CN104710510A - Smac蛋白二聚拟合物及其鉴定方法 - Google Patents

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魏彦杰
张慧琳
彭丰斌
孟金涛
冯圣中
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Abstract

本发明涉及生物化学技术领域，特别涉及一种Smac蛋白二聚拟合物及其鉴定方法与应用。本发明的Smac蛋白二聚拟合物以AT-406为骨架，用连接基团将两个AT-406单体分子连接，在保持AT-406优良的生物活性和药理、毒理特性的同时，增加对肿瘤细胞凋亡的效率。

Description

Smac蛋白二聚拟合物及其鉴定方法
【技术领域】
本发明涉及生物化学技术领域，特别涉及一种Smac蛋白二聚拟合物及其鉴定方法与应用。
【背景技术】
癌症（Cancer），亦称恶性肿瘤（Malignant neoplasm），是由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，目前已成为造成中国人死亡的最大杀手。2013年全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》中提到中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万；全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。从2009年开始，恶性肿瘤一直居深圳居民死因榜首，深圳每万人口肿瘤疾病死亡率已从2002年的1.3%上升到2011年的1.9%；2012年度深圳肿瘤登记报告显示，常住人口新发恶性肿瘤11321例，较2011年增加3.0%，深圳的癌症发病率呈现逐年高发的严峻态势。开发有效的癌症治疗药物不仅能为社会减轻巨大的经济负担，还能长远地造福国计民生。
当今癌症治疗中一个难以克服的问题就是肿瘤细胞不能正常地进行细胞凋亡，而最终导致肿瘤的疯狂增长。所谓细胞凋亡（Apoptosis）是区别于细胞坏死（Necrosis），由生理或病理因素所引起的程序性细胞死亡（Programmed CellDeath）。目前大多数癌症的治疗方法，如放疗、化疗和免疫疗法等，均通过直接或间接的方式引发肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的恶性生长。然而，肿瘤细胞对其自身细胞凋亡的抑制，仍然是当今癌症治疗中难以克服的问题。有效地抑制肿瘤细胞中过度表达的细胞凋亡负调控蛋白（Negative Regulator），如细胞凋亡抑制蛋白（IAP），是癌症治愈的关键，也是新药研发的目标。通过用小分子来模拟IAP的天然抑制剂Smac蛋白，可以起到促进肿瘤细胞凋亡的作用；而研究表明，Smac蛋白二聚拟合物与IAP蛋白结合能力是相应单体的4倍，而该二聚小分子拟合物引发肿瘤细胞凋亡的活性则是相应单体的100至1400倍，因此二聚小分子Smac蛋白拟合物可以更加有效地模仿Smac蛋白在细胞内的作用方式——以二聚体的形式与IAP作用。
因此，提出一种Smac蛋白二聚拟合物成为该技术领域中亟待解决的问题。
【发明内容】
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种Smac蛋白二聚拟合物。
本发明的目的可通过以下技术措施来实现：
一种Smac蛋白二聚拟合物，所述拟合物为具有通式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药：
其中，L是以共价键方式将位置1、2、3或4的甲基与位置1’、2’、3’或4’的甲基连接的连接基。
优选地，L由若干个亚甲基组成。
优选地，L包括芳香环。
优选地，所述拟合物与XIAP的BIR2和BIR3区域同时相互作用。
优选地，L连接位置1和位置1’的甲基。
优选地，L连接位置1和位置2’的甲基。
本发明还提供了一种Smac蛋白二聚拟合物的鉴定方法，包括如下步骤：
步骤1：用连接基L将两个第一化合物连接形成Smac蛋白二聚拟合物，其中，所述第一化合物为N-(二苯基甲基)十氢-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)-1-氧代丙基]氨基]-3-(3-甲基-1-氧代丁基)-6-氧代吡咯并[1,2-A][1,5]二氮杂环辛烷-8-甲酰胺；
步骤2：合成步骤1所得Smac蛋白二聚拟合物；
步骤3：测定步骤2所得Smac蛋白二聚拟合物对细胞凋亡抑制蛋白的抑制常数。
优选地，所述步骤3中的细胞凋亡抑制蛋白为XIAP、c-IAP1或c-IAP2。
优选地，所述步骤3之后还包括如下步骤：
测定步骤2所得Smac蛋白二聚拟合物对肿瘤细胞生长的抑制活性、Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞死亡的生物活性及Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞凋亡的生物活性。
本发明还提供了上述的Smac蛋白二聚拟合物在肿瘤细胞生长的抑制、诱发肿瘤细胞死亡或诱发肿瘤细胞凋亡中的应用。
本发明的有益效果在于，本发明的Smac蛋白二聚拟合物以AT-406为骨架，用连接基团将两个AT-406单体分子连接，在保持AT-406优良的生物活性和药理、毒理特性的同时，增加对肿瘤细胞凋亡的效率。
【附图说明】
图1是本发明实施例的Smac蛋白二聚拟合物鉴定方法的流程图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的Smac蛋白二聚拟合物以AT-406（N-(二苯基甲基)十氢-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)-1-氧代丙基]氨基]-3-(3-甲基-1-氧代丁基)-6-氧代吡咯并[1,2-A][1,5]二氮杂环辛烷-8-甲酰胺）为骨架，用连接基团将两个AT-406单体分子连接，在保持AT-406优良的生物活性和药理、毒理特性的同时，增加对肿瘤细胞凋亡的效率。
本发明研究如何用计算机辅助药物设计方法设计基于AT-406的二聚小分子Smac蛋白拟合物。化合物AT-406于2010年3月获美国FDA批准进入一期临床试验，采用化合物AT-406的母核化学骨架为单体部分，可以保持其优良的生物活性和药理、毒理特性。可以连接单体AT-406的连接臂种类众多，而且连接臂长度也可以变化，因此有成千上万种组合。比如二聚体的连接臂可以由不同长度的亚甲基所组成，而在连接臂上，可以插入一些芳香环来改变连接臂的角度，同时，需用计算机辅助设计的方法设计二聚小分子Smac蛋白拟合物，使得它与XIAP结合性能较好。
本发明实施例提供了一种Smac蛋白二聚拟合物，为具有通式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药：
其中，L是以共价键方式将位置1、2、3或4的甲基与位置1’、2’、3’或4’的甲基连接的连接基。
在本实施例的一个较佳方案中，L由若干个亚甲基组成。
在本实施例的另一个较佳方案中，L包括芳香环。
进一步地，所述拟合物与XIAP的BIR2和BIR3区域同时相互作用。
进一步地，L连接位置1和位置1’的甲基。
进一步地，L连接位置1和位置2’的甲基。
本发明实施例还提供了一种Smac蛋白二聚拟合物的鉴定方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤S101：用连接基L将两个第一化合物连接形成Smac蛋白二聚拟合物，其中，所述第一化合物为N-(二苯基甲基)十氢-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)-1-氧代丙基]氨基]-3-(3-甲基-1-氧代丁基)-6-氧代吡咯并[1,2-A][1,5]二氮杂环辛烷-8-甲酰胺；
具体参见上述对Smac蛋白二聚拟合物的分析，在此不进行一一赘述。
步骤S102：合成步骤S101所得Smac蛋白二聚拟合物；
具体地，步骤S101中的研究内容将为实验阶段提供一些高活性、低毒性的候选Smac蛋白二聚拟合物，需要研究如何利用化学方法合成相应的候选二聚小分子。由于计算机辅助药物设计的候选结果可能涵盖多种不同的连接臂，这就为实验合成造成了一定的困难。同时所设计的Smac蛋白二聚拟合物必须和XIAP的BIR2和BIR3区域同时相互作用，因此在该部分研究中，需要除掉无法合成的二聚小分子Smac蛋白拟合物。
步骤S103：测定步骤S102所得Smac蛋白二聚拟合物对细胞凋亡抑制蛋白的抑制常数。
具体地，细胞凋亡抑制蛋白为XIAP、c-IAP1或c-IAP2。
将测定在步骤S202中设计并合成的Smac蛋白二聚拟合物对于细胞凋亡抑制蛋白（XIAP、c-IAP1、c-IAP2）的抑制常数（Ki）。二聚拟合物对于各种IAP蛋白的抑制常数将与单体Smac拟合物（如AT-406）的抑制常数相比较，以验证二聚拟合物的设计是否合理，并获得连接臂的构效关系。
步骤S104：测定步骤S102所得Smac蛋白二聚拟合物对肿瘤细胞生长的抑制活性、Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞死亡的生物活性及Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞凋亡的生物活性。
具体地，将测定Smac蛋白二聚拟合物的细胞生物学活性。主要包括：测定Smac蛋白二聚拟合物对于肿瘤细胞生长的抑制活性；测定Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞死亡的生物活性；测定Smac蛋白二聚拟合物诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。在分子生物学层面上比较Smac蛋白二聚拟合物和其相应单体在肿瘤细胞内的作用，解释二聚拟合物具有优良细胞活性的原因。
本发明实施例中的Smac蛋白二聚拟合物可在肿瘤细胞生长的抑制、诱发肿瘤细胞死亡以及诱发肿瘤细胞凋亡中进行应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Smac蛋白二聚拟合物，其特征在于，所述拟合物为具有通式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药：
其中，L是以共价键方式将位置1、2、3或4的甲基与位置1’、2’、3’或4’的甲基连接的连接基。
2.根据权利要求1所述的Smac蛋白二聚拟合物，其特征在于，L由若干个亚甲基组成。
3.根据权利要求1所述的Smac蛋白二聚拟合物，其特征在于，L包括芳香环。
4.根据权利要求1所述的Smac蛋白二聚拟合物，其特征在于，所述拟合物与XIAP的BIR2和BIR3区域同时相互作用。
5.根据权利要求1所述的Smac蛋白二聚拟合物，其特征在于，L连接位置1和位置1’的甲基。
6.根据权利要求1所述的Smac蛋白二聚拟合物，其特征在于，L连接位置1和位置2’的甲基。
7.一种Smac蛋白二聚拟合物的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：用连接基L将两个第一化合物连接形成Smac蛋白二聚拟合物，其中，所述第一化合物为N-(二苯基甲基)十氢-5-[[(2S)-2-(甲基氨基)-1-氧代丙基]氨基]-3-(3-甲基-1-氧代丁基)-6-氧代吡咯并[1,2-A][1,5]二氮杂环辛烷-8-甲酰胺；
步骤2：合成步骤1所得Smac蛋白二聚拟合物；
步骤3：测定步骤2所得Smac蛋白二聚拟合物对细胞凋亡抑制蛋白的抑制常数。
8.根据权利要求7所述的Smac蛋白二聚拟合物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3中的细胞凋亡抑制蛋白为XIAP、c-IAP1或c-IAP2。
9.根据权利要求7所述的Smac蛋白二聚拟合物的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3之后还包括如下步骤：
测定步骤2所得Smac蛋白二聚拟合物对肿瘤细胞生长的抑制活性、Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞死亡的生物活性及Smac蛋白二聚拟合物引发肿瘤细胞凋亡的生物活性。
10.权利要求1至6任一项所述的Smac蛋白二聚拟合物在肿瘤细胞生长的抑制、诱发肿瘤细胞死亡或诱发肿瘤细胞凋亡中的应用。
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