AFP含量与胎儿唐氏综合症之间的关联性，本发明人还发现了先前不知道的母体血液中游离β-HCG含量对母体血液中未受损的HCG分子含量之比与胎儿唐氏综合症之间的关联性。我还进一步发现了采用一种多变量判别式分析法可以提高下面所说检查方法在一选定的患病率截止值下的发现率，这种方法利用母体血液中游离β-HCG含量，或利用母体血液中游离的β-HCG含量和AFG含量，或二者中任何一个的对数，或两者的对数。特别是在孕龄也被当作一个变量加入到判别式分析法中，发现率的提高更明显。孕龄指孕妇怀胎儿的周数，发现率是指在一个选定的患病率截止值下正确地发现为唐氏综合症病例的百分比。患病率截止值将在后面更详细地加以说明。判别式分析法总的来说是公知的一种多变量分析方法，涉及到用单一变量的患病率（或危险率）估计法将研究对象分为二个或更多个小组，判别式分析法有时也被描述成是一种构成独立变量线性组合的方法，即将衡量各小组差异的问题简化成一个单变量问题。当某个问题中仅包含一个变量时也能运用判别式分析法。关于判别式分析法的一般性讨论可见“Marketing    Research”（销售研究）;Churchill，G.A.;Dryden，1976，第15章P.530～543，该公开内容通过引用被结合到本申请中。我发现将母体血液中游离β-HCG的含量、未受损的HCG含量、游离β-HCG对未受损HCG分子的比值、AFP含量、UE含量以及孕龄经过多变量判别式分析法处理后与其它任何已知的产前发现唐氏综合症的检查方法相比，发现胎儿唐氏综合症的百分比更高，假阳性率，更低。我还发现，通过仅仅测量母体血液中游离β-HCG的含量和AFP含量，並将二者各自的对数与孕龄经过多变量判别式分析法进行处理，仍可发现更多数目的胎儿唐氏综合症病例。这些及其它的发现在下面对本发明的概述部分和详细描述部分中将更充分地加以说明。

本发明的一个目的是提供一种与其它已知的产前检查方法相比，在给定假阳性率的情况下能发现更高百分比的胎儿唐氏综合症的检查方法和步骤。

本发明另一个目的是提供一种在给定的发现率条件下比其它已知方法具有更低假阳性率的检查胎儿唐氏综合症的方法和步骤。

本发明的一个更进一步的目的是将多变量判别式分析法运用于检查唐氏综合症的方法中，以使胎儿唐氏综合症的发现率更高，假阳性率更低。

本发明另一个目的是提供一种通过测量母体血液中游离β-HCG的含量来检查胎儿唐氏综合症的方法和步骤。

本发明还有一个更进一步的目的就是提供一种通过测量母体血液中AFD含量及游离β-HCG的含量来检查胎儿唐氏综合症的方法和步骤。

本发明的其它目的和优点将在下面对本发明的描述中变得显而易见。

为了达到上述目的，按照本发明，孕妇（以下称病人）的母体血清中游离β-HCG的含量采用常规的免疫学方法测量，该方法包括免疫测定法，如上述文章中提到的那些方法以及该领域内已知的其它方法。然后，将游离β-HCG的含量与一组基准数据进行比较以确定该病人怀有患唐氏综合症胎儿的患病率。为了提高发现率，将游离β-HCG的含量及孕龄与一组基准数据比较。为进一步提高发现率，采用常规的免疫学方法，包括上述论文中提到的在本技术领域中公知的测定方法，测量病人母体血液中游离的β-HCG和AFG（以下称“指标”）含量。然后将每项指标值与一组基准数据比较，以确定该病人怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。采用多变量判别式分析法将这些指标值与一组基准数据作比较。更详细地说，就是采用贝叶斯定律，该病人先验的危险率以及通过将该病人每项指标的定量数值的对数代入到利用多变量判别式分析法展开的标准数据的概率密度函数中而确定出来未患病和患病妊娠的相对发生率来计算出每个病人具体的危险率。若该病人怀有唐氏综合症胎儿的危险率大于给定的危险率截止值，则应劝说该病人作进一步的诊断试验，以便确证是否患有唐氏综合症。除了母体血液中游离β-HCG和AFP含量外，加入孕龄作为一个指标将会进一步提高发现率。由于大量样本的母体血液中游离β-HCG含量和AFP含量趋于按对数一高斯分布曲线分布，因此，通过将病人各项指标定量值的对数和孕龄代入用多变量判别式分析法展开的基准数据的概率密度函数中能达到最高发现率。

本发明的方法和步骤的优点之一就是与其它已知的方法和步骤相比，可以准确预测胎儿唐氏综合症病例的百分率更高，假阳性率更低。

本发明的其它一些优点在下面更详细的描述和实例中将成为很清楚。

图1是例2中提到的一个表格，表示了（21三染色体）各个指标的有效值。

图2是例2中提到的一个表格，表示了各个指标的唐氏综合症的检查效率。

图3是例2中提到的一个表格，表示了组合指标的唐氏综合症的检查效率。

图4是例2中提到的一个表格，表示了在未患病妊娠中高于给定的游离HCG的β-亚单位分布的百分率的唐氏综合症病例部分。

图5是例2中提到的一个表格，表示各个指标的唐氏综合症率。

图6是例2中提到的一个表格，表示在不同的孕龄范围内，以AFP的对数和游离的β-HCG亚单位的对数作为一个组合指标时的唐氏综合症的检查效率。

图7是例2中提到的一个表格，表示预计的在美国各地由游离的β-HCG和母亲年龄得出的唐氏综合症检出率。

图8，在例2中被提到，表示了在21三染色体病例中，游离β-HCG亚单位相对于未患病妊娠的各种百分比含量。

图9，在例2中被提到，表示了游离β-HCG亚单位含量的分布。

图10是例3中提到的一个表格，表示由一些指标的各种组合得到的唐氏综合症的检出率。

图11表示本发明的用于执行检查唐氏综合症方法所使用的设备。

图12和13表示计算用于确定一个病人怀有患病胎儿的危险率有关的基准参数的计算机程序流程图。

图14表示利用图12和13所示程序中计算出的基准参数确定该病人怀有患病胎儿的危险率的计算机程序流程图。

在本发明的一个实施方案中，从病人获得母体血样，然后采用常规的分析方法，如本领域内公知的免疫学方法，测出母体血液中游离β-HCG的含量。然后，将该值与一组基准数据比较以确定该病人是否处于怀有患唐氏综合症胎儿的危险中。为了提高发现率，将孕龄及母体血液中游离β-HCG的含量值与一组基准数据进行比较以确定该病人是否怀有患唐氏综合症胎儿。

尽管如同本领域专业人员显见的那样，在本发明中运用任何已知的分析方法测量母体中游离β-HCG的含量都行，但是，用于游离β-HCG的分析方法必须与产生游离β-HCG基准数据的方法是一样的。如果用了一种新的分析方法测量游离β-HCG，则必须产生一组以该方法形成的数据为基础的新的基准数据。

不难理解，在形成对HCG的β-链特异的单克隆体的过程中，一些抗体对该蛋白质将会是特异的，而另一些对与抗体部位关联的醣将是特异的。在本发明的说明部分中提到的β-HCG含量的测量值包含了对游离HCG使用不论是对说蛋白质特异的、还是对游离β-HCG上抗原部位或其它任何部位有关联的醣特异的抗体。

对于本领域中的专业人员来说，不难理解，虽然游离的α-HCG亚单位被单独一个基因编码，但是游离的β-HCG则被至少七个非常相似的基团或伪基因的复合族编码。例如参见“Human    Chorionic    gonadotropin    beta-subunit    is    encoded    at    least    eight    genes    arranged    in    tandem    and    inverted    pairs”Boorstein，Vamvakopoules，&    Fiddes;Nature    Vol300，1982年12月2日;其中的教导通过引用被结合到本申请中。已知七个游离β-HCG基因中仅有三个在游离β-HCG的正常胎盘形成过程中被表达。例如参见“Fragmentation    of    the    Beta-Subunit    of    human    Chorionic    Gonadotropin    produced    by    Chroriocarcinoma”;Nishimura，Ide，Utsunomiya，Kitajima，Yuki，and    Mochizuki;Endocrinology，Vol.123，No.1，1988;其中的教导通过引用被结合到本申请中。这三个同样的基因是否在疾病状态下。如患有胎儿唐氏综合症时被表达一直没有肯定的答案。因此，有可能合成出在氨基酸排列顺序上或其它方面有微小差别的多种形式的游离β-HCG。还有可能在唐氏综合症病例中，一个或多个游离β-HCG的基因被表达，因此，产生游离β-HCG的一个独特的变种或多个变异种。根据本发明;如果这些变异种存在的话，那么它们可通过常规的测量游离β-HCG的免疫学方法被测量出来。如果能有一种测量与唐氏综合症有关的特定的游离β-HCG变异种的测定法，可以更进一步提高发现率。

事实上，我们已有效地运用了单克隆抗体测定法测量HCG游离的β-亚单位以区分患21三染色体妊娠和未患病的妊娠。21三染色体的发现率高达83%。如本领域专业人员都知道的那样，利用抗体来定量说明特定的分析对象会得到与一个有区别但又相似物质的交叉活性的程度。所以患病和未患病病例之间的差别可能是由于存在不同形式的HCG的游离β亚单位所致，这些亚单位由于与所利用的抗体有某种程度的交叉活性而被检测出来。如果游离β-HCG亚单位的这种异常形式被鉴别出来，则它将被定为一种新的生物化学物质。实际上，科学文献中的资料表明，已经识别出β-HCG的这种异常形式（例如参见Nishimura等著的文章）

患21三染色体的病例也会以游离β-HCG亚单位的异常形式为特征。如果21三染色体是以游离β-HCG的异常形式为特征的话，则本领域专业人员将能够发展出对这些异常形式特异的抗体，这样可以使唐氏综合症的发现率进一步提高。

基准数据反映了怀有患唐氏综合症胎儿孕妇血液中游离β-HCG的含量（也称“患病的”）和/或反映怀有正常胎儿孕妇体内血液中游离β-HCG的含量（也称“未患病的”）。对于本领域专业人员来说，不难理解，用于检查胎儿唐氏综合症的方法就是通过比较作出决策的过程。对于任何决策过程，需要有以患有此病或我们所关心的条件的病人和/或不患此病或我们所关心条件的病人为基准的基准参数。本发明中，基准值是母体血液中被测指标的含量，如怀有患唐氏综合症胎儿的孕妇和怀有正常胎儿孕妇的游离β-HCG。通过集中大量样本的基准值而建立一组基准数据。对本领域专业人员来说，显然这组基准数据还可通过增加基准值样本的数量进一步改善。

为了确定病人是否处在怀有患唐氏综合症胎儿的危险中，必须建立一个截止值。对本领域专业人员来说，显然，建立一个确定病人是否怀有患13三染色体或18三染色体胎儿的截止值在辨识21三染色体病例中也会是有效的。这一截止值可由实验室、医生或基于每个病人的病例而建立。截止值也可以以几个判别标准为基础，包括需要继续作进一步侵入性诊断试验的妇女的数目，所有作进一步的侵入性诊断试验的妇女患有唐氏综合症胎儿的平均危险率、和任何一个妇女其特定的患病危险率大于一个具体的危险率值如1/400就应当继续作进一步的侵入性诊断试验或本领域专业人员已知的其它判别标准的决策。截止值能够通过一些方法建立起来，包括：百分数，平均正负标准偏差，中间值的倍数;病人具体的患病危险率或那些该领域专业人员已知的其它方法。

在本发明的另一个可以发现更多数目胎儿唐氏综合症的实施方案中，从病人体内取出母体血液样本，然后，通过常规的分析法，如本领域公知的免疫测定法测出母体血液中未受损的HCG分子、游离的β-HCG、UE和APF（以下称“指标”）的含量。尽管如本领域专业人员显见的那样，在本发明中运用任何已知的分析方法来测量母体血液中上述指标的含量都行，但用于每项指标的分析方法与形成该特定指标的基准数据的方法必须是相同的。如果对某一指标采用一种新的分析方法，则必须产生一组以该方法产生的数据为基础的基准数据。

然后、采用贝叶斯定律、该病人的先验危险率及通过将病人每项指标（未受损的HCG分子、游离β-HCG，UE和APF）的定量值和游离β-HCG对未受损HCG分子含量的比值以及病人的孕龄代入用多变量判别式展开的基准参数的概率密度函数中确定出的未患病和患病妊娠的相对发生率来计算出病人怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。

多变量判别式分析法可以在市场上有的计算机程序统计软件包“统计分析系统”（由SAS研究所公司生产和销售）上计算，或采用其它多变量统计分析法或本领域专业人员公知的其它统计软件包计算。

概率密度函数为把病人每项指标值与基准参数比较提供了一个方法。虽然，如本领域专业人员显然了解的那样，也可以类似地使用其它概率密度函数，下面具体指出了一种型式的概率密度函数，並能充分地运用于本发明中。

用于唐氏综合症危险率的公式是：

下标“a”表示患病的病例

下标“u”表示未患病的病例

（X-M）表示一个向量，其中每个元素是每个变量减去变量平均值的值。

COV^-1是该模型中所有变量的患病和未患病病例的联合协方差矩阵的逆。

（X-M）^T是向量（X-M）的转置。

EXP    表示指数函数。

｜COV｜表示该模型中作为基准数据的所有变量的协方差矩阵的行列式。

本领域专业人员显然知道，患病妊娠和未患病妊娠各自的协方差矩阵可以代替联合协方差矩阵。用于患唐氏综合症危险率的公式就成为：

｜COV｜表示该模型中作为基准参数的所有变量的协方差矩阵的行列式。

为进行判别式分析起见，先在一般未挑选的研究对象中作出一个可能患唐氏综合症的先验概率的假设。该先验概率一般约为1/800。为了实行多变量判别式分析法，还要作一个关于什么样的危险率截止值能够构成一个阳性试验结果的决策。例如，如果希望一个怀有患有唐氏综合症胎儿的概率等于或大于1/400的孕妇进行进一步的诊断试验，则当多变量分析的结果表以孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的概率等于或大于1/400时，该孕妇被认为具有一个阳性试验结果。如果得出阳性试验结果，应劝说病人作进一步的诊断试验以确证是否患有唐氏综合症。

参照图11至14，图中显示了用于计算基准数据和具体的危险率的设备及计算机程序的流程图。

如图11所示，为建立基准数据，在患病和未患病妊娠的病例中，采用常规方法确定出孕龄GA，AFP含量和游离β-HCG的含量。为提高可靠性选择了大量样本。用于建立基准数据的测量值被示意地用10表示。

一旦经由适当的输入装置15进入后由处理单元20计算出基准参数22，作为某个病人具体的危险率25可以根据该病人被测出的具体的指标数值（用30表示）计算出来。

图12和13表示确定基准数据的程序框图，图14表示计算具体的危险率的程序框图。

现参照图12和13，在第一个循环100中，程序从一个参照组读入识别参数ID，孕龄GA，AFP和游离β-HCG的定量值及一个妊娠是否患21三染色体的代码。见步骤102。在流程图中，如步骤104所示，孕龄GA用变量X₁表示，AFP的对数用X₂表示，游离β-HCG的对数用X₃表示，然后，在X₁，X₂和X₃数据的基础上确定或计算出和矩阵及和一积矩阵，见步骤106。用来对参照组中患病和未患病病例计数的变量Ncode然后增加1。一旦循环结束，如由流程线110所示，通过如参考标号112所示的由量I、J、K所定义的一系列循环计算出平均值。在这些循环中，运用循环100定义的和矩阵和在循环100中计算出的和一积矩阵计算出协方差矩阵。这些循环结束后，要对是否将患病和未患病病例的协方差矩阵组合起来作出选择。这种选择在步骤114，116和118中被输入。如果选择组合，则协方差矩阵就被组合成一个由步骤120给出的联合协方差矩阵。如步骤122所示，该联合协方差矩阵被取逆，得到逆联合协方差矩阵IPCM。该逆联合协方差矩阵被存入文件中，並在步骤124和126中被打印出来。如果选择不组合，则在步骤123和125中对二个协方差矩阵的每一个取逆，且将平均值和逆协方差矩阵存入文件並在步骤125和127中打印出来。这些数值包括用于计算特定个人怀有患病胎儿危险率的基准参数。

参见图14，通过执行图12和13所示程序计算出来的基准参数在步骤130中被读入，基准参数包括平均值和逆联合协方差矩阵。在步骤132读入具体的病例记录，包括病人识别标记，孕龄GA，AFP和游离β-HCG。在步骤134中更准确地计算孕龄，在步骤136中计算孕妇的年龄。在138中，在孕妇年龄和发生率参数的基础上确定先验危险率。在下面讨论的实例中，这一计算结果为1/800，是一个典型的数值。

在140中，确定该先验危险率与怀有患病胎儿（ABT）的相对频率的乘积，即上述等式（1）、（2）的分子。在142中，计算出怀有患病胎儿的相对频率与（1-先验危险率）的乘积（NT），即上述等式（1），（2）分母中的第二个因子。在144中，利用贝叶斯定律确定具体的危险率，即ABN＝ABT/（ABT+NT）（等式（1），（2））。在146中，打印出结果，即打印出病人特定的危险率ABN和病人识别号。

对于本领域专业人员，易然还可以采用不同于线性判别式分析法的其它统计学或数学方法来计算基准参数。

根据本发明一个优选的实施方案，从病人获得母体血液样本，然后采用常规的分析方法、包括本领域公知的免疫学方法来测量母体血液中游离β-HCG及AFP（下面称“指标”）的含量。尽管如本领域专业人员公知的那样，在本发明中用任何公知的分析方法测量母体血液中上述指标的含量都行，但用于每项指标的分析方法必须与形成各指标基准参数的方法是一样的。如果对某一指标采用一种新的分析方法，则必须在用该方法形成的数据基础上产生出一组新的基准参数。

然后，运用贝叶斯定律，病人先验的危险率、及通过将病人每项指标的定量值和孕龄一起代入用多变量判别式展开的基准数据的概率密度函数中而得到的患病和未患病妊娠的相对发生率来计算怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。为进一步提高发现率，将病人游离β-HCG和AFP定量值的对数值和孕龄一起代入用多变量判别式展开的基准参数的概率密度函数中。多变量判别式分析法可以在市场上有的计算机程序统计软件包“统计分析系统”（由SAS研究所公司生产和销售）上运算，或采用本领域专业人员公知的其它多变量统计分析方法或其它统计软件包。

为进行判别式分析起见，先在通常未经选择的研究对象中对患有唐氏综合症的先验概率作出一个假设，一般来说，该先验概率近似为1/800。为了进行多变量判别式分析法，还要作出什么样的危险率截止值构成阳性试验结果的决策。例如，希望一个怀有患唐氏综合症胎儿概率等于或大于1/400的孕妇作进一步诊断试验，则当多变量分析的结果表明一个孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的概率等于或大于1/400时，该孕妇被认为具有一个阳性试验结果。若显示出阳性试验结果，应劝说该病人作进一步的诊断试验以确证是否患有唐氏综合症。

对于本领域专业人员来说，显然，在上面讨论的所有实施方案中，改变阳性的危险率截止值或在研究对象中对不同的小组采用不同的先验危险率，将会改变对每个病人作判别式分析的结果。

本发明不仅局限于上述实施方案，还包括所有可能的实施方案以及在下面例子中所公开的各个指标的组合。

例1

采用400以上病例样本研究胎儿唐氏综合症与母体血液中游离β-HCG含量以及母体血清中AFP含量（MSAFP）、UE和未受损HCG之间的关系。这些样本包括25例从已知怀有患唐氏综合症胎儿的孕妇体内得到的样本及与患病病例对照的对照样本。

对每个血液样本，AFP、未受损HCG分子、游离β-HCG及UE（以下称“指标”）的含量值由下列测定方法测定：

指标    测定方法

MSAFP    酶链接的免疫吸附测定法（ELISA）

UE    放射免疫测定法

未受损HCG    小珠型ELISA

游离β-HCG    ELISA

每项指标的值成为在市场上有的计算机软件统计软件包的统计分析系统（SAS研究所公司）上进行逐级判别处理和线性判别式处理中的一个变量，用于建立一组基准数据。游离β-HCG与未受损HCG分子之比及病人的孕龄也被当作变量加入。逐级判别处理解决所有变量能被加入到线性判别式处理中。然后分别对每个变量及各变量的不同组合进行线性判别式处理。这些判别式分析法的结果归纳在下表中。灵敏度是指测试结果显示阳性的胎儿唐氏综合症病例的百分比，假阳性率指测试结果为阳性的正常胎儿的百分比。

变量    灵敏度    假阳性率

MSAFP    15.4%    4.2%

UE    15.4%    2.8%

未受损HCG    37%    8.6%

MSAFP，UE未受损HCG    50.0%    7.2%

游离β-HCG+未受损HCG    60.0%    8.5%

复合W/O，比值    76%    5.3%

复合W/O    UE    76%    5.3%

复合    80%    4.3%

复合W/O游离β-HCG    60.0%    5.3%

^＊未受损HCG对数+（游离

β-HCG对数+未受损HCG）    68%    7.6%

^＊未受损HCG对数、MSAFP对数+

（游离β-HCG对数+未受损HCG）    88%    7.4%

复合-MSAFP+游离β-HCG+未受损HCG+UE+比值

每项变量中都包括孕龄。

危险率截止值＝1/400，除（^＊）为1/365外。

对本领域专业人员来说，显然，改变确定阳性的危险率截止值，或对研究对象不同小组采用不同的先验危险率将会改变对某病人所做的判别式处理的结果。

例2

用550例以上的病人样本来研究胎儿唐氏综合症与母体血液中游离β-HCG含量之间的关系。首先对29例已知怀有患唐氏综合症胎儿的孕妇获得的血液样本以及用于对照孕龄（周数相同）、母亲年龄（相差3年以内）和冷冻贮存时间（相差在一个月之内）的520例未患病的样本进行分析。所有样本都取自于未患糖尿病的怀单胎的白人孕妇。

为了避免估计检出率中有一定倾向的固定偏差，采用了有效组的概念。有效组就是一组独立于基准数据的数据。有效组中由病人得到的结果不用于建立基准数据，而是用来与基准数据比较以确定检出率。这另一个有效组包括26个附加的被确定为21三染色体的病例（总共55个病例）和随机选取的由159个对照样本组成的组。对照样本相似地也取自未患糖尿病的怀单胎的白人孕妇。

所有的研究包括对母体血液中下列各指标值的七个不同的测定方法的4388个判定：

指标    测定方法

MSAFP    酶链接免疫吸附测定法（ELISA）

未受损HCG    ELISA

未受损HCG+游离β-HCG    ELISA

游离β-HCG    放射免疫测定法（RIA）

游离α-HCG    RIA

UE    二种方法，酶免疫测定法和RIA

每项指标值均成为在市场上可得到的计算机软件统计软件包“统计分析系统”（SAS研究所公司）上进行逐级判别处理和线性判别式处理中的一个变量，以建立一组基准数据。病人的孕龄也被当作变量加入。然后分别对每个单独的变量和各变量不同的组合执行线性判别式处理。以1/365为患唐氏综合症危险率的截止值将病人分为患病或未患病病例。把划为患病的未患病病例考虑是假阳性率。每个病人患唐氏综合症的危险率采用贝叶斯定律、患病和未患病病例的多变量正态概率密度函数以及通常以1/800作为先验危险率来计算。联合协方差矩阵被用于每个概率密度函数。

有关初始研究组的结果显示在图1至3的表1～3中。图5至7的表5-7是根据对有效组中病人的分类得到的结果。图4所示的表4、图8和图9是根据初始研究组和所有患病病例得出的。

由测定方法得到的结果被分析，以确定患病和未患病病例之间各项指标值之间是否存在明显的差异。表1（图1）表示患病病例与未患病病例之间除UE外的所有指标都表现出明显的差别。此外，确定了各项指标的假阳性率和发现率，见表2（图2）。通过测量未受损HCG及游离β-HCG亚单位的HCG测定法得到最高的发现率。

可以通过将各个单独的指标组合成复合指标来进一步提高发现率。其中一种复合包括测量未受损HCG分子和游离β-HCG亚单位的HCG测定法，它在表3（图3）所示的复合中产生最高的发现率。

单独对HCG的β和α亚单位的评估表明α-亚单位在患病和未患病病例之间没有明显差异（P＝0.23）而β-亚单位在患病病例中有明显增加（P＝0.001）。正如本领域专业人员所共知的，概率P通过表明一个被观察到的结果以至少这样的极大值的可能性是偶然发生的来衡量科学研究中证据的强弱。P值越小，说明观察不是偶然出现的证据越强。

图8表示10%、50%和90%游离β-HCG随孕龄的曲线。发现在未患病妊娠中，随着孕龄增加有连续下降的趋势。对胎儿唐氏综合症病例中游离β-HCG含量的分析揭示了86%下降到未患病病人的平均值之上。

患病和未患病病例中游离β-HCG的含量都遵循对数高斯分布（P＝0.78和0.86）。图9画出了这种分布。表5（图5）给出了单独依靠游离β-HCG亚单位和游离α-HCG亚单位的发现率数据。表5中显示了游离β-HCG有高的发现率。

用AFP和游离β-HCG的组合进行分析可得到更高的发现率。通过将游离β-HCG的对数和MSAFP的对数结合到上述软件包“统计分析系统”（SAS研究所公司）的线性判别式处理中，可得到如表6（图6）所示的更优越的发现率。

与其对数相反，用游离β-HCG含量和AFP含量也可得到高的发现率。

对数据的进一步分析表明AFP和游离β-HCG都与年龄无关（P＝0.8394和P＝0.5214，对四个不同年龄组的AFP和游离β-HCG分别作Kruskal-Wallis试验（年龄＝30，31～35，36～40和40））。此外，游离β-亚单位含量和AFP含量的相关系数（r）与零没有显著差别（未患病和患病病例分别为r＝0.04，P＝0.39;r＝-0.06，P＝0.81）。

在我们的数据中，发现的基本结果肯定了这样一个事实，即游离的β-亚单位使唐氏综合症的发现率达到最高有帮助。实际上，采用只测量游离β-HCG的测定法所产生的发现率和假阳性率分别为65.4%和5.2%。这些比率与其它人利用三种测定法的组合的报导相差不大。因此，如前面指出过的那样，减少测定数目是本发明的一个优点。

我们关于游离β-HCG作用的发现根据如下：（a）单独看对唐氏综合症发现率贡献最大的是游离β-HCG测定法;（b）对未损HCG分子的测定得到更低的发现率;（c）测量未受损HCG分子与游离β-HCG组合的测定法得到一个比只测量未受损HCG分子测定法更高的发现率。

已经证实，胎儿唐氏综合症的患病率随母体年龄而增加。因此，如前所述，为了用本发明在临床应用中得到病人具体的患病危险率，将随母体年龄而异的先验危险率代入到多变量判别式分析处理中。由于AFP和游离β-HCG的含量均与母体年龄无关，因此，我们对我们的数据作了分析，以找出有多少未患病和患病的妇女在对每个不同的年龄给定一个先验危险率情况下具有阳性的结果。上述信息根据美国分娩活婴孕妇年龄分布为基础、来估计在美国进行广泛的全国性普查中的假阳性率和灵敏度。如表7（图7）所示，这种估计表明有可能达到80%的发现率和5%的假阳性率。

对例2所描述的样本作进一步分析以发现各指标的其它组合的发现率。更具体地说，以同样的危险率截止值和先验的危险率对各指标的不同组合（指标中值的倍数及各指标的对数，在加入或不加入孕龄下）进行例2的线性判别式处理。利用基准数据和有效数据进行线性判别式处理，结果归纳于图10的表8中。

例3

下例说明游离β-HCG的一步测定法和二步测定法的准备工作以及它们在本发明方法中的应用。

游离β-HCG一步测定法的准备工作

1.在具有96井的微滴定平皿上覆盖一层对人绒毛膜促性腺激素（HCG）分子的游离β亚单位特异的“捕获”抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。用来覆盖平皿的抗体浓度为每个井0.8微克，但如需要，也可以不同。平皿在4℃下培养至少16小时。

2.用含0.05%吐温20的PH7.2的磷酸盐缓冲液冲洗平皿，也可用其它合适的清洗缓冲液。然后用含3%水解动物蛋白和0.05%吐温20的PH7.2的磷酸盐缓冲液将平皿“阻隔”。也可使用本领域专业人员所熟悉的其它溶液，如1%的牛血清蛋白溶液。将300微升的阻隔溶液加到每个井中，让平皿在室温下培养1小时。也可用另外的阻隔方法，如“涂釉法”。

3.然后如前所述地清洗平皿，将100微升含有对游离β-HCG亚单特异的生物素化的抗体测试缓冲液加到每个井中。所用的测试缓冲液是含有3%水解动物蛋白和含有0.05%吐温20的PH7.2的磷酸盐缓冲液，但也可用本领域专业人员公知的任何一些合适的溶液。抗体根据操作者的喜欢可以是单克隆、也可以是多克隆的，可以是与除如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶这样的生物素外的一种物质结合了的抗体。测试缓冲液中抗体的浓度被调整到达到最佳吸收率。

4.取20微升的样品本加入每个井中，样本可以是：测试缓冲液，作为证实测试性能的空白;一种用于标准化未知样品值的游离β-HCG溶液;或由怀孕到中期三个月的孕妇体内取出的血清样本。将平皿涡旋30秒钟，然后放在ρ为200转/分的旋转器上，在室温下培养30分钟。

5.然后如前所述地清洗平皿，将含有结合了辣根过氧化物酶的链球菌抗生物素蛋白的100微升测试缓冲液加入每个井中。如果所用的第二种抗体与除生物素以外的一种物质结合的，则不需这一步骤。测试缓冲液中的链球菌抗生物素蛋白-过氧化物酶的浓度为每微升2.0微克。将平皿在室温下放置在ρ为200转/分的旋转器上5分钟。

6.如前所述地清洗平皿。将一种100微升的邻一次苯二氨基质溶液加入每个井中。这种基质溶液也可用本领域内专业人员公知的一些适当的染剂中的任一种代替，並取决于与第二种抗体结合的物质是什么。然后将平皿放在ρ为200转/分的旋转器上，在室温下置于暗处培养8分钟。

7.然后，将100微升的稀硫酸（1.0N）加入每个井中以中止该基质的反应。

8.在492nm下通过分光光度测定法确定每个井的吸收率。

β-HCG的二步测定法的准备工作

1.在具有96井的微滴定平皿上覆盖一层对人绒毛膜促性腺激素（HCG）分子的游离β-亚单位特异的“捕获”抗体。抗体既可以是单克隆的，也可以是多克隆的，用于覆盖平皿的抗体密度是每井0.8微克，但如需要，也可不同。平皿在4℃下至少培养16小时。

2.用含0.05%吐温20的PH7.2的磷酸盐缓冲液清洗平皿，也可用其它适当的清洗缓冲液。然后，用含3%水解动物蛋白和0.05%吐温20的PH7.2的磷酸盐缓冲液将平皿“阻隔”，也可使用本领域技术人员所熟悉的其它溶液，如1%的牛血清蛋白溶液。将300微升的阻隔溶液加到每个井中，让平皿在室温下培养1小时，也可用其它阻隔方法，如“涂釉法”。

3.然后，如前所述地清洗平皿，将一种100微升的测试缓冲液加入每个井中。所用的测试缓冲液是含3%水解动物蛋白和0.05%吐温20的PH7.2的磷酸盐缓冲液，也可用本领域专业人员所公知的一些合适溶液中的任何一种。

4.然后将20微升样本加入每个井中。样本可以是：作为证实测试性能的空白的测试缓冲液;一种用于标准化未知样本值的游离β-HCG溶液;或从怀孕到中期三个月的妇女体内取出的血清样本。将平皿涡旋30秒钟，然后放在ρ为200转/分的旋转器上在室温下培养30分钟。

5.然后，如前所述地清洗平皿，将100微升含有对游离β-HCG亚单位特异的生物素化的抗体的测试缓冲液加入每个井中。根据操作者的喜欢，抗体可以是单克隆的或多克隆的，也可以是与除如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶这样的生物素外的物质结合了的  调节抗体的浓度，以达到最佳吸收率。将平皿涡旋30秒钟，然后放在ρ为200转/分的旋转器上在室温下培养30分钟。

6.然后如前所述地清洗平皿。将100微升含有结合了辣根过氧化物酶的链球菌抗生物素蛋白的测试缓冲液加入到每个井中。如果所用的第二种抗体与除生物素以外的一种物质结合了的，则不需这一步骤。测试缓冲液中链球菌抗生物素蛋白一过氧化物酶的浓度为每微升2.0微克。将平皿在室温下置于ρ为200转/分的旋转器上5分钟。

7.然后如前所述地清洗平皿。将100微升的一种邻一次苯二氨基质溶液加入每个井中。这种基质溶液也可以用本领域内的技术人员公知的一些适当染剂中的任何一种代替，並取决于与第二种抗体相结合的物质。然后将平皿放在ρ为200转/分的旋转器上。在室温下置于暗处培养8分钟。

8.然后，将100微升的稀硫酸（1.0N）加入每个井中以中止该基质的反应。

9.在492nm下通过分光光度测量法确定每个井的吸收率。

这两种测定法用来执行本发明的方法。用了178例病人样本来研究胎儿唐氏综合症与母体血液中游离β-HCG含量之间的关系。对从已知怀有患唐氏综合症胎儿的孕妇体内取得的26个样本和152例已知的、未患病样本进行了分析。所有样本均取自怀单胎的未患糖尿病的白人孕妇。

然后，我们用ELISA测定法分析病人样本，以得到MSAFP的定量值，並单独地用一步测定法和二步测定法得出游离β-HCG的含量。由每种测定法得到的MSAFP值和游离β-HCG值成为在市场上可得到的计算机软件统计软件包“统计分析系统”上进行的线性判别式处理中的一个变量以建立一组基准数据。病人的孕龄也作为一个变量被加入判别式处理中。对一切孕龄及孕龄在14至16周之间的判别式分析结果归纳如下：

一切孕龄

假阳性率    发现率    对照    患病

Log（β-1）    6.6%    69.2%    152    26

Log（β-1）+Log（AFP）    5.9%    72.0%    152    25

Log（β-2）    8.2%    33.3%    138    18

Log（β-2）+Log（AFP）    10.1%    64.7%    138    17

Log（β-2）^＊9.6% 33.3% 136 18

Log（β-2）+Log（AFP）^＊10.3% 52.9% 136 17

14至16周

假阳性率    发现率    对照    患病

Log（β-1）    5.8%    68.4%    104    19

Log（β-1）+Log（AFP）    4.8%    73.7%    104    19

Log（β-2）    7.1%    45.4%    98    11

Log（β-2）+Log（AFP）    9.2%    63.6%    98    11

Log（β-2）^＊10.4% 54.6% 96 11

Log（β-2）+Log（AFP）^＊8.3% 63.6% 96 11

注：所有分析均包括孕龄。

^＊在后面带^＊的分析中，另外两组样本值为260和316的结果被去掉了。

后缀-1表示一步法处理，-2表示二步法处理。

发现率指显示阳性测试结果的胎儿唐氏综合症的百分率。

假阳性率指显示阳性测试结果的正常胎儿的百分比。

对照指被分析的未患病样本的数目。

患病指被分析的患病样本的数目。

对一切怀孕周数及怀孕14至16周孕妇利用游离β的一步测定法和AFP的组合可得到最高的发现率和最低的假阳性率。

我们的结果进一步支持了在孕妇血清检查方案中以可行而有效的方法进行唐氏综合症检查的良好效能，该良好效能包括：（a）非侵入性方法;（b）低假阳性率和高发现率;（c）使用彼此基本独立的指标;（d）对血样无苛刻限制（一天的什么时候，进食情况，个人习惯等）及（e）与其它产前检查方法的相容性。

我们的结果表明，虽然运用比其它方法更少的生物化学分析法，在唐氏综合症的检查中有可能得到更高的发现率。在唐氏综合症检查中，仅仅使用最有效的指标就能对绝大部分患严重精神发育迟缓的最普遍原因的家庭在早期妊娠中提供非侵入性检查信息。

对于本领域的专业人员来说，显然，改变判断阳性结果的危险率截止值，或对研究对象的不同小组采用不同的先验危险率，将改变对病人进行判别式处理的结果。

因此，应当明确，本发明包括了所有落在下列权利要求书范围之内的改进。

Claims (16)

1、一种确定孕妇是否处在怀有患唐氏综合症胎儿明显危险中的方法，包括：

测量孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位的含量，将所说的人绒毛膜促性腺激素中所说的游离β亚单位的测量值及孕妇的孕龄代入一个概率密度函数中，由此将所说的孕妇的所说游离β亚单位含量和所说的孕妇孕龄与一组基准数据比较，以确定所说孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。

2、一种确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合症胎儿明显危险中的方法，包括：测定孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位，测定结果是胎儿唐氏综合症危险率增加的征兆。

3、如权利要求2所述的方法，其中还包括：测定孕妇血液中的α-胎儿蛋白，人绒毛膜促性腺激素中游离β亚单位及α-胎儿蛋白的测量结果是胎儿唐氏综合症危险率增加的征兆。

4、一种确定孕妇是否处在怀有患唐氏综合症胎儿明显危险中的方法，包括：测量孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素中游离β亚单位的含量，並将该测量值与一组标准数据比较以确定孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。

5、一种确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合症胎儿明显危险中的方法，包括：用测定人绒毛膜促性腺激素中游离β亚单位的测定法测量孕妇母体血液中一种被分析物的含量，並将对该被分析物的测量结果与一组基准数据比较以确定孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。

6、如权利要求4或5所述的方法，其中还包括：测量孕妇母体血液中α-胎儿蛋白的含量，並将这一测量结果和孕妇的孕龄与一组基准数据比较。

7、如权利要求4、5或6所述的方法，其中比较步骤包括将测量结果代入到由线性判别式处理的由一组基准数据产生的一个概率密度函数中。

8、如权利要求4、5、6或7所述的方法，其中比较步骤包括将测量结果的对数与一组基准数据比较。

9、一个用于执行权利要求1至8中任一个用于确定孕妇是否处于怀有患唐氏综合症胎儿危险的方法的测定方法，包括：

用于测试孕妇血液中人绒毛膜促性腺激素中游离β亚单位的手段。

10、一种测量人体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量的测定法。

11、一种设备，包括：

适用于接收孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量的测试结果的装置和用于将测试结果与一组标准数据进行比较以确定胎儿染色体异常的计算机装置。

12、如权利要求11所述的设备，其中的胎儿染色体异常是指唐氏综合症。

13、用来确定孕妇是否处在怀有患唐氏综合症胎儿明显危险中的设备，包括：

适用于接收孕妇母体血液中人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位含量的测试结果的装置，及计算机装置，用来计算一组基准数据，和用于将所说的人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位的测量结果和所说的孕妇的孕龄代入一个概率密度函数中，由此将所说孕妇的游离β-亚单位值和所说孕妇的孕龄与一组基准数据比较以确定所说孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。

14、用来确定孕妇是否处在怀有患唐氏综合症胎儿明显危险的设备，包括：

适用于接收用一种人绒毛膜促性腺激素的游离β亚单位测定法得到的孕妇母体血液中某一被分析物的测量值的装置，及

计算机装置，用来计算一组基准数据和用于将所说的被分析物含量的测定值和所说孕妇的孕龄代入一个概率密度函数中，由此将所说孕妇的游离β亚单位的含量和所说孕妇的孕龄与一组基准数据比较，以确定孕妇怀有患唐氏综合症胎儿的危险率。

15、如权利要求13或14所述的设备，其中还包括：

适用于接收孕妇母体血液中α-胎儿蛋白含量的测量值的装置，及

其中的计算机装置还将α-胎儿蛋白的测试结果代入该概率密度函数中，由此将该孕妇的α-胎儿蛋白值与一组标准数据相比较。

16、如权利要求13、14或15所说的设备，其中该组基准数据是由各含量测量值的对数计算得到的，及

这些测量结果的对数用于将孕妇各指标的含量与该组基准数据比较。

Images