CN104713874A - 乳腺癌尿液检测试剂和检测试剂盒及其制备和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳腺癌尿液检测试剂和检测试剂盒及其制备和检测方法，乳腺癌尿液检测试剂主要由氯化铁，α-亚硝基-β-萘酚，盐酸羟胺，盐酸萘乙二胺和硫酸组成。将本发明的乳腺癌尿液检测试剂制成检测试剂盒。本发明通过将受试者的尿液加入本发明的检测试剂中，混合后静置，可以方便的通过颜色和沉淀反应来判断受试者是否患有乳腺癌。本发明的乳腺癌尿液检测试剂具有成本低，简便可靠，特异性高等优点，可用于乳腺癌的早期筛查。

Description

乳腺癌尿液检测试剂和检测试剂盒及其制备和检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地说，涉及一种乳腺癌尿液检测试剂和检测试剂盒及其制备和检测方法。

背景技术

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，位居全球女性发病和死亡第一位。据国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）报告，2008年全球女性新发乳腺癌138万例，占女性恶性肿瘤发病的22.9%；死亡46万例，占女性恶性肿瘤死亡的13.7%。中国乳腺癌总死亡率在上世纪70-90年代初曾表现出一定的下降趋势，但近年来中青年女性发病率和死亡率以及绝对人数都呈现出明显的增长趋势。2010年《中国乳腺疾病调查报告》指出，中国乳腺癌发病率的增长速度高出西方发达国家1～2个百分点，并呈现出明显的年轻化趋势，每年约有20余万女性罹患乳腺癌。2003-2009年，中国城市乳腺癌死亡率增长了38.91%。

目前对乳腺癌仍缺乏有效的病因学预防手段，因此二级预防显得尤为重要。乳腺癌筛查是实现乳腺癌早发现、早诊断和早治疗的重要的二级预防手段。大量研究表明，筛查的实施是近年来欧美各国乳腺癌死亡率下降的主要原因之一。合理的筛查能够早期发现乳腺癌，提高治愈率，增加“保乳”手术的机会，减少术后辅助治疗，节省医疗费用，提高患者生活质量。为此，世界卫生组织（WHO）已将乳腺癌列为应开展人群筛查的癌症类别之一。

目前全球常用的乳腺癌筛查手段包括临床乳腺检查（CBE）、乳房X线摄影术（MAM）、超声成像（US）和磁共振成像（MRI）等。

CBE是由乳腺专科临床医生以双手触诊的方式全面检查乳房、腋窝及锁骨上下区有无结节、皮肤增厚、皮肤异常、乳头内陷和乳头溢液等现象，如发现肿块，可粗略了解肿块大小、硬度、活动度以及与周围组织的关系，以便开展进一步的检查以确诊乳腺癌。CBE是临床上必不可少的乳腺检查方法，是其他各种影像学检查的基础，在乳腺癌筛查中常与MAM或US联合使用。

MAM是利用X射线的物理性质及人体乳房组织不同的等密度值，将乳房的二维图像投影于X光胶片上进行观察的诊断方法。MAM技术始于19世纪60年代，最初是由法国医生Gross于1969年研制出了钼靶阳极X线机，之后这项技术得到了迅速的发展，是目前诊断乳腺疾病尤其是早期发现乳腺癌的最重要且最有效的方法，也是许多欧美发达国家公认的乳腺癌筛查首选手段。计算机辅助诊断（CAD）是通过计算机在医学影像图像中搜索提取具有诊断价值的影像特征，以进一步检测并定位其中的肿块和微小钙化灶的技术。在乳腺癌MAM筛查中加入CAD技术可提高早期乳腺癌的检出率，降低诊断假阴性率，提高诊断准确性。

US是临床上应用广泛的乳腺实时成像检查方法，对囊性和实性肿块均具有较好的鉴别价值，还可显示腋窝及锁骨上淋巴结等周围组织情况，在发展中国家的乳腺癌筛查中具有举足轻重的地位。近年来，高频探头和彩色多普勒超声的普及更促进了US的发展和应用。许多新的超声显像技术陆续出现，表现出优于传统US的特性，例如超声弹性成像可客观评价乳腺肿块的相对硬度，有利于良性和恶性肿瘤的鉴别，相比传统US具有更广泛的应用前景。

MRI利用的是核磁共振原理，依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中的不同衰减，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，从而获得构成这一物体的原子核位置及种类，并据此绘制物体内部结构图像。MRI获得的图像非常清晰而精细，可对人体各部位进行多角度、多平面成像，分辨力高，能够更加客观而具体地显示人体内的解剖组织及其相邻关系，对病灶进行更好地定位和定性，在早期肿瘤的诊断中具有很大的应用价值。1982年，Ross等首先将MRI用于乳腺疾病检测，此后随着新技术的发展，MRI在乳腺癌筛查中的应用日益受到人们的重视。

上述这些筛查方法的原理和机制各不相同，下面详细介绍各种方法的优缺点，筛查效能和适用人群。

CBE的优点是经济实用，并能提高女性对乳腺癌的预防意识和警惕性；缺点是缺乏统一标准，结果的准确　性与医生经验相关；不能检出无法触及的0期肿瘤，单独使用时敏感度较低。筛查效能：筛查敏感度随肿瘤增大而增加，随体重增加而降低，与年龄呈倒U形曲线，对亚洲女性的敏感度优于白种人女性；与MAM或US联合使用可提高检出率，适合发展中国家一般女性人群的乳腺癌筛查。

MAM的优点是对40岁以上女性的敏感度高，可检出临床不能触及的细小钙化，实现准确的定性和定位；缺点是存在放射性损伤，对年轻女性或致密乳腺的敏感度较差。筛查效能：可发现59%直径＜1 cm的非浸润性乳腺癌和53%的浸润性乳腺癌，筛查敏感度为83%～95%，特异度为93.5%～99.1%，适合较大年龄女性或乳腺致密度较低人群的筛查。

US的优点是经济简便，无痛苦，无放射性损伤，可鉴别乳腺囊性和实性肿瘤，能检出致密乳腺内的早期乳腺癌；缺点是对微小钙化灶不敏感，检出率依赖于检查者的操作熟练度。筛查效能：可有效地检出一部分MAM阴性的潜在乳腺癌，高频US筛查的合并敏感度和特异度分别为78.5%和97.5%；超声弹性成像鉴别乳腺良恶性肿瘤的敏感度高于常规US，且特异度不低于常规US，各年龄女性均适用，尤其适用于年轻女性和乳腺致密型女性（包括中国在内的大多数亚洲国家女性）。

MRI的优点是检出病灶不受腺体密度的限制，无放射性损伤，对早期乳腺癌的敏感度和分期，准确性均优于MAM和US；缺点是费用高，缺乏规范化的操作技术标准，对微小钙化灶的检出受限，增强造影MRI具有创伤性。筛查效能：敏感度为88.4%～100%，特异度为37%～97%；对MAM检查可能遗漏的乳腺导管原位癌的诊断敏感度较高，尤其对核型高度异常的乳腺导管原位癌更为敏感，仅适用于高危人群（具有明显的遗传倾向或乳腺癌易感基因（BRCA） 1和BRCA 2突变妇女）的筛查，而不推荐用于一生中乳腺癌风险小于15%的人群。

由此可见，本领域现有的乳腺癌筛查方法存在成本高，依赖医生经验，检测灵敏性低等缺点，缺少一种可用于乳腺癌大规模筛查的低成本、易操作且特异性高的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种通过检测尿液诊断乳腺癌的方法。本发明的发明人在前期研究中发现，在乳腺癌患者的尿液中，γ-羟基丁酸和5-羟色胺的浓度显著高于健康人以及其它类型癌症患者尿液中的相应水平。经过对大量病例进行比对和统计分析，我们发现尿液中的γ-羟基丁酸和5-羟色胺水平可作为乳腺癌的特异性诊断靶标。本发明经过大量实验摸索，尝试了各种溶液配方，成功开发出一种能同时检测尿液中γ-羟基丁酸和5-羟色胺存在的检测试剂。

本发明提供一种乳腺癌尿液检测试剂，其特征在于，所述检测试剂由氯化铁，α-亚硝基-β-萘酚，盐酸羟胺，盐酸萘乙二胺和硫酸组成。

优选地，所述检测试剂中各组分的浓度范围如下：0.5-1.0 mol/L 氯化铁，0.1-0.5 mol/L α-亚硝基-β-萘酚，0.1-0.5 mol/L 盐酸羟胺，0.0005-0.002 mol/L 盐酸萘乙二胺, 和3-7 mol/L 硫酸。

更优选地，所述检测试剂中各组分的浓度如下：0.7 mol/L 氯化铁，0.3 mol/L α-亚硝基-β-萘酚，0.2 mol/L 盐酸羟胺，0.001 mol/L 盐酸萘乙二胺, 和5 mol/L 硫酸。

本发明还提供一种乳腺癌尿液检测试剂盒，包含上述乳腺癌尿液检测试剂。

本发明还提供配制所述检测试剂的方法，包括：配制100 ml乳腺癌尿液检测试剂，按照上述浓度计算并准确称取各组分的量，溶于所述浓度的硫酸，混匀，室温避光保存。

本发明的尿液检测试剂可用于检测乳腺癌。

本发明还提供上述乳腺癌尿液检测试剂在制备通过检测尿液诊断乳腺癌的试剂盒中的用途。

本发明的检测试剂或试剂盒使用的生物学样本为尿液。

本发明还提供上述检测试剂或试剂盒用于通过检测尿液诊断乳腺癌的用途。

本发明的乳腺癌尿液检测试剂的检测方法如下：取试验对象尿液5ml，加入本发明的乳腺癌尿液检测试剂3ml，混匀后于40-50℃水浴中静置10分钟，观察溶液颜色是否发生变化以及产生沉淀，如果溶液变为紫红色并且产生红褐色沉淀，则检测结果为阳性，提示试验对象患有乳腺癌；如果溶液颜色没有变化仍为浅黄色或者没有产生沉淀，则检测结果为阴性，提示试验对象没有乳腺癌。

本发明的有益效果在于：本发明的尿液检测试剂制备方便，成本低，检测方法快捷无痛苦，可用于乳腺癌的大规模筛查以及乳腺癌高危人群的早期防范。

具体实施方式

下面通过实施例来描述本发明的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本发明的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本发明的教导，结合现有技术对本发明技术方案的改进是显然的，均属于本发明保护的范围。

实施例

实施例1：乳腺癌尿液检测试剂的制备

配制100ml乳腺癌尿液检测试剂，称取8.1g 氯化铁，2.92g α-亚硝基-β-萘酚，0.69g 盐酸羟胺和0.013g 盐酸萘乙二胺，依次溶于100 ml、3 mol/L 硫酸，搅拌混匀，获得具有如下组分浓度的检测试剂：13.5g、0.5 mol/L 氯化铁，0.1 mol/L α-亚硝基-β-萘酚，0.1 mol/L 盐酸羟胺，0.0005 mol/L 盐酸萘乙二胺, 和3 mol/L 硫酸。将该检测试剂于室温避光保存。

实施例2：乳腺癌尿液检测试剂的制备

配制100ml乳腺癌尿液检测试剂，称取16.2g 氯化铁，14.6g α-亚硝基-β-萘酚，3.45g 盐酸羟胺和0.052g 盐酸萘乙二胺，依次溶于100 ml、7 mol/L 硫酸，搅拌混匀，获得具有如下组分浓度的检测试剂：1.0 mol/L 氯化铁，0.5 mol/L α-亚硝基-β-萘酚，0.5 mol/L 盐酸羟胺， 0.002 mol/L 盐酸萘乙二胺, 和7 mol/L 硫酸。将该检测试剂于室温避光保存。

实施例3：乳腺癌尿液检测试剂的制备

配制100ml乳腺癌尿液检测试剂，称取11.3g 氯化铁，8.8g α-亚硝基-β-萘酚，1.38g 盐酸羟胺和0.026g 盐酸萘乙二胺，依次溶于100 ml、5 mol/L 硫酸，搅拌混匀，获得具有如下组分浓度的检测试剂：0.7 mol/L 氯化铁，0.3 mol/Lα-亚硝基-β-萘酚，0.2 mol/L 盐酸羟胺， 0.001 mol/L 盐酸萘乙二胺, 和5 mol/L 硫酸。将该检测试剂于室温避光保存。

实施例4：乳腺癌尿液检测试剂的临床验证

1．试验对象：将试验对象分为3组，第1组为确诊的乳腺癌患者52名，第2组为健康人60名，第3组为确诊的其它类型癌症患者60名。第2组和第3组为对照组。

2．检测方法：

（1）早晨空腹时收集试验对象的尿液20ml左右，并标记；

（2）对于每份尿液样品，取尿液5ml，加入本发明的乳腺癌尿液检测试剂3ml，混匀后于40-50℃水浴中静置10分钟；

（3）观测反应结果，如果溶液变为紫红色并且产生红褐色沉淀，则检测结果为阳性，提示试验对象患有乳腺癌；如果溶液颜色没有变化仍为浅黄色或者没有产生沉淀，则检测结果为阴性，提示试验对象没有乳腺癌。

检测结果显示于表1。     

表1. 检测结果

根据表1所示检测结果，按照癌症筛查领域的统计学原理（参见“癌症筛查方法的评价”.《当代肿瘤学杂志》，1995年，第2卷，第2期，第84-85页），对上述结果进行数据处理得到以下结果：敏感性＝88.5%，特异性＝96.7%，粗符合率＝92.9%。

此外，还利用本发明尿液检测试剂检测了60名确诊的其他类型癌症患者。检测方法如上所述，结果显示7名为阳性，53名为阴性，假阳性率＝11.7%。

综合以上结果，说明本发明的乳腺癌尿液检测试剂特异性强，准确率高，可作为有效的乳腺癌筛查试剂。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非对本发明作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的更改、修饰与演变的等同变化均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本发明的由权利要求界定的范围内。

Claims (9)

1.一种乳腺癌尿液检测试剂，其特征在于，所述检测试剂主要由氯化铁，α-亚硝基-β-萘酚，盐酸羟胺，盐酸萘乙二胺和硫酸组成。

2.如权利要求1所述的乳腺癌尿液检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中各组分的浓度范围如下：0.5-1.0 mol/L 氯化铁，0.1-0.5 mol/L α-亚硝基-β-萘酚，0.1-0.5 mol/L 盐酸羟胺，0.0005-0.002 mol/L 盐酸萘乙二胺，和3-7 mol/L 硫酸。

3.如权利要求2所述的乳腺癌尿液检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中各组分的浓度如下：0.7 mol/L 氯化铁，0.3 mol/L α-亚硝基-β-萘酚，0.2 mol/L 盐酸羟胺，0.001 mol/L 盐酸萘乙二胺，和5 mol/L 硫酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的乳腺癌尿液检测试剂在制备通过检测尿液诊断乳腺癌的试剂盒中的用途。

5.如权利要求1-3中任一项所述的乳腺癌尿液检测试剂或权利要求4所述的乳腺癌尿液检测试剂盒用于通过检测尿液诊断乳腺癌的用途。

6.一种乳腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任一项所述的乳腺癌尿液检测试剂。

7.一种乳腺癌尿液检测试剂的制备方法，其特征在于，主要包括：配制100 ml乳腺癌尿液检测试剂，按照如权利要求2或3中所述的浓度计算并准确称取各组分的量，溶于所述浓度的硫酸，混匀，室温避光保存。

8.一种乳腺癌尿液检测试剂盒的制备方法，其特征在于，主要包括：配制100 ml乳腺癌尿液检测试剂，按照如权利要求2或3中所述的浓度计算并准确称取各组分的量，溶于所述浓度的硫酸，混匀，室温避光保存在试剂盒中。

9.一种乳腺癌尿液检测试剂盒的检测方法，其特征在于，取试验对象尿液5ml，加入如权利要求1-3中任一项所述的乳腺癌尿液检测试剂3ml，混匀后于40-50℃水浴中静置10分钟，观察溶液颜色是否发生变化以及产生沉淀。