CN104738084A - 一种冷季型草坪草耐热增抗剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物逆境耐受力辅助制剂技术领域，具体涉及一种植物耐热增抗剂，尤其是涉及一种冷季型草坪草耐热增抗剂及其制备方法。本发明从多种化学试剂中，选取多效唑、水杨酸、壳聚糖和氯化钙，结合恰当的助溶剂制成混合溶液对冷季型草坪草进行喷施处理，在高温下观察其对草坪草耐热性的提高效果。与传统方法相比，本发明更好地抑制了冷季型草坪草在高温下枯黄萎蔫、叶绿素的降低、丙二醛的上升以及游离脯氨酸产生速率低的现象。通过本发明处理的冷季型草坪草，在高温条件下(38/30℃，昼/夜)，可以保持青绿和较好的形态15d以上，而对照组在相同条件下，只能保持7d左右青绿期。本发明方法不仅适合于大规模工厂化试剂生产，也适合于有一定条件的普通绿化单位。

Description

一种冷季型草坪草耐热增抗剂及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种植物耐热增抗剂，尤其是涉及一种冷季型草坪草耐热增抗剂及其制备方法。

二、背景技术

草坪草具有净化空气和水源、美化环境、改善小气候等多方面功效，在现代生态城市建设过程中越来越受到人们的重视，广泛应用于小区、道路两旁、工业园区等地。草坪草按其生长的最适温度可以分为冷季型和暖季型草坪草。冷季型草坪草最适生长温度为15～24℃，相对低于暖季型草坪草。而冷季型草坪草的绿期相对较长，在我国许多地区使用广泛。因此冷季型草坪草的越夏问题一直是草坪草抗性生理生态学的研究热点和重点。目前针对冷季型草坪草耐热问题的解决措施主要有热锻炼、改善水肥管理措施、外施化学物质和运用生物技术培育耐热品种等。其中，热锻炼和改善管理措施相对容易操作，但成效有限；利用生物技术培育耐热品种是一个漫长并具有高难度的过程；所以，相比之下，找到一种高效简便的外施化学物质更具有操作性和高效性。

水杨酸(Salicylicacid，SA)是植物界中广泛存在的一种小分子酚类物质，它不仅可以调节开花、侧芽萌发等植物生长发育过程，还能诱导植物产生抗逆性，其主要机理是提高了植物的抗氧化系统酶活性，例如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等。水杨酸在兰科等植物抗热性研究方面已有报道，在提高冷季型草坪草的抗热性方面鲜见报道；多效唑(PP₃₃₃)可以相对抑制植物的纵向生长、促进其横向生长(矮化和须根系生长)，来提高植物的抗逆性；Ca²⁺是植物体内一种必须的营养元素，也是偶联胞外信号与激发胞内相关生理生化反应的第二信使。有报道显示，Ca²⁺参与了低温胁迫、氧胁迫、盐胁迫、高温胁迫等多种逆境胁迫过程。施用外源钙能有效提高植物抗逆性。但目前研究多用于农业经济作物，研究用于草坪的试验相对较少；研究表明，壳聚糖(CS)在一定程度上能改变钙在细胞内的存在形式，可以增加结合态Ca、减少可溶性Ca，而结合态Ca的增多可以增加细胞壁和细胞膜的稳定性。壳聚糖本身也是一种抗氧化剂，可以减缓植物的衰老。从而提高植物的抗逆性。

因此，本发明是结合了水杨酸、多效唑、CaCl₂以及壳聚糖的一种冷季型草坪草耐热增抗剂及其制备方法。水杨酸、多效唑、CaCl₂和壳聚糖的复合效果要好于单一使用的效果，本发明利用它们作用机理不同尝试出一种较好的比例复配成耐热增抗剂，提高冷季型草坪草的耐热能力，减少冷季型草坪草在夏季萎蔫枯黄难越夏等现象。

三、发明内容

1、本发明需要解决的技术问题：

本发明要解决的技术问题是克服冷季型草坪草难以越夏、耐热性低的问题，通过使用耐热增抗剂，延长冷季型草坪草的绿期，提高冷季型草坪草的耐热越夏能力，其主要解决的关键技术问题为：

(1)降低高温胁迫下冷季型草坪草叶绿素含量的下降：由于高温环境下，叶绿素合成酶的活性受到了影响导致叶绿素合成的速度下降，同时高温还会加速叶绿素的分解，两者的共同影响导致植物体内叶绿素总量大幅下降。而叶绿素含量直接关系到植物绿期的长短。

(2)单一试剂处理效果不理想：目前，国内外提高冷季型草坪草耐热性的方法还较少，而这些方法基本上都是单一试剂，作用机理较单一，效果有限。

(3)基因育种手段操作复杂，成本较高：冷季型草坪草耐热性提高方面基因育种确实可以有效地解决问题，例如热激蛋白合成基因的导入，但其复杂程度和投入资本、时间等较大，不适合普通绿化农户或公司使用。因此，应用范围和可预见性有限。

(4)如何筛选出简便有效的冷季型草坪草耐热增抗剂不同成分的最佳配比：如何筛选多种有效提高草坪草耐热性的成分及其最佳用量的配比，并要获得稳定性较强的试剂以便后续的保存，实现运输和推广的可能。

2、本发明的技术方案：

(1)SA处理浓度的选择：在预实验的基础上，进一步筛选出水杨酸对提高冷季型草坪草耐热性效果最好的浓度，分别选取各个处理浓度的5组，处理冷季型草坪草高羊茅，并测定高羊茅在处理后置于高温下的生长情况，包括叶绿素含量、丙二醛含量和脯氨酸含量等参数，根据这些指标来筛选出最佳处理浓度。最终选择了0.1mmol/L为最佳处理浓度；

(2)PP₃₃₃处理浓度的选择：经多次试验筛选，选择了200mg/kg的处理浓度；

(3)结合态Ca制剂的制作：壳聚糖可增加植物细胞中的结合态Ca，减少可溶性Ca，增加细胞膜和细胞壁的稳定性，因此，本试验中通过CaCl₂溶液和CS溶液的适当混合来提高冷季型草坪草的耐热性。

(4)CS溶液的浓度选择及其助溶剂的选择：CS的浓度在多次筛选对比试验后选择了20mmol/L，并选择了磷酸作为其酸性助溶剂。

(5)SA和PP₃₃₃助溶剂的选择：通过溶解效果、所需用量、对环境的影响等多方面角度的综合考虑选择了丙酮作为SA和PP₃₃₃的助溶剂。

3、本发明的有益效果

(1)操作过程简单：在试验结果的基础上，取相应量的SA、PP₃₃₃、CaCl₂以及CS，再适当添加助溶剂，按照一定的顺序和配比将其配制成稳定的制剂，对冷季型草坪草在高温胁迫下适时适量地喷洒即可。因而是一种极为方便的制剂生产方式和处理方式。

(2)生产成本低廉：由于在处理过程中，不涉及任何贵重化学物品，而且配制时所需物品比较简单易得，即便是运输过程中对温度的要求也不高，可有效地降低运输过程中的成本。另外，所使用的配成制剂的原料均为常见的、较为廉价的试剂，且制作过程中不需要使用耐高温、耐高压、耐腐蚀性强的仪器与设备，而且不需要过多使用额外的水、电、器械等物质，因而，分析投入成本低廉。

(3)耐热增抗剂原料环保，不存在生态安全隐患：本发明所使用的制剂包括壳聚糖、多效唑、CaCl₂、水杨酸和少量的助溶剂，由于这些试剂本身无毒或低毒，加之用量极少，因此对环境无负担，不会造成水体富营养化、土壤板结等问题，因此具有极大的推广价值。

(4)提高冷季型草坪草耐热性的效果明显：本发明所制成的冷季型草坪草耐热增抗剂喷施草坪草后，高温条件下喷施后的草坪草生长的情况明显好于未喷施的草坪草，这种综合了多种促进耐热性有效成分的混合试剂克服了传统单一试剂的机理单一、效果有限的缺点，可显著改善草坪的耐热性。

四、附图说明

图1.冷季型草坪草高羊茅经不同处理后放置在高温(38/30，昼/夜)条件下，观测叶片叶绿素含量(mg/g FW)的变化对比曲线图；

图2.冷季型草坪草高羊茅经不同处理后放置在高温(38/30，昼/夜)条件下，观测叶片MDA含量(μmol/g FW)的变化对比曲线图；

图3.冷季型草坪草高羊茅经不同处理后放置在高温(38/30，昼/夜)条件下，观测叶片脯氨酸含量(μg/g FW)的变化对比曲线图。

五、具体实施方式

1、本发明的工艺流程

为解决技术问题，本发明提供的解决方案，其工艺流程如下：

冷季型草坪草→适时适量地喷施耐热增抗剂(PP₃₃₃+CaCl₂+SA+CS)→提高耐热性

(1)上述冷季型草坪草为凌志高羊茅品种(Festuca arundinacea cv.Barlexas)，选择健康的种子播种在塑料盆中，塑料盆直径为15cm，深11cm，每盆播种100-120粒种子，在室外20±5℃下接受自然光的照射，并进行恰当的水肥管理，30天后分组进行高温胁迫试验；

(2)上述氯化钙(CaCl₂)是指：CaCl₂的水溶液，其含量为20mmol/L；

(3)上述多效唑(PP₃₃₃)和水杨酸(SA)是指：含助溶剂的多效唑和水杨酸的水溶液，按质量百分比，其含量为多效唑0.02-0.05％，水杨酸为0.02％，丙酮作为助溶剂，其含量为0.02-0.04％，余为水。

(3)上述壳聚糖(CS)是指：壳聚糖的酸性水溶液，按质量百分比，其含量为壳聚糖0.04-0.06％，磷酸作为酸性助溶剂，含量为0.01％，余为水。

(4)上述耐热增抗剂是指：上述CaCl₂+(PP₃₃₃+SA)+CS的等体积混合溶液。

2、本发明的实施步骤：

(1)配制：CaCl₂水溶液的配制，称取CaCl₂2.2g溶于1L自来水；SA+PP₃₃₃溶液的配制，称取多效唑粉剂200mg溶于4ml丙酮中，再加入13.81mg水杨酸，搅拌使之溶解，并兑自来水至1000ml；CS溶液的配制，称取壳聚糖(分子量10万)4g，加磷酸约2ml拌匀，兑自来水至1000ml；将上述CaCl₂+(PP₃₃₃+SA)+CS三种溶液等体积混合，即可得到3L冷季型草坪草耐热增抗剂。

(2)喷施：将于室外培养30d的60盆凌志高羊茅分为2组，分别是处理组和对照组。处理组每盆面积大约为0.01766m²，每盆喷施10ml耐热增抗剂。对照组每盆喷施10ml自来水。对照组与处理组均放置于人工培养箱中，给予适宜的温度(26/15℃(昼/夜))和水分(相对湿度为65±10％)以及光照条件(14小时的光周期，光照强度为400μmol m^-2 s^-1)，让草坪草充分吸收耐热增抗剂。24h后，将人工培养箱的温度调至38/30℃(昼/夜)进行高温胁迫，其余条件保持不变。花盆在人工气候箱内随机摆放并定期交换，以确保每盆所受内部环境影响一致，增加试验可靠性。

3、高温胁迫下喷施耐热增抗剂与未喷施组效果对比与评价指标：

分别在胁迫的第0、3、6、9、12、15天对处理组和对照组的耐热效果进行测定。从感官来看，处理组的叶色在处理6天以后明显绿于对照组，并在14天时仍较绿，对照组在第9天时已有一半变黄；生理指标上主要测定了叶绿素含量、MDA、脯氨酸含量等：

(1)叶绿素

叶绿素含量采用95％乙醇浸提法测定。植物叶片叶绿素含量的大小可以反映出植物光合作用的强弱以及抗逆性的大小。一般随着温度的升高，植物的叶绿素含量降低。如图1所示，本试验中喷施了耐热增抗剂的高羊茅处理组的叶绿素含量显著高于对照组，在处理的第15d时比对照的叶绿素含量高了49.78％，证明该耐热增抗剂可有效降低叶绿素含量的下降，减少高温对植物光合作用的影响。

(2)MDA

MDA含量的测定根据硫代巴比妥酸(TBA)显色法略加修改。称取0.2g高羊茅叶片，加入5ml、10％的三氯乙酸(TCA)和少量石英沙，研磨至匀浆，然后在9000转速下离心10min，取上清液2ml，再加2ml、0.6％的TBA溶液，混匀后加热煮沸15min，迅速冷却后再离心(5000转速下10min)，取上清液在532nm和600nm下比色。MDA的含量用如下公式计算：MDA(μmol/g FW)＝[(A532-A600)/155]×10³×稀释倍数。MDA反映了植物膜系统受损害的程度，直接反映了植物的抗热性大小。如图2所示，本试验中，喷施了冷季型草坪草耐热增抗剂的处理组的MDA增长的速率明显要低于对照组。表明，耐热增抗剂一定程度上可以降低高温对冷季型草坪草的伤害，提高冷季型草坪草的耐热性。

(3)脯氨酸

脯氨酸可以降低细胞水势，是植物体内关键的渗透调节物质，可以保护植物体内的蛋白质，提高蛋白质分子的水合度。脯氨酸含量的增高意味着植物抵抗逆境能力的增强。本试验中游离脯氨酸采用酸性茚三酮比色法测定：称取2.5g茚三酮，加入60mL冰醋酸和40mL6mol/L磷酸，于70℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，4℃保存，得到酸性茚三酮试剂。脯氨酸标准母液：称取10mg脯氨酸溶于少量80％乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL。脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0，0.5，1.25，2.5，5.0，7.5，10.0，15.0mL分别放入8个50mL容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL，配成0.0，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0μg/mL的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液2mL，冰醋酸2mL，茚三酮试剂2mL，加入到10mL带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15分钟，用分光光度计测定520nm的光密度值，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。提取脯氨酸：分别称取处理组和对照组的叶片，每份0.3g。剪碎，加入适量80％乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至25mL刻度试管中，用80％乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80％乙醇定容至刻度，混匀，80℃水浴中提取20分钟。除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g的人造沸石和0.2g活性碳，强烈振荡5分钟，过滤，滤液备用。脯氨酸含量的测定：分别吸取上述提取液2mL于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2mL80％乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂，沸水浴中加热15分钟，冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。样品中脯氨酸含量的计算：脯氨酸含量(μg/g)＝(cxv/a)/w或脯氨酸含量(％)＝[(c*v)/a]/w*106×100。其中，C：由标准曲线上查得的脯氨酸微克数；v：提取液总体积(mL)；a：测定液体积(mL)；w：样品重(g)。如图3所示，试验中，处理组的游离脯氨酸含量明显高于对照组，证明了本发明的冷季型草坪草耐热增抗剂对冷季型草坪草在高温下的生长和绿期的延长具有明显促进作用，可有效提高草坪草的耐热性，实现有效、安全、经济、可行的生产效果，基本解决了冷季型草坪草在高温夏季容易萎蔫枯黄难越夏的技术难题。

Claims (1)

1.一种冷季型草坪草耐热增抗剂及其制备方法，其特征是包含了多效唑、氯化钙、水杨酸、壳聚糖和助溶剂的混合溶液，具体方法为：

(1)含有助溶剂的多效唑(PP₃₃₃)和水杨酸(SA)的水溶液，按质量百分比，其含量为多效唑0.02-0.05％，水杨酸为0.02％，丙酮作为助溶剂，其含量为0.02-0.04％，余为水；

(2)氯化钙(CaCl₂)的水溶液，按质量百分比，其含量为2.2％；

(3)含有助溶剂的壳聚糖(CS)水溶液，按质量百分比，其含量为壳聚糖0.04-0.06％，磷酸作为酸性助溶剂，含量为0.01％，余为水；

(4)耐热增抗剂是上述CaCl₂溶液+(PP₃₃₃+SA)溶液+CS溶液的等体积混合溶液。