CN104698188A - 检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹方法。该斑点印迹方法是将血小板蛋白质配置成统一浓度，样品点于NC膜上，晾干，5％脱脂奶粉封闭，然后分别加入1:1000GSK-3β和Ser9-GSK-3β的一抗，洗脱后加Licor公司标记IRDyeT 800通道的1:10000荧光二抗，洗脱后荧光扫描。该方法依据抗原、抗体结合反应原理，对GSK-3β蛋白活性进行简单快速的定量分析，可用于老年性痴呆的诊断和预防。

Description

检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹方法
技术领域
发明属于生物医药技术领域，具体涉及能检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹方法。
背景技术
糖原合酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase 3,GSK-3)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中。GSK-3是胰岛素依赖性糖原合成的重要调节因子，还能作用于众多信号蛋白结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。
GSK-3主要有两种亚型，即GSK-3α和GSK-3β，分子量分别为51kDa和47kDa，二者在催化区域具有98％的同源性，于N-和C-末端略有不同。尽管GSK-3的两个亚型都参与了神经精神失调，大多数研究集中于其β亚型。GSK-3β磷酸化是研究最多的调节方式。GSK-3β的正调节因子是第216位酪氨酸残基，该位点的磷酸化是GSK-3β活性的基础，该残基高度磷酸化导致GSK-3β在静止细胞的激活。GSK-3β的负调节因子是第9位苏氨酸，该位点磷酸化可导致GSK-3β失活。GSK-3β在脑组织高表达，广泛分布，尤其在海马区域，参与突触可塑性、神经极性、神经炎症和神经稳态调控。临床研究证明，GSK-3β参与阿尔茨海默病等神经退行性疾病、精神分裂症、双向情感障碍等多种神经系统疾病的进程。
动物实验也证实，脑GSK-3β的过度活化与tau蛋白过度磷酸化以及动物的空间记忆损伤呈显著正相关。但对人外周血液中GSK-3β蛋白的活性缺乏理想监测方法。因此，研究对患者血小板中GSK-3β蛋白及酶活表达的检测方法，可望为临床疾病早期筛选、诊断提供科学依据。
发明内容
本发明的任务是提供一种能检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹(Dot-blot)方法。所述的Dot-blot方法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。所述的方法依据抗原、抗体结合反应原理，可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。
实现本发明的具体方案是：
本发明提供的检测人血小板糖原合酶激酶3β蛋白活性的方法，包括以下步骤：
(1)血小板分离与纯化：人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞；取上层成分血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板；血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；
(2)血小板蛋白提取与浓度测定：血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；
(3)血小板蛋白斑点印迹测定：血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上，将NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min，取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的一抗，所述的对应的一抗为含1％BSA的TBS稀释的1:1000GSK-3β和Ser9-GSK-3β，4℃过夜。1×TBST缓冲液洗NC膜3次，每次5min，所述的1×TBST含100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4，接着用双蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司标记IRDyeT 800通道的荧光二抗染料，所述的二抗用含1％BSA的TBS稀释为1:10000的抗体。室温下封膜孵育1h，1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min；双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描、显色，分别测出GSK-3β和Ser9-GSK-3β的灰度值，得到反映GSK-3β活性的Ser9-GSK-3β/GSK-3β比值。
本发明的特点是：建立的血小板GSK-3β蛋白活性的检测方法，操作简单，准确快捷，并可同时检测多个样品，用于半定量分析。所构建的Dot-blot方法检测了血小板GSK-3β蛋白及活性位点的表达，与Western Blot结果基本一致，说明建立的血小板GSK-3β蛋白活性测定是简便、快捷、实用的评估方法。
实验资料
实验名称：斑点印迹法检测的2型糖尿病(T2DM)组、T2DM并MCI患者血小板GSK-3β活性比较
实验方法及步骤：
一、实验方法：①入选标准：年龄>50岁糖尿病患者；无明显影响认知测试的视力、听力障碍；无严重低血糖、糖尿病酮症昏迷、高渗性昏迷病史；无酒精依赖及精神活性物质滥用病史；无脑外伤，无心脑血管事件发生，包括脑梗塞、脑出血、TIA、心肌梗塞等；无影响认知测试的其他严重躯体疾病，如癫痫、甲状腺机能减退症、低氧血症等；无精神病史；自愿参加本研究，能配合检查，依从性好。②研究分组：2型糖尿病无认知功能障碍T2DM组(T2DM)，2型糖尿病并轻度认知功能障碍MCI组(T2DM-MCI)。两组年龄、性别、糖尿病病程、合并高血压比例、合并高脂血症比例、合并冠心病比例、并发症比例(糖尿病周围神经病变、糖尿病血管病变、视网膜病变等)、应用胰岛素治疗比例均匹配。③研究指标：简易智力状态检查量表(MMSE)，Western Blot、Dot Blot检测血小板GSK-3β(Total)、GSK-3β(S9)活性。
二、实验步骤：
①血小板分离与纯化。人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。取上层成分血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板。血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；
②血小板蛋白提取与浓度测定。血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer，所述的2×Buffer为50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；
③血小板蛋白Dot-blot测定。血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上。NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min。取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入1:1000的GSK-3β和Ser9-GSK-3β一抗，4℃过夜。1×TBST缓冲液洗NC膜3×5min，接着用双蒸水清洗掉泡沫。用Licor公司标记IRDyeT 800通道的1:10000荧光二抗染料室温下封膜孵育1h。1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，同样用双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描。
三、实验结果：
(1)T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性
血小板Dot Blot结果显示，糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，但二者GSK-3β总蛋白表达无明显差异,见图1。
(2)血小板GSK-3β的Dot Blot与Western Blot比较
血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，二者比较有统计学意义。但二组GSK-3β总蛋白表达无统计学差异,见图2。
(3)不同患者血小板Dot Blot与Western Blot比较
不同患者血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，见图3。
四、实验结论：糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者较单纯T2DM患者血小板GSK-3β活性增高。斑点印迹Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值可以较好反映GSK-3β蛋白活性，可用于对GSK-3β蛋白活性进行简单快速的定量分析。
附图说明
图1是Dot-blot检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性图，图中显示糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-3β(ser9)/GSK-3β比值较单纯T2DM患者下降，活性增高，说明斑点印迹可以检测GSK-3β蛋白的相对活性。
图2是免疫印迹检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性图，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3β(ser9)/GSK-3β比值较单纯T2DM患者下降，活性增高，说明Dot Blot与免疫印迹结果基本一致，但Dot-blot方法更简单、实用。
图3是Dot-blot、免疫印迹检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性比较图，图中显示不同患者血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，说明Dot Blot可以较好检测GSK-3β蛋白的相对活性。
具体实施方式
实施例1 本发明Dot-blot方法的建立
1.血小板分离与纯化。
1.1 人全血5ml，60g，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。血浆，60g，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板。
1.2 血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱。
2.血小板蛋白提取与浓度测定。
2.1 血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒。
2.2 BCA法测定蛋白浓度。
3.血小板蛋白Dot-blot测定。
3.1 血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上。
3.2 NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30--60min。
3.3 取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的1；1000一抗GSK-3β和Ser9-GSK-3β，4℃过夜。
3.4 1×TBST缓冲液洗NC膜3次，每次5min，接着用双蒸水清洗掉泡沫。
3.5 用Licor公司标记IRDyeT 800通道的1:10000荧光二抗染料温下封膜孵育1h。1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，同样用双蒸水冲洗泡沫。
3.6 荧光扫描。
实施例2
斑点印迹法检测的2型糖尿病(T2DM)组、T2DM并MCI患者血小板GSK-3β活性比较
一、实验方法：①入选标准：年龄>50岁糖尿病患者；无明显影响认知测试的视力、听力障碍；无严重低血糖、糖尿病酮症昏迷、高渗性昏迷病史；无酒精依赖及精神活性物质滥用病史；无脑外伤，无心脑血管事件发生，包括脑梗塞、脑出血、TIA、心肌梗塞等；无影响认知测试的其他严重躯体疾病，如癫痫、甲状腺机能减退症、低氧血症等；无精神病史；自愿参加本研究，能配合检查，依从性好。②研究分组：2型糖尿病无认知功能障碍T2DM组(T2DM)，2型糖尿病并轻度认知功能障碍MCI组(T2DM-MCI)。两组年龄、性别、糖尿病病程、合并高血压比例、合并高脂血症比例、合并冠心病比例、并发症比例(糖尿病周围神经病变、糖尿病血管病变、视网膜病变等)、应用胰岛素治疗比例均匹配。③研究指标：简易智力状态检查量表(MMSE)，Western Blot、Dot Blot检测血小板GSK-3β(Total)、GSK-3β(S9)活性。
二、实验步骤：
①血小板分离与纯化。人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。取上层成分血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板。血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；
②血小板蛋白提取与浓度测定。血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer所述的2×Buffer为50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；
③血小板蛋白Dot-blot测定。血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上。NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min。取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入1:1000的GSK-3β和Ser9-GSK-3β一抗，4℃过夜。1×TBST缓冲液洗NC膜3次，每次5min，接着用双蒸水清洗掉泡沫。用Licor公司标记IRDyeT 800通道1:10000的荧光二抗染料室温下封膜孵育1h。1×TBST缓冲液洗膜3×10min，同样用双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描、显色。
三、实验结果：
(1)T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3β活性
血小板Dot Blot结果显示，糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，但二者GSK-3β总蛋白表达无明显差异,见图1。
(2)血小板GSK-3β的Dot Blot与Western Blot比较
血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3β(ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，二者比较有统计学意义。但二组GSK-3β总蛋白表达无统计学差异,见图2。
(3)不同患者血小板Dot Blot与Western Blot比较
不同患者血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，见图3。
四、实验结论：糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者较单纯T2DM患者血小板GSK-3β活性增高。斑点印迹Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值可以较好反映GSK-3β蛋白活性，可用于对GSK-3β蛋白活性进行简单快速的定量分析。

Claims (1)

1.一种检测人血小板糖原合酶激酶3β蛋白活性的方法，包括以下步骤：
(1)血小板分离与纯化：人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞；取上层成分血浆，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板；血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80℃冰箱；
(2)血小板蛋白提取与浓度测定：血小板加入预冷的裂解液120μl 2×Buffer，所述的2×Buffer由50mM Tris-Cl pH 8.0、1％NP-40、150mM NaCl、0.1％SDS、0.02％NaNR3R、20％甘油、cocktail、1％PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮10min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；
(3)血小板蛋白斑点印迹测定：血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上，将NC膜晾干1-2h后，置于含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min，取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的一抗，所述的对应的一抗为含1％BSA的TBS稀释的1:1000GSK-3β和Ser9-GSK-3β，4℃过夜。1×TBST缓冲液洗NC膜3次，每次5min，所述的1×TBST含100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Tween 20、pH 7.4，接着用双蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司标记IRDyeT 800通道的荧光二抗染料，所述的二抗用含1％BSA的TBS稀释为1:10000的抗体。室温下封膜孵育1h，1×TBST缓冲液洗膜3次，每次10min；双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描、显色，分别测出GSK-3β和Ser9-GSK-3β的灰度值，得到反映GSK-3β活性的Ser9-GSK-3β/GSK-3β比值。
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