CN104706633A - 欧当归内酯A以及类似物抑制Syk激酶活性的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了欧当归内酯A以及类似物抑制Syk激酶活性的用途，具体地，本发明提供了一种活性成分的用途，所述活性成分为具有式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中，各基团的定义如说明书中所述。所述活性成分用于制备抑制Syk激酶的活性的组合物，或用于制备Syk激酶活性抑制剂。

Description

欧当归内酯A以及类似物抑制Syk激酶活性的用途

技术领域

本发明涉及抗炎和免疫调节药物领域，具体地，本发明涉及欧当归内酯在抑制Syk磷酸化中的用途。

背景技术

藁本内酯(Ligustilide)是伞形科植物当归、川芎的挥发油的主要活性成分。1960年由Mitsuhashi首次从伞形科藁本属植物日本当归Ligusticum acutilobum中分离出来，并命名为ligustilide，分子量190。藁本内酯(结构I)的二聚体显示不同的结构形式(结构II、结构III和结构IV)。欧当归内酯A(Levistolide A，属于结构II)、新当归内酯(Angelicide，属于结构III)是有效成分藁本内酯的不同结构类型的二聚体。

蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一组能催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的酶蛋白，参与许多信号转导途径。脾酪氨酸激酶(Syk)是一个72kDa的非受体型蛋白酪氨酸激酶，在多种细胞中表达，主要是血液细胞、血小板，其他如血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞等。Syk其编码基因为syk，位于人类染色体9q22，Syk mRNA全长2672bp，含1个内含子和2个外显子。syk基因由Taniguchi等于1991年从猪脾cDNA克隆出来，其编码蛋白是一种非受体型酪氨酸激酶，故被命名为脾酪氨酸激酶。Syk包含629个氨基酸残基，分子量为72KD，含有2个串联的SH2结构域及1个酪氨酸激酶结构域SH1。在免疫系统，经由Fc受体和许多C型凝集素刺激，Syk通过SH2区域与依赖酪氨酸的免疫受体活化基序(ITAM)结合而活化。此外，也可以经由多种受体和被多种因子激活，如血管紧张素II(AngII)经由AT1受体、最低限度地氧化低密度脂蛋白(mmLDL)经由TLR4和CD14受体、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)经由TLR4受体、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)经由TNFR受体、血小板衍生生长因子BB(PDGF-β)经由血小板衍生生长因子-β受体等。另一方面，活性Syk还介导ERK1/2、p38MAPK、JNK、NFκB、PI3K-AKT、PLCγ、Stat1/3、炎症复合小体Nlrp3等。

现有的研究已经发现，Syk与多种疾病相关，并有可能成为其潜在的治疗靶点，包括：淋巴瘤、真菌感染、自身免疫性疾病：类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症相关疾病[如哮喘、呼吸道过敏性炎症、过敏性鼻炎、动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)]等等。Syk抑制剂可以在很广泛的范围中得以应用，因此，本领域迫切需要开发有效的Syk抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够抑制Syk激酶活性，并阻断由Syk激酶介导的信号转导通路激活的相关细胞因子的表达的药物。

本发明的第一方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分为具有式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前药，

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地选自下组：氢、OR_a、OCOOR_a、OCONR_aR_b、OSO₂R_a和OSO₃R_a；所述的R_a和R_b各自独立地选自下组：氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30杂芳基；

表示单键或双键；

其特征在于，用于制备抑制Syk激酶的活性的组合物，或用于制备Syk激酶活性抑制剂。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、保健品组合物、或食品组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制Syk激酶磷酸化。

在另一优选例中，所述的组合物中仅含有所述活性成分和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的活性成分包括结构选自下组的二聚体或其药学上可接受的盐：

在另一优选例中，所述的化合物或其二聚体选自下组：洋川芎内酯H(属于结构式I)、洋川芎内酯A(属于结构式I)、藁本内酯(属于结构式I)、欧当归内酯A(属于结构式II)、新当归内酯(属于结构式III)。

在另一优选例中，所述的组合物中，所述的活性成分为欧当归内酯-A，且所述欧当归内酯A的施用浓度为0.00005-50μM，以体系的终浓度计。

在另一优选例中，所述的体系是组合物的作用环境(局部或全身)。

在另一优选例中，所述的作用环境选自下组：血液、体液、培养体系。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制选自下组的炎症因子：IL-1β、TNF-α，或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制选自下组的炎症因子mRNA的表达：IL-1β、TNF-α，或其组合。

在另一优选例中，所述的抑制包括抑制炎症因子的表达和/或活性。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制粘附分子VCAM-1的表达。

在另一优选例中，所述抑制包括抑制粘附分子VCAM-1mRNA的表达。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制趋化因子MCP-1的表达。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制趋化因子MCP-1mRNA的表达。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制单核细胞向血管内皮细胞的粘附。

在另一优选例中，所述的血管内皮细胞选自下组：脐静脉内皮细胞、脑微血管内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、肠微血管内皮细胞、主动脉血管内皮细胞。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制炎症因子和/或粘附分子的表达。

在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制TNF-α，和/或LPS的活性。

在另一优选例中，所述的组合物还用于治疗或预防与Syk激酶活性相关的疾病；较佳地，所述的疾病选自下组：心脑血管疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、血液性疾病和细胞增殖性病症。

在另一优选例中，所述的组合物的用量为1-20mg/kg体重，较佳地为2-15mg/kg体重，以所述活性成分(如欧当归内酯A)的用量计。

在另一优选例中，所述心脑血管疾病选自下组：血栓形成、动脉粥样硬化症、脉管炎、不稳定心绞痛，或急性冠状动脉综合症；

所述炎症性疾病选自下组：细菌性感染、过敏性鼻炎、呼吸道过敏性炎症、支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、不当肥大细胞活化；

所述自身免疫性疾病选自下组：系统性红斑狼疮、多发性硬化症、银屑病、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性血管炎、慢性自身免疫性荨麻疹；

所述血液性疾病选自下组：免疫性血小板减少性紫癜、肝素引起的血小板减少症、镰刀细胞贫血、溶血性贫血；

所述细胞增殖性病症选自下组：非霍奇金氏淋巴瘤(优选地选自慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)和外周T细胞淋巴瘤。

在另一优选例中，所述的活性成分为欧当归内酯A。

在另一优选例中，所述的组合物包括(a)抑制有效量的欧当归内酯-A；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的欧当归内酯A在所述组合物中的重量百分比为0.1-99wt%。

在另一优选例中，所述的组合物的用量为1-20mg/kg体重(每天)，较佳地1-15mg/kg体重(每天)，以欧当归内酯A的用量计。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：注射剂载体、胃溶性载体、肠溶性载体。

本发明的第二方面，提供了一种体外抑制Syk激酶活性的方法，所述方法包括：在体外，将Syk激酶与活性成分接触，从而抑制Syk激酶活性，

其中，所述活性成分包括式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体。

在另一优选例中，所述的活性成分的浓度为0.1-1.0μM，较佳地为0.1-0.5μM。

在另一优选例中，当所述的式I化合物或其二聚体为欧当归内酯A时，所述抑制的IC₅₀值为0.1-0.15μM。

本发明的第三方面，提供了一种非治疗性的抑制Syk激酶活性的方法，所述方法包括对需要抑制的对象施用有效量的Syk激酶抑制剂，所述抑制剂包括式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体。

在另一优选例中，当所述的式I化合物或其二聚体为欧当归内酯A时，所述抑制的IC₅₀值为0.1-0.15μM。

本发明的第四方面，提供了一种抑制Syk激酶活性的组合物，其特征在于，所述组合物包括：(a)抑制有效量的欧当归内酯-A；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物中，所述的欧当归内酯-A的含量为0.1-99wt%。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1欧当归内酯A及其类似物对Syk激酶活性的直接抑制效果；

图2欧当归内酯A浓度依赖性地对Syk酶活性的直接抑制效果；

图3欧当归内酯A对LPS诱导的Syk磷酸化和活化的影响；

图4欧当归内酯A对TNF-α诱导的促炎介质表达的抑制效果；

图5运用siRNA-Syk对SYK的干扰沉默法，验证Syk激酶在阻止LPS-诱导的VCAM-1表达中的作用。证实Syk激酶具有调控促炎介质表达的能力。

各图中，“control”为对照组。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，欧当归内酯-A能够有效地调节Syk激酶的活性，从而调控炎症相关基因的表达。基于上述发现，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“Levistolide A”、“欧当归内酯A”可互换使用，均指化合物6,6’-7,3’二藁本内酯：

6,6’-7,3’二藁本内酯(Levistolide A)

术语“C1-C12烷基”是指具有1-12个碳原子的直链或支链烷基或环烷基，例如甲基、亚甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基，或类似基团。

术语“C2-C12烯基”指具有2-6个碳原子的、具有一个或多个双键的直链或支链的烯基或环烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、环己烯基、环庚烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、或类似基团。

术语“C2-C12炔基”是指具有2-12个碳原子的、具有一个或多个三键的直链或支链的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或类似基团。

术语“C6～C30芳基”指具有6～30个碳原子的芳基，包括单环或二环芳基，例如苯基、萘基，或类似基团。

术语“C1～C30杂芳基”指具有1～30个碳原子的杂芳基，例如吡咯基、吡啶基、呋喃基，或类似基团。

如本文所用，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基(-COOH)、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、氨基。

术语“二聚体”指由两个相同的分子通过物理或化学作用形成的新物质。

术语“互变异构体”指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体，如烯醇与相应的酮。

术语“立体异构体”指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，如顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。

各缩略语的全称如下表所示。

欧当归内酯-A及其类似物

如本文所用，术语“欧当归内酯-A及其类似物”指具有如下式I结构的化合物，或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前药或立体异构体(以欧当归内酯-A为代表)。

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地选自下组：氢、OR_a、OCOOR_a、OCONR_aR_b、OSO₂R_a和OSO₃R_a；所述的R_a和R_b各自独立地选自下组：氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30杂芳基；

表示单键或双键；

其中，所述的二聚体是由两个式I分子共同形成的新物质，优选的二聚体的结构包括：

优选的欧当归内酯-A及其类似物包括：洋川芎内酯H(属于结构式I)、洋川芎内酯A(属于结构式I)、洋川芎内酯I(属于结构式I)、藁本内酯(属于结构式I)、欧当归内酯A(属于结构式II)、新当归内酯(属于结构式III)。具体地，各化合物的结构如下：

1、欧当归内酯A(Levistolide A)：分子式：C₂₄H₂₈O₄；分子量：380.48。

2、新当归内酯(Angelicide)，分子式：C₂₄H₂₈O₄；分子量：380.48。

3、藁本内酯(Ligustilide)，分子式：C₁₂H₁₄O₂；分子量：190.24

4、洋川芎内酯A(Senkyunolide A)，分子式:C₁₂H₁₆O₂；分子量：192.25

5、洋川芎内酯H(Senkyunolide H)，分子式:C₁₂H₁₆O₄；分子量：224.10

6、洋川芎内酯I(Senkyunolide I)，分子式:C₁₂H₁₆O₄；分子量：224.10

欧当归内酯-A的Syk激酶抑制作用

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的细胞壁成分，它是一种在微生物感染导致炎症的过程中常见的病原微生物分子，同时它也是一种典型的炎症刺激物。LPS在CD14的协助下被TLR4/MD-2受体复合物识别并结合，激活炎症信号通路。而Syk激酶通过对TLR4下游信号TRAF6和TRAF3的调节途径调控激活多种炎症信号通路[Lin YC,et al.Sci Signal.2013Aug20;6(289):ra71.]。另一方面，TRAF6和TRAF3也是TNF-α信号的平台蛋白，参与炎症反应[ H,et al.Nat RevImmunol.2011Jun10;11(7):457-68.]。

激酶活性实验(Kinase Assay)的结果显示，在体外Levistolide A可直接抑制Syk激酶的活性，并呈现浓度依赖性，其IC₅₀值为0.129μM(图1和图2)。运用免疫印迹方法，可以发现Levistolide A浓度依赖性地抑制Syk激酶的磷酸化和活化(图3)。这些结果说明，Levistolide A是一个很好的Syk的抑制剂。

研究表明，Levistolide A能够有效的抑制TNF-α诱导的IL-1β、TNF-α、MCP-1、VCAM-1等炎症因子的产生和释放(图4)，并且能够抑制和动脉粥样硬化相关的IL-32β、IL-32γmRNA水平(结果未显示)。

向HUVECs中转染siRNA-Syk特异性的沉默Syk的表达的结果显示，沉默Syk后，Syk的蛋白表达和磷酸化被显著抑制。同时可显著抑制LPS诱导的粘附分子VCAM-1mRNA的表达(图5)，说明了运用分子生物学手段沉默Syk表达起到了欧当归内酯A抑制同样的效果，反证了欧当归内酯A是通过对Syk靶点达到对促炎介质表达的抑制效果。因此，Syk在LPS诱导的炎症中起重要作用。

脾酪氨酸激酶(Syk)相关疾病

1.与免疫系统疾病和炎症的关系

脾酪氨酸激酶(Syk)广泛表达在涉及免疫系统和炎症的细胞中，如B细胞，T细胞，巨噬细胞和滑液成纤维细胞。Syk涉及多链免疫受体的细胞内信号传导，包括B细胞受体(BCR)，ζ链的T细胞受体(TCR)，FcR和结合素类，其中Syk包含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。

Syk激酶参与获得性免疫系统的发展，并已确认在其他类型的细胞，包括血小板，吞噬细胞，成纤维细胞，破骨细胞，及炎性体的生成中发挥重要作用。临床前研究提出令人信服的证据表明Syk的抑制对治疗类风湿关节炎、其他形式的关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血细胞减少症、过敏和自发炎症疾病有治疗价值；临床试验已经在类风湿关节炎，自身免疫性血细胞减少症，和过敏性鼻炎患者的治疗中显示了巨大的成功。

有研究报道[Iwata,S.,et al.,Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi.2012;35(1):56-61.]，Syk的抑制剂fostamatinib在自身免疫性疾病和过敏性疾病中发挥了有效的治疗功效，例如类风湿关节炎(RA)，支气管哮喘和血小板减少性紫癜(ITP)；此外，阻断Syk可阻止狼疮易感小鼠中皮肤和肾脏病变的发展。Syk介导的BCR信号对Toll样受体(TLR)-9的诱导是必需的，允许在人类B细胞中更有效的传播CD40和TLR9信号。这些结果表明，抑制Syk可潜在的调节B细胞介导的炎性疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)。

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者的T细胞显示出明显的表型，其特征在于其过表达及许多粘附和共刺激分子聚类成胆固醇丰富的膜结构域(被称为脂质筏)。此外，T细胞受体复合物与CD3ζ链被FcRγ链取代。FcRγ链招募脾酪氨酸激酶(Syk)，而非ZAP70。由于这些变化，SLE患者T细胞一旦被激活，显示早期和强大的蛋白酪氨酸磷酸化和钙离子内流，使它们能够侵入组织，并对B细胞提供较大帮助。这条途径可以专门针对使用Syk的的抑制剂R788(fostamatinib)，对类风湿关节炎的治疗表现出乐观的结果[Balomenos,D.,R.Rumold and A.N.Theofilopoulos,J Clin Invest,1998.101(2):364-371.]。继在体外实验中，已表明Syk的抑制可正常化SLE患者T细胞钙反应[Krishnan,S.,etal.,J Immunol,2008.181(11):8145-8152.]。因此，其在小鼠狼疮的有效性，也可能是由于抑制单核细胞系细胞，经过处理的小鼠皮肤的CD11c+细胞浸润减少[Kyttaris,V.C.and G.C.Tsokos,Curr Opin Rheumatol,2011.23(5):449-453.]。

Syk的是一种细胞质酪氨酸激酶，参与巨噬细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞上Fcγ受体激活的信号调节。它导致TNFα，IL-6的上调，及MMP合成的增加。因此，Syk激酶抑制剂可能在RA的治疗有一定的作用[Yazici,Y.and A.L.Regens,Bull NYU Hosp Jt Dis,2011.69(3):233-237.]。

2.与动脉粥样硬化的关系

在巨噬细胞中脂质堆积过多，也被称为泡沫细胞形成，在动脉粥样硬化的发展中是一个重要的过程，导致血管炎症和斑块增长。最近的研究发现了一种新的巨噬细胞脂质蓄积的机制，mmLDL及其活性成分胆固醇酯氢过氧化物，参与内源性Toll样受体4(TLR4)的激活，导致syk的招募，诱导细胞骨架重排及巨胞饮(macropinocytosis)。在高脂血症环境中，mmLDL诱导，TLR4和Syk依赖性的巨胞饮导致大量的脂质在巨噬细胞和单核细胞中堆积，这可能是动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的重要机制。一种新型的高胆固醇血症早期的斑马鱼模型动脉粥样硬化的阶段是用来证明，TLR4的缺乏显着地降低了在体内血管病变的巨噬细胞的脂质积累的速率。

Hilgendorf等[Hilgendorf,I.,et al.,Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011.31(9):1991-1999.]的最新研究认为抑制Syk可降低AS的炎症过程，并降低斑块的发展。低密度脂蛋白受体缺陷小鼠进食高胆固醇的饮食，辅以Syk抑制剂fostamatinib16周，结果动脉粥样硬化病变的大小与各自的对照组相比呈剂量依赖性减少到59±6%，同时fostamatinib治疗的动物的病变中含较少的巨噬细胞，由此提示，Syk抑制将作为一个潜在的、卓有成效的抗动脉粥样硬化的治疗策略。

3.与真菌感染的关系

有越来越多对结核分枝杆菌和机体天然免疫细胞之间的相互作用机制的理解。这些细胞表达模式识别受体(PRRS)可以识别结核分枝杆菌病原体相关分子模式(PAMPS)，并可以影响宿主的免疫反应的感染。最近的研究表明Syk/CARD9信号转导通路中分支杆菌的免疫力有关键作用。

在最近的另一项研究中，Werninghaus等[Werninghaus,K.,et al.,J Exp Med,2009.206(1):89-97.]报道分枝杆菌的PAMP，海藻糖基-6,6-二霉菌酸酯(TDM，脐带因子)，和其合成类似物海藻糖6,6-dibehenate(TDB)激活的抗原呈递细胞，巨噬细胞和树突细胞，通过SYK-CARD9途径诱导先天的反应，如NO生产和的细胞因子，如肿瘤坏死因子，IL-1β和IL-6的释放。

真菌感染正在影响越来越多的人。目前的治疗方法在治疗全身性感染发生故障导致在一个高得令人无法接受的死亡率。因此，了解真菌感染的免疫机制有助于辅助免疫治疗的发展。C型凝集素受体(CLRS)模式识别受体(PRRS)对真菌的免疫反应很关键。这些受体被耦合到Syk激酶，它允许这些受体的信号通过CARD9导致NF-κB的活化，这反过来又有助于诱导先天和适应性免疫。研究表明Dectin-1，Dectin-2和Mincle均是CLRs,并已被证明对抗真菌发挥关键作用免疫力。

4.与淋巴瘤的关系

非受体型蛋白酪氨酸激酶Syk在串联SH2结构域与免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)结合后被激活，并在淋巴细胞发育和免疫细胞的活化起着至关重要的作用。Syk对多种蛋白质的酪氨酸磷酸化起关键作用，如Ca(2+)动员、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联。最近的研究结果揭示，Syk表达也参与在各种各样细胞的功能和恶性肿瘤的发病机制。这些研究表明Syk的是一个关键的分子，控制细胞的多种生理功能。

临床上，BCR相关激酶Syk抑制剂等在慢性淋巴细胞白血病的治疗中发挥重要作用。BCRs参与由抗原诱导免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)中的胞质尾的Ig-α和Ig-β磷酸化，随后BCR微簇招募Syk，其次是下游Btk与PI3Ks的激活。磷酸化后，Syk，BtK和PI3Ks传播BCR-源性信号激活下游信号通路，包括钙动员和AKT激酶、ERK1/2和骨髓细胞白血病-1(MCL-1)的激活。

目前淋巴瘤生物学的研究集中在两个领域——淋巴瘤的信号转导通路用于维持恶性淋巴细胞生长及肿瘤微环境在淋巴瘤的生长和生存的作用。审查的重点是三个信号途径：PI3K/mTOR途径，B细胞受体/脾酪氨酸激酶(BCR/Syk)通路和蛋白激酶C-β(PKC-β)通路，对淋巴瘤细胞重要，Syk的抑制剂fostamatinib对治疗弥散性大B-细胞淋巴瘤及慢性淋巴细胞白血病具有显著效果，另外PKC-β的抑制剂enzastaurin被用来作为弥漫性大B细胞淋巴瘤缓解后的巩固疗法。

病人的活组织切片检查对滤泡性淋巴瘤(FL)细胞与非恶性的B细胞进行比较，表明BCR和Syk治疗惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤的有效靶点。BCR通过Syk介导的信号在FL细胞中较肿瘤浸润的非恶性B细胞中发生更迅速，范围更广，持续时间也更久。这表明，BCR信号的增强可能会导致恶性表型的FL。同样地，在套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)细胞系发现，Syk的在DNA水平扩增，在RNA和蛋白质水平过表达。用白皮杉醇(Syk的抑制剂)治疗后，观察到细胞的增殖阻滞和凋亡，并与Syk的过表达的程度相关。抑制BCR及其下游Syk，可作为一种B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHLs)的治疗方法[Staudt,L.M.,N Engl J Med,2007.356(7):741-742.]。

药学上可接受的盐或前药

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与药学上可接受的无机酸和有机酸所形成的盐，无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸。

如本文所用，术语“药学上可接受的前药”指在体外无活性，但能够在生物体内转化为本发明的活性成分（例如式(I)、(II)、(III)或(IV)所示的活性成分），从而发挥其药理作用的化合物。前药指能够在体内通过新陈代谢作用(例如，水解作用)形成本发明的活性成分（如式(I)、(II)、(III)或(IV)所示的活性成分）的化合物。例如，包含羟基的式(I)、(II)、(III)或(IV)化合物的酯，所述的酯能够通过体内水解作用转化为母核。适合的包含羟基的所述式(I)、(II)、(III)或(IV)化合物的酯的优选例如，醋酸酯，柠檬酸酯，乳酸酯，酒石酸酯，丙二酸酯，草酸酯，水杨酸酯，丙酸酯，琥珀酸酯，富马酸酯，马来酸酯，龙胆酸酯，羟乙基磺酸酯、甲基磺酸酯、乙基磺酸酯、苯基磺酸酯、对-甲苯磺酸酯，和奎尼酸酯。

本发明的主要优点包括：

(1)提供了一类Syk激酶活性抑制剂化合物，所述的抑制剂可以在极低浓度(IC₅₀=0.129μM)下抑制Syk激酶的活性，进而抑制炎症反应。

(2)提供了一种防治Syk激酶活性相关疾病的药物组合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

1.实验材料和设备

1.1实验试剂

细胞株：HUVEC细胞株购自美国ATCC公司(HUVEC,CRL-1730)；HEK-293细胞株购自南京永正医疗设备有限公司(BH-HC029)。

抗体：HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogease(GAPDH,KC-5G5)购自上海康成生物有限公司；Goat anti-rabbitIgG-HRP(sc-2004)均购自SANTA CRUZ公司；p-Syk(Tyr323)Antibody，p-Syk(Tyr535/526)Antibody，p-Zap-70(Tyr319)/Syk(Tyr352)Antibody,Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody均购自美国Cell Signaling Technology公司；

试剂盒：Syk Kinase Enzyme System(美国Promega V3801)；ADP-Glo KinaseAssay(美国Promega V9101)；High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits购自Applied Biosystems公司。

试剂:Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司(15596-026)购自AppliedBiosystems公司；RIPA裂解液(弱，P0013D)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型，P0010)；Triton X-100/曲拉通X-100(ST795)、苯甲基磺酰氟PMSF(100mM，ST506)均购自碧云天生物技术研究所；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-巯基乙醇、甘氨酸(Glycine)、Tris碱、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、过硫酸胺(ammonium persulfate，APS)、四甲基乙二胺(tetramethylenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、Tween-20均购自Sigma公司；ECL Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(WBKLS0500)购自Millipore公司；蛋白质转印膜(硝酸纤维素膜，NC膜)购自美国Pall公司；Syk-siRNA(sc-29501)，Control-siRNA(sc-37007)均购自SANTA CRUZ公司；HD Transfection Reagent(E231A)购自美国Promega；细胞转染试剂Lipofectamine2000(美国Invitrogen)；细胞培养基DMEM高糖、DMEM低糖、RPMI1640，FCS，0.25%胰蛋白酶均购自美国GIBCO；氨苄青霉素(A6140)、DMSO购自Sigma；EDTA购自上海生物工程；Tryptone(LP0042)购自OXOID。

1.2实验仪器

CO₂细胞培养箱(HEPA CLASS100，美国Thermo公司)，生物安全柜(Deltaseries,美国Labconco)，细胞培养皿、96孔细胞培养板(美国Corning公司)，全波长扫描式多功能读数仪(Varioskan Flash，Thermo scientific，美国)，GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱、BJ-1CD细菌超净台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，PureYieldTM Plasmid Midiprep System(美国Promega A2492)，倒置相差显微镜(IX71，日本Olympus)，PCR扩增仪(thermocycler，德国Biometra公司)，蛋白质电泳及转印系统(美国BIORAD公司)，QL-901Vortex、LX-100手掌型离心机、LX-200迷你离心机、TS-1型脱色摇床、TS-8转移脱色摇床、TS-8Transference Decoloring Shaker均为江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产，塑料薄膜封口机(FS-200型，温州正雄机械有限公司)，JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，2600C自动X线胶片洗片机，incubator shaker恒温摇床(ZHWY-211B、ZHWY-100B，上海智诚)。

2.实验方法

2.1Syk激酶活性测试

Syk酶活性直接测定参照Syk Kinase Enzyme System(美国PromegaV3801)说明书。

1)分别用缓冲液稀释酶(Syk100ng/μl、底物(Poly(Glu4,Tyr1)0.2μg/μl)、ATP(10μM)，并且加入欧当归内酯A以及类似物(50μM)，或不同浓度的欧当归内酯A(0.00005，0.00025，0.0025，0.025，0.25，2.5，5，25，50μM)。

2)向96孔板中每孔加入:5μl药物(对照组加入5μl溶剂)、10μl酶、10μl底物/ATP混合物。

3)室温孵育60分钟

4)加入25μl ADP-Glo^TM Reagent

5)室温孵育40分钟

6)加入50μl Kinase Detection Reagent

7)室温孵育30分钟

8)在全波长扫描式多功能读数仪(Varioskan Flash，美国Thermo scientific)上每间隔1秒检测其化学发光信号值。

欧当归内酯-A以及结构类似物使用浓度为50μM，或者0.05nM～50μM。结果的图1和图2所示为各类药物或不同程度对Syk酶活性的直接抑制率(%)。其中以欧当归内酯A抑制率最高。N=3。

2.2细胞培养

HUVEC用含有10%FCS的DMEM(低糖)培养基培养于10cm培养皿中，于饱和湿度的含5%CO₂细胞培养箱37℃恒温培养，生长至80%～90%融合时进行传代，PBS洗2遍，0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化约4min，加入含血清的DMEM培养基终止消化，收集细胞，室温800rpm/min，3min离心，弃上清，加入含有10%FCS的培养基，1：3传代培养。取4-8代细胞用于实验。

HEK-293细胞培养方法如上，用含有10%FCS的DMEM(高糖)培养基培养，每皿加入1mL胰酶消化1min离心。细胞冻存液含50%完全培养基、40%FCS、10%DMSO。

2.3蛋白免疫印迹分析

2.3.1总蛋白的提取

1)弃去培养基，每皿细胞加3mL4℃预冷的PBS洗涤细胞，弃去PBS后置于冰上。

2)融解RIPA裂解液，使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，摇匀至于冰上。

3)每100mm皿加入200μL裂解液，于冰上裂解5分钟。

4)用细胞刮刀将细胞刮下，收集到灭菌的1.5mL的离心管中。

5)超声波细胞破碎仪超声破碎，直至充分裂解。

6)4℃，12000rpm/min离心10min，取上清。

2.3.2BCA法测定蛋白浓度

1)配制BCA工作液：根据样品数量，按体积比50：1的比例将BCA试剂A与B配制为适量工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，用PBS稀释至0.5mg/mL的浓度；

2)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，PBS补足到20μL。

3)将蛋白样品适当稀释后加20μL样品到96孔板孔中。

4)各孔加入200μLBCA工作液，于恒温微孔板震荡仪上37℃反应30min。

5)酶标仪测定562nm吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

2.3.3制备SDS-PAGE凝胶电泳蛋白样品

根据蛋白浓度，用PBS调整上样体积、上样总量一致，用4×的loading buffer按照4：1体积加入上样缓冲液，混匀。恒温水浴锅中95℃，5min变性，进行后续SDS-PAGE凝胶电泳分离或储存于-80℃冰箱。

2.3.4Western Blot

1)制胶：SDS-PAGE凝胶根据目的蛋白的分子量制备12%的聚丙烯酰胺分离胶，将配制好的凝胶液体注入玻璃板，无水乙醇200μL封胶，待分离胶凝固后配制并注入4%的浓缩胶，插入1.5mm厚度的10孔梳子。

2)电泳：装好凝胶板，加入1×电泳缓冲液，在凝胶泳道中加入蛋白预染Marker和各组样品，用BIORAD迷你型蛋白质电泳转印系统分离蛋白，从80V开始电泳，50min后转为120V继续电泳至染料接近凝胶底部，停止电泳。

3)转膜：湿转法：把NC膜和4张滤纸及4张纤维垫浸泡在存有转移缓冲液(甲醇20%)的盘中，由下至上按照“2张纤维垫-2层滤纸-凝胶-NC膜-2层滤纸-2层纤维垫”的顺序做好三明治，注意排除气泡，置于转膜槽中，一侧加冰，将整个转膜槽埋于冰盆中，恒流400mA，1h转膜。

4)封闭：将膜浸在含5%脱脂奶粉或5%BSA的封闭液(用TBS-Tween缓冲液溶解)，室温慢摇1h。

5)蛋白质免疫检测：将膜封闭于含有一抗(稀释比例为1：1000)的杂交袋中，置于洗脱摇床上，4℃孵育过夜；第二天，用TBS-T缓冲液快速洗膜8min×3次；再将膜封入HRP偶联的二抗(稀释比例为1：1000)杂交袋中，室温慢摇1h；用TBS-T缓冲液快速洗膜8min×3次。

6)底物化学发光及显影：用纸吸干膜上的水分，平放于保鲜膜上，加ECL(A:B1:1配制)反应2min，用纸吸去多余的ECL，用保鲜膜包好平放于暗盒中，蛋白面向上，暗室内将转印膜对感光胶片曝光，自动洗片机洗片。

7)结果与分析：将胶片扫描，用凝胶分析软件Quantity One计算各条带光密度值，进行统计分析。

2.4siRNA-Syk转染

1.细胞接种于6孔板中，2×105细胞/孔，2mL无抗生素的培养基培养，细胞汇合达到60-80%。

2.用50μl Opti-MEM稀释18μl FuGENE HD Transfection Reagent，用50μlOpti-MEM稀释60pmol siRNA-Syk,用50μl Opti-MEM稀释60pmolsiRNA-Control。

3.将稀释好的siRNA和FuGENE HD Transfection Reagents试剂混合,轻柔混匀，室温放置15min后将混合物加入到细胞培养板中。

4.转染7小时后，更换正常培养基，实验分组：正常对照组，LPS组，siRNA-Syk组，siRNA-Syk+LPS组，LPS终浓度100ng/mL。

2.5数据处理和统计学分析

使用GraphPad Prism5软件或SPSS15.0软件进行数据处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用配对t-检验进行统计学分析，组内比较采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)分析处理，p﹤0.05认为有显著性差异，具有统计学意义。

实验结果

使用Syk活性测定试剂盒测定欧当归内酯A以及类似结构化合物对Syk酶活性的直接抑制效果。SYK酶活性的直接影响测定参照SYK Kinase EnzymeSystem(美国Promega公司)说明书进行。各种欧当归内酯A以及类似结构化合物的使用浓度为50μM。图1显示各类药物对SYK酶活性的直接抑制效果，图A显示测得的发光信号单位(RLU)，图B各类药物对SYK酶活性的显示抑制率(%)。其中以欧当归内酯A抑制率最高。N=3。

在体外使用Syk活性测定试剂盒测定Levistolide A对Syk酶活性的直接抑制效果。图2表明Levistolide A在0.00005-50μM之间浓度依赖性的抑制Syk活性，其IC₅₀值为0.129μM，这说明Levistolide A与Syk激酶在体外直接作用时，较低浓度的Levistolide A即可抑制Syk激酶的活性(N=3)。

图3显示了欧当归内酯A对LPS诱导的Syk磷酸化和活化的影响。脐静脉内皮细胞(HUVEC)在不同剂量的欧当归内酯A预处理1小时，而后用LPS刺激30分钟。用免疫印迹法评价Syk磷酸化、总Syk和GAPDH水平。数据由三个独立实验平均值±标准差。图A显示免疫印迹代表性结果；图B显示SYK总水平变化；图C显示SYK磷酸化结果。结果说明欧当归内酯A浓度依赖性地抑制细胞内SYK的磷酸化和活性。＃P<0.05与药物溶解溶媒比；*P<0.05与单纯LPS处理组比；**P<0.001与单纯LPS处理组比较。

图4显示了欧当归内酯A对TNF-α诱导的促炎介质表达的抑制效果。脐静脉内皮细胞(HUVEC)用欧当归内酯A或药物溶解溶媒前处理60分钟，再用或不用TNF-α(10ng/mL的)持续刺激6小时，其内皮细胞内TNF-α、IL-1β、MCP-1和VCAM-1的mRNA表达量用实时定量RT-PCR测定。数据代表至少三个独立实验的平均值±标准差，＃P<0.05与对照组比较，*P＜0.05与TNF-α比较。

图5显示在血管内皮细胞中，由siRNA-Syk对SYK的干扰沉默阻止LPS-诱导的VCAM-1表达。脐静脉内皮细胞被对照siRNA或siRNA-Syk转染24小时后，再用或不用LPS(100纳克/毫升)刺激24小时，运用实时定量RT-PCR仪测定VCAM-1的mRNA表达水平。数据代表至少有三个独立实验的平均值±标准差，并一式三份进行各实验。*P＜0.05与对照组比较，＃P<0.05为LPS刺激下对照siRNA与siRNA-Syk沉默比较。图5结果表明siRNA-Syk特异性的沉默Syk后，Syk的蛋白表达和磷酸化被显著抑制。同时可显著抑制LPS诱导的粘附分子VCAM-1mRNA的表达，说明了运用分子生物学手段沉默Syk表达起到了欧当归内酯A抑制同样的效果，反证了欧当归内酯A是通过对Syk靶点达到对促炎介质表达的抑制效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种活性成分的用途，所述活性成分为具有式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前药，

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地选自下组：氢、OR_a、OCOOR_a、OCONR_aR_b、OSO₂R_a和OSO₃R_a；所述的R_a和R_b各自独立地选自下组：氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30杂芳基；

表示单键或双键；

其特征在于，用于制备抑制Syk激酶的活性的组合物，或用于制备Syk激酶活性抑制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于抑制选自下组的炎症因子：IL-1β、TNF-α，或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于抑制粘附分子VCAM-1的表达。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于抑制趋化因子MCP-1的表达。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于治疗或预防与Syk激酶活性相关的疾病；较佳地，所述的疾病选自下组：心脑血管疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、血液性疾病和细胞增殖性病症。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，

所述心脑血管疾病选自下组：血栓形成、动脉粥样硬化症、脉管炎、不稳定心绞痛，或急性冠状动脉综合症；

所述炎症性疾病选自下组：细菌性感染、过敏性鼻炎、呼吸道过敏性炎症、支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、不当肥大细胞活化；

所述自身免疫性疾病选自下组：系统性红斑狼疮、多发性硬化症、银屑病、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性血管炎、慢性自身免疫性荨麻疹；

所述血液性疾病选自下组：免疫性血小板减少性紫癜、肝素引起的血小板减少症、镰刀细胞贫血、溶血性贫血；

所述细胞增殖性病症选自非霍奇金氏淋巴瘤(优选地选自慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)和外周T细胞淋巴瘤。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的活性成分为欧当归内酯A。

8.一种体外抑制Syk激酶活性的方法，其特征在于，在体外，将Syk激酶与活性成分接触，从而抑制Syk激酶活性，

其中，所述活性成分包括式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体。

9.一种非治疗性的抑制Syk激酶活性的方法，其特征在于，对需要抑制的对象施用有效量的Syk激酶抑制剂，所述抑制剂包括式I结构的化合物或其二聚体，或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体。

10.一种抑制Syk激酶活性的组合物，其特征在于，所述组合物包括：(a)抑制有效量的欧当归内酯-A；和(b)药学上可接受的载体。