CN104706553A - 一种没药叶细胞提取物的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种没药叶细胞提取物的提取方法及其应用，提取方法包括如下步骤：(1)没药叶烘干并粉碎；(2)酶解：将没药叶、纤维素酶、吐温-80和水混合均匀，在温度为(40-70)℃和真空度为(-0.4)—(-0.8)MPa下反应50-110min；(3)获得的混合物进行过滤和浓缩；(4)提取：采用微波法在微波输出功率为200-500W,频率为3000MHz条件下对浓缩液进行提取，过滤提取液并对滤渣烘干，磨成粉末得到没药叶细胞提取物。本发明提取的没药叶细胞提取物与透明质酸等组成的抗衰老护肤品具有抗衰老、清除自由基等功效。

Description

一种没药叶细胞提取物的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于生物美容领域，具体涉及没药叶细胞提取物的提取方法及其在护肤品中的应用。

背景技术

没药又名末药、明没药、没药、末药、制没药、炙没药、醋炒没药、生没药、生明没药等别称。为橄榄科植物地丁树或哈地丁树的干燥树脂，主产于非洲索马里、埃塞俄比亚以及印度等地。采集由树皮裂缝处渗出的白色油胶树脂，于空气中变成红棕色而坚硬的圆块。打碎后，炒至焦黑色应用。主治胸腹瘀痛、痛经、经闭、症瘕、跌打损伤、痈肿疮疡、肠痈、目赤肿痛。有活血止痛、消肿生肌等功效。在东方是一种活血、化瘀、止痛、健胃的中药，来自产地古代阿拉伯及东非一带。《北史》中即有记载，说是来自西域漕国。在西方，没药是一种据说有神奇疗效的药物。希伯来人将没药树枝制作成各种芳香剂、防腐剂和止痛剂。旧约时期，常被做成油膏，涂抹在伤口，促进伤口愈合。

没药中富含黄酮类化合物。植物黄酮具有消除氧化自由基，抗氧化，抗菌，抗病毒等作用。关于没药叶总黄酮的提取工艺目前暂未见报道，提取没药叶中黄酮类化合物应用于化妆品中也是最新的尝试。

目前暂无关于对没药叶提取类黄酮化合物的方案，但有以下方法可以提取植物的黄酮物质：醇提法、超声波提取法、微波萃取法。其中，醇提法是指利用乙醇的溶解性,将乙醇作为溶剂对物质进行分离提纯的方法；然而本方法提取出来的黄酮得率低、消耗有机溶剂量大而且分离难度高，操作步骤多；超声波提取法是采用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，缩短提取时间，提高提取率，但不易于在工业中广泛生产。微波萃取是利用电磁场的作用使固体或半固体物质中的某些有机物成分与基体有效的分离，并能保持分析对象的原本化合物状态的一种分离方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种更为简单的提取没药叶细胞提取物的方法及将所述没药叶细胞与透明质酸等应用于化妆品中，具有抗衰老和清除自由基等功效。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种没药叶细胞提取物的提取方法，包括如下步骤：

(1)没药叶预处理：没药叶烘干并粉碎；

(2)酶解：将没药叶、纤维素酶、吐温-80和水混合均匀，在温度为(40-70)℃和真空 度为(-0.4)—(-0.8)MPa下反应50-110min；所述没药叶在水中的含量为1-150g/L，纤维素酶在水中的含量为0.1-10g/L，吐温-80在水中的含量为0.4g-50g/L；

(3)过滤与浓缩：将步骤(2)获得的浸提液进行过滤，将浸提液浓缩为浓缩前体积的三分之一以上，得到浓缩液；

(4)提取:采用微波法在微波输出功率为200-500W,频率为3000MHz条件下对浓缩液进行提取，对提取液过滤并烘干滤渣，磨成粉末得到没药叶细胞提取物。

优选的，步骤(1)中没药叶粉碎后过40-60目筛。

优选的，步骤(2)中所述没药叶在水中的含量为10-140g/L，纤维素酶在水中的含量为2-8g/L，吐温-80在水中的含量为2g-40g/L。

优选的，步骤(2)中酶解反应在55℃下反应95min

优选的，没药叶细胞提取物为黄酮。

本发明还提供了一种包含本发明提供的方法提取的没药叶细胞提取物的护肤品，其原料包括如下组分：

丙二醇：1-10份；

没药叶细胞提取物：0.01-5份；

透明质酸：0.01-3份；

POE油醇醚：0.5-1.5份；

尼泊金酯：0.01-0.5份；

维生素B：0.001-0.1份；

维生素E：0.001-0.1份；

羧甲基纤维素：0.5-5份

剩余为水，总量为100份。

优选的，按重量份计包括如下组分：

丙二醇：3-8份；

没药叶细胞提取物：0.05-4份；

透明质酸：0.02-2.5份；

POE油醇醚：0.2-1.2份；

尼泊金酯：0.04-0.45份；

维生素B：0.002-0.08份；

维生素E：0.002-0.08份；

羧甲基纤维素：1-4.5份

剩余为水，总量为100份。

优选的，所述护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼箱、洗面乳。

有益效果

1、简化工艺且操作简便：本发明采用纤维素酶和没药反应，过滤且采用乙醇进行提取的新工艺相对于超声波提取法和微波萃取法提取工艺操作简便；且本发明只有在提取时使用乙醇，且本发明中的乙醇溶液可循环使用，相较于其他方法而言，消耗的有机溶剂少。

2、将没药叶提取物应用于抗衰老护肤品中，从而达到美容效果。

3、本发明包含没药叶提取物的护肤品不仅具有保湿、美白、光滑皮肤的功效，而且还具有抗衰老，去皱的功效。

4、本发明提取率高、节能、省时。与传统酶法比较，本发明提取率高出0.5％；由于整个提取工艺无需使用太多设备设施，主要是没药叶与纤维素酶反应相较于其他工艺具有明显节能的优点；此外，整个提取工艺只需2.5个小时，比传统酶法提取提高了2-2.5个小时。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

①没药的预处理：没药叶子洗净，自然阴干，50℃恒温烘干，粉碎过60目筛；

②混合：称取没药叶10g，放入三角瓶中，加入0.4g吐温-80和0.1g纤维素酶和水，混合溶液共1L，混合均匀搅拌，使没药叶与吐温-80和纤维素酶充分混合；

③酶解：将装有没药叶粉末，吐温-80，纤维素酶的三角瓶放在水浴锅内，水浴温度为70℃，真空度为-0.8MPa酶解反应110min；

④过滤：酶解反应结束后进行减压过滤，将固液混合物转移到滤纸上，打开抽气泵开始抽滤；

⑤浸提液浓缩：进过过滤后，使用旋转薄膜浓缩这个方法，通过反复浓缩，将浸提液浓缩为原来的30％；

⑥提取在微波提取装置的输出功率为200,频率为3000MHz对浓缩液进行提取和过滤，对过滤后得到的滤渣烘干，并磨成粉末得到没药叶细胞提取物。

⑦将黄酮粉末称取10g，加入烧杯中，加入50ml的水混合均匀，移至100ml容量瓶中，定容。

⑧测定黄酮浓度；参照《中国药典2010版》记载的花黄酮类物质含量测定方法为[2]绘制芦丁的标准曲线；以芦丁为对照物，采用硝酸铝显色法在510nm处测定不同质量浓度p(mg/ml)的芦丁吸光度，绘制芦丁标准曲线，总黄酮得率的计算各提取工艺下测得吸光度，代入芦丁标准曲线方程计算出测定液的质量浓度，以下是没药叶总黄酮的得率计算公式:

得率(％)＝

pVn

×100

1000m

式中p为待测定液中黄酮的质量浓度(mg/ml)，V为溶液体积(ml)

n为稀释倍数；m为没药叶的质量(g).

结果分析：按上述方法以吸光度A对质量浓度进行回归，得线性回归方程为p＝0.1061A-0.0024,R2＝0.9966,结果表明在质量浓度为0.01～0.08mg/ml范围内线性关系良好。

⑨进行验证实验：吐温-80在酶法提取没药叶黄酮实际最佳提取率与不加吐温-80的工艺结果如下：

表1 验证实验结果 

⑩结论：吐温-80在纤维素酶提取没药叶中总黄酮类化合物的工艺中产生了显著的增效作用，其提取工艺为吐温-80的质量浓度1.5％，纤维素酶液100ml，温度55℃，浸提1.5h，在此工艺下没药叶黄酮得率为28.77％，该操作简单，用水作提取溶剂降低了成本且本身无毒，得率高。

实施例2

本实施例2提取没药叶提取物的方法基本同实施例1，不同的是：步骤②中称取没药叶150g，放入三角瓶中，加入10g吐温-80和50g纤维素酶和水，混合溶液共1L，混合均匀搅拌，使没药叶与吐温-80和纤维素酶充分混合；步骤③中酶解时在水浴温度为40℃和真空度为-0.4MPa下反应50min,步骤⑥中采用质量分数为75％的乙醇进行提取。

如下为验证从没药叶中提取出来的提取物黄酮具有抗衰老、清除自由基的功效的测试：用雄性昆明种小鼠作动物实验：雄性昆明种小鼠75只，4周龄时购入，实验室自由饮水摄食适应5天，随机分成5组，每组25只。即正常对照组(A)，模型组(B)，小剂量黄酮治疗组(C)，中剂量黄酮治疗组(D)，高剂量黄酮对照组(E).从第六天开始建立模型。5组腹腔注射灭菌生理盐水0.2ml，每天一次，其余4组腹腔注射D-半乳糖溶液0.2ml，每天一次。共腹腔注射8周，各组均以普通饲料喂养，建立模型；考虑腹腔注射对小鼠食道的损伤及本实验维持时间长，在给小鼠黄酮溶液治疗时采用小鼠自由饮用方法；C组(小剂量黄酮治疗组)按照20mg/kg的剂量饮用；D组(中剂量黄酮治疗组)按照100mg/kg的剂量饮用；E组(高剂量黄酮对照组)按照500mg/kg的剂量饮用。

1、如下检测黄酮具有抗衰老的功效：

首先，脂褐素的沉积是衰老的一种标志，其沉积程度与脂质过氧化反应呈正相关；迅速剥取小鼠大脑皮层，按照体积重量比20:1加入氯仿：甲醇混合液2:1，制成组织匀浆， 30000r/min离心8min，取上清液测其荧光强度，以新配置的硫酸奎宁标志液的荧光强度为50，计算每g大脑皮层中所含相当于标准荧光强度的荧光物物微克数，即脂褐素含量；

通过以上动物实验来测定脂褐素含量，其结果如下如表2所示，表2为动物大脑皮层中每g大脑皮层所含脂褐素的量:

表2 每g大脑皮层中所含脂褐素

组别	脂褐素：ug/g大脑皮层
		正常组(A)	27.17±0.62
模型组(B)	27.54±0.93
		小剂量组(C)	25.33±0.81
中剂量组(D)	20.04±1.08
		大剂量组(E)	17.25±1.34

结论：脂褐素的沉积是衰老的一种标志，其沉积程度与脂质过氧化反应呈正相关。脂褐素主要积累在大脑皮层和海马，可破坏细胞磷脂膜结构，导致线粒体和粗面内质网减少以及空泡形成等亚细胞结构的变化，并使神经元数目减少，产生衰老变化。结果表面中剂量和高剂量治疗组的脂褐素含量均明显少于模型组，说明黄酮对脂褐素的沉积有一定左右，黄酮具有抗衰老的作用；

2、超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定：操作过程和SOD酶活计算公式严格按照南京建成超氧化物歧化酶，酶活测定试剂盒说明书；

通过以上动物实验来测定大脑皮层中超氧化物歧化酶(SOD)酶活含量，其结果如下如表3所示，表3为动物大脑皮层中每g大脑皮层所含脂褐素的量:

表3 大脑皮层中超氧化物歧化酶(SOD)酶活

组别	SOD酶活：U/mg prot
		正常组(A)	130.5±26.3
模型组(B)	129.9±25.8
		小剂量组(C)	139.4±40.7
中剂量组(D)	165.3±45.3
		大剂量组(E)	178.2±50.7

SOD是体内清除自由基的相关酶，可以清除H₂O₂及-OH和O₂ ^-，从而保护细胞免受痒自由基损伤。故检测SOD活力高低可以间接反映机体清除自由基保护细胞免受自由基损伤的能力。由SOD的实验结果表面，中剂量和高剂量可提高SOD活力。故黄酮具有清除自由基的能力；作用验证实验使用的黄酮均有没药叶细胞提取出来，故说明没药叶中提取的黄酮具 有抗衰老，清除自由基的能力；运用于化妆品中具有美容功效。

实施例3

按下述重量含量称取各组分，：

丙二醇：10份；

没药叶细胞提取物：5份；

透明质酸：3份；

POE油醇醚：1.5份；

尼泊金酯：0.5份；

维生素B：0.1份；

维生素E：0.1份；

羧甲基纤维素：5份

水:74.8份

其中，没药叶细胞提取物为实施例1制备。

实施例4

按下述重量含量称取各组分，：

丙二醇：1份；

没药叶细胞提取物：0.01份；

透明质酸：0.01份；

POE油醇醚：0.5份；

尼泊金酯：0.01份；

维生素B：0.001份；

维生素E：0.001份；

羧甲基纤维素：0.5份

水:97.97份

其中，没药叶细胞提取物为实施例2制备。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种没药叶细胞提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)没药叶预处理：没药叶烘干并粉碎；

(2)酶解：将没药叶、纤维素酶、吐温-80和水混合均匀，在温度为(40-70)℃和真空度为(-0.4)—(-0.8)MPa下反应50-110min；所述没药叶在水中的含量为1-150g/L，纤维素酶在水中的含量为0.1-10g/L，吐温-80在水中的含量为0.4g-50g/L；

(3)过滤与浓缩：将步骤(2)获得的浸提液进行过滤，将浸提液浓缩为浓缩前体积的三分之一以上，得到浓缩液；

(4)提取:采用微波法在微波输出功率为200-500W,频率为3000MHz条件下对浓缩液进行提取，对提取液过滤并烘干滤渣，磨成粉末得到没药叶细胞提取物。

2.根据权利要求1所述的一种没药叶细胞提取物的提取方法，其特征在于，步骤(1)中没药叶粉碎后过40-60目筛。

3.根据权利要求1所述的一种没药叶细胞提取物的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述没药叶在水中的含量为10-140g/L，纤维素酶在水中的含量为2-8g/L，吐温-80在水中的含量为2g-40g/L。

4.根据权利要求1所述的一种没药叶细胞提取物的提取方法，其特征在于，步骤(2)中酶解反应在55℃下反应95min

5.根据权利要求1所述的一种没药叶细胞提取物的提取方法，其特征在于，没药叶细胞提取物为黄酮。

6.一种包含权利要求1所述的方法提取的没药叶细胞提取物的护肤品，其特征在于，其原料包括如下组分：

丙二醇：1-10份；

没药叶细胞提取物：0.01-5份；

透明质酸：0.01-3份；

POE油醇醚：0.5-1.5份；

尼泊金酯：0.01-0.5份；

维生素B：0.001-0.1份；

维生素E：0.001-0.1份；

羧甲基纤维素：0.5-5份；

剩余为水，总量为100份。

7.根据权利要求6所述的护肤品，其特征在于，按重量份计，包括如下组分：

丙二醇：3-8份；

没药叶细胞提取物：0.05-4份；

透明质酸：0.02-2.5份；

POE油醇醚：0.2-1.2份；

尼泊金酯：0.04-0.45份；

维生素B：0.002-0.08份；

维生素E：0.002-0.08份；

羧甲基纤维素：1-4.5份；

剩余为水，总量为100份。

8.根据权利要求6-7任一项所述的护肤品，其特征在于，所述护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼箱、洗面乳。