CN104694628A - 利用通过多磷酸分解作用(app)反应的活化聚合核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化聚合核酸。本发明涉及使用多磷酸分解试剂三磷酸酯、多磷酸酯、亚氨基二磷酸酯、硫代二磷酸酯(或者单硫代焦磷酸酯)和相关的化合物中的至少一种、通过多磷酸分解(APP)反应进行活化的方法。

Description

利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化聚合核酸
本申请是申请号为201180067423.X，申请日为2011年12月13日，发明名称为“利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化聚合核酸”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求在35U.S.C.§119(e)下，美国临时专利申请号61/422,477(其于2010年12月13日提交，并以其整体通过参考的方式并入本文)的优先权权益。
技术领域
本公开涉及利用在存在改进的多磷酸化试剂的情况下，通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化，进行核酸的聚合方法。
背景技术
本公开涉及核酸(或者核苷酸)的聚合方法，利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化。聚合作用可以使用具有3’-末端以双脱氧核苷酸封闭的引物，在含有焦磷酸酯(PPi)和dNTP平衡的反应混合物中实现。这些方法已经先前在，例如，美国专利号6,534,269B2,7,033,763B2,7,238,480,7,105,298,7,504,221和7,919,253中描述过。相似的方法也在USPN 7,745,125中描述。这些方法也有许多应用，包括存在野生型等位基因时罕见等位基因的检测(例如，在存在106-109野生型等位基因时的一种突变的等位基因)。所述方法对于以下时有用的，例如，检测微小残留病致病剂(例如，在缓解期间罕见的剩余癌细胞，尤其是p53基因或其它先前确定肿瘤内的抑癌基因的突变)，和/或测量突变负荷(例如，出现在正常组织中特定的体细胞突变的频率，如血液或尿液)。这些方法的其他应用对本技术领域的技术人员是已知的。
那些在本技术领域的技术人员的期望进行这种方法的改进方法。已经令人惊讶地发现，其他一些化合物也能够解封闭核酸。本文所述的方法使用各种多磷酸分解试剂(polyphosphorolyzing agent)执行APP反应。从这种改进的方法的下面描述中，这些方法的优点将是显而易见的。
发明内容
本文描述的是利用通过多磷酸分解作用(APP)反应的活化，从测试样品扩增靶核酸的方法。在某些实施方案中，APP使用一种或多种多磷酸分解试剂(polyphosphorolyzing agent)实现。在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以通过公示I代表：
其中n为：例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10或更多。在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以通过公示II代表：
在一些实施方案中，公示II的代表化合物，n和/或m可以相同或者不同。并且n和/或m可以是，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10，条件是n或者m(但不是全部)为0。因此，如果n为0，那么m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10。如果m为0,那么n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10。并且n和m都可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10。在一些实施方案中，n和m都是1。在一些实施方案中，n和m的总和大于或者等于2(例如n>1并且m>1,n>2并且m>0,n>0并且m>2)。在一些实施方案中，其中(但不限于)n+m的总和大于或者等于2,X可以是例如，
在一些实施方案中，其中所述一种或多种多磷酸分解试剂以公式II表示,例如其中(但不限于)n或者m＝0,X可以是,例如,
在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以是:
本文所述的任何多磷酸分解试剂可以与任何其他多磷酸分解试剂(如本文所述的那些)组合。在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可能是焦磷酸酯(Ppi)组合至少一种或多种其他多磷酸分解试剂。任意的所述一种或多种多磷酸分解试剂可以以合适的盐的形式(例如，钠)使用。通常情况下，本文所描述的反应中还可以包括具有多磷酸分解作用活性的酶。在文献(Kornberg,1968),和美国专利号6,534,269B2、7,033,763B2、7,238,480、7,105,298、7,504,221、和7,919,253、7,745,1252(其所有都以其整体通过参考的方式并入此申请)中，已经描述焦磷酸酯作为焦磷酸解反应的底物。APP通常通过以下实施:(a)使核酸与具有可以通过多磷酸分解作用除去的不可延长的3’末端(即，"可激活的")("P*")退火，(b)使用一种或多种多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解作用活性的酶除去所述3'不可延长的末尾，以产生未封闭的寡核苷酸(即，"解封闭")；以及(c)延长所述未封闭的寡核苷酸，以产生所期望的核酸链。在一些实施方案中，公开了用于从封闭的寡核苷酸制备未封闭的寡核苷酸的方法(例如，包括可通过多磷酸分解作用除去的不可延长的3'末端)，所述方法包括使所述封闭的寡核苷酸(例如，当与靶核酸杂交时)与一种或多种多磷酸分解试剂接触。这样的方法通常还包括具有多磷酸分解作用活性的酶。所述酶具有多磷酸分解作用活性，用于本文所描述的任何一种方法，也可以是DNA聚合酶，也可被用于用于延长所述未封闭的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述酶可以具有反转录活性。在一些实施方案中，所述聚合的或者扩增的核酸为脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方案中，所述DNA为人类DNA、抗菌素DNA、质粒DNA或者合成DNA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所期望的核酸链。
这些方法的变化，以及试剂、试剂盒、以及进行这些方法的设备也有提供。本文所述的方法的另外的实施例可能是来自于下面所提供的描述。
附图说明
图1.使用三磷酸酯-催化的APP滴定人类DNA，使用TAPP滴定人类DNA。
图2.比较三磷酸酯-催化的APP与基于SYBR Green I的检测，TAPP(实线)与基于SYBR Green 1检测(虚线)的比较。
图3A,3B和3C.通过Power SYBR从质粒进行的扩增例子。图3A，通过PowerSYBR的质粒模板的扩增，扩增图谱。图3B，通过Power SYBR从质粒进行的扩增，溶解曲线。图3C，通过Power SYBR的质粒模板扩增。
图4A,4B,和4C.从质粒DNA进行三磷酸酯-催化的APP扩增的例子。图4A，来自质粒DNA的三磷酸盐催化的APP扩增，扩增图谱。图4B，4C来自质粒DNA的三磷酸盐催化的APP扩增。
图5.使用PA-10，比较三磷酸酯-和PPi-催化的反应。
图6.三磷酸酯-和PPi-催化的反应示例性的扩增曲线和解离曲线。
图7.以125pg人类DNA输入进行的PPi-催化的反应的解离曲线。
图8.使用PA-17，比较三磷酸酯-和PPi-催化的反应。
图9A线性扩增的动力图谱。图9B使用完美匹配底物和错配底物的三种反应的线性扩增的相对率。
图10.在存在多种浓度的三磷酸盐(TP)情况下，通过Therminator III的线性延伸。
图11.通过RQY，使用Mn++作为辅助因子，ddC-封闭的引物的解封和延伸。
图12A-图12B四磷酸酯-引发的PCR，图12A，扩增曲线；图12B，四磷酸。
图13A-图13B.IDP-引发的PCR；图13A，溴化乙锭琼脂糖凝胶，在UV光下；图13B，IDP。
图14.在常规PCR(填充的)中和在APP PCR(开放)中，具有4-(菱形)、6-(方形)、或者9-(三角形)碱基重叠的引物之间的扩增曲线。
图15.在常规PCR(填充的)中和在APP PCR(开放)中，48引物单独的扩增曲线。
图16A-16D使用APP的数字RCR。
图17A-17D使用传统基于染料的混合物(master mix)的数字RCR。
图18A-18B在使用APP和使用传统基于染料混合物(master mix)的数字PCR中，阴性反应和阳性反应的Ct分布。
具体实施方式
本文描述利用通过多磷酸分解作用(“APP”)反应的活化，从测试样品聚合、扩增、和/或测序靶核酸的方法。多磷酸分解作用涉及在存在一种或多种多磷酸分解试剂和表现多磷酸分解活性(polyphosphorolyzing activity)的酶的情况下，从核酸(例如，寡核苷酸)除去不可延长的核苷酸。APP可以用于聚合和/或扩增和/或测序核酸分子，包括但不限于核糖核酸(例如，RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如，DNA)或其杂合物。本领域的技术人员将很容易理解这里描述的方法的其它用途。
在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以通过公式I表示：
其中n为：例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10或更多。在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以通过公式II表示:
在一些实施方案中表示公式II的化合物，和/或m可以相同或者不同。并且n和/或m可以是，例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，条件是n或m(但不都)是0。因此，如果n为0，那么m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。如果m为0,那么n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施方案中，n和m都是大于或等于1。在一些实施方案中，n和m都是1。在一些实施方案中，所述n+m的总和大于或者等于2(例如,n>1并且m>1,n>2并且m>0,n>0并且m>2)。在一些实施方案中，例如其中(但不限于)n+m的总和大于或者等于2,X可以是,例如，
在一些实施方案中，其中所述一种或多种多磷酸分解试剂以公式II表示,例如其中(但不限于)n或m＝0,X可以是,例如，
例如：
在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以是:
本文描述的任意所述多磷酸分解试剂可以与任意其它多磷酸分解试剂组合。在一些实施方案中，所述一种或多种多磷酸分解试剂可以是焦磷酸酯(PPi)组合至少一种或多种其它多磷酸分解试剂。任意的所述一种或多种多磷酸分解试剂可以以盐(例如钠)的形式使用。通常，本文描述的反应进一步包括一种或多种生物催化剂(例如，具有多磷酸分解作用活性的酶以形成一种或多种核苷三磷酸酯。如上文显示的，例如，亚氨基二磷酸酯(IDP)使用氮连接磷酸部分；相似的二磷酸化合物可以以硫取代氮。在一些实施方案中，多磷酸酯可以是具有两个或多个磷酸部分的任意磷酸酯。在一些实施方案中，多磷酸酯可以是具有三个或多个磷酸部分的任意磷酸酯。
可以在APP中使用的示例性的一种或多种生物催化剂为DNA聚合酶，其在存在本文描述的一种或多种多磷酸分解试剂的情况下，催化核苷三磷酸酯的聚合作用与DNA双链体的多磷酸分解作用。
示例性的DNA聚合酶具有多磷酸分解作用活性，包括但不限于热稳定的Tfl、Taq、和/或经基因方法改造的DNA聚合酶(例如，AMPLITAQFS、THERMOSEQUENASE)，这些具有活性位点突变F667Y或F667Y的等价物(例如Tth)(其表现对作为新来的核苷酸(例如ddNTP的较小Km)对的双脱氧核苷酸改进的亲和力)，在美国专利号7,422,872(其整体通过参考的方式并入本申请)中描述的RQ1，和其突变体(例如，RQY，其中669被酪氨酸取代,其提供RNA的反转录和/或直接测序),THERM IN ATOR I(NEB),THERM IN ATOR II,THERMINATOR III,和/或THERMINATOR GAMMA(所有从NEB获得)等等。这些和其它潜在合适的DNA聚合酶可能在以下文献，例如,美国公开2008/0254525A1,美国公开2007/0020622A 1,美国公开2007/0009924A 1,美国专利号4,889,818,美国专利号4,965,188,美国专利号5,047,342,美国专利号5,079,352,美国专利号5,270,179,美国专利号5,374,553,美国专利号5,436,149,美国专利号5,512,462,美国专利号5,614,365,和/或美国专利号6,228,628B 1中公开，其所有以整体通过参考的方式并入本申请。已经发现，使用这种经基因方法改造的DNA聚合酶可以提高APP的效率。
APP提供了寡核苷酸的延伸，通过将不可延长的寡核苷酸转化成可延长寡核苷酸，延长所述寡核苷酸以制备所期望的核酸链(例如，靶核酸的互补复制本),以及任选地扩增和检测所期望的核酸链。不可延长的核苷酸是指一种核苷酸,其在并入到核酸的过程中阻止所述核酸的进一步延伸，例如通过至少一种生物催化剂(例如酶)。核苷酸可以被一种酶延长，但不被另一种酶延长。对于一种酶不可延长的核苷酸在不同的条件下可以变成可延长的或者部分可延长的。可延长的核苷酸可以是这种核苷酸：至少一种其它核苷酸可以被添加至其上或者通过在所述反应中存在的生物催化剂(例如酶)在所述可延长的核苷酸糖环部分的3'-位点与其共价结合。延伸还可以从核苷酸(其可以具有或者不具有可延长的3'-OH)的2'–OH开始。延长核酸是指将一个或多个核苷酸添加或者并入至或进入给定的核酸中。延长的寡核苷酸通常是这样的寡核苷酸(例如，引物核酸)：一种或多种额外的核苷酸已经添加至其中，或者其它方式并入(例如，与其共价结合)。APP通常使用以下步骤实施：(a)使核酸与具有可以通过多磷酸分解作用除去的不可延长的3’末端(即，"可激活的")("P*")的第一寡核苷酸退火，(b)使用具有多磷酸分解作用活性的多磷酸分解试剂和生物催化剂(即，DNA聚合酶)除去所述3'不可延长的末尾，以产生未封闭的寡核苷酸，以及(c)(c)延长所述未封闭的寡核苷酸，以产生所期望的核酸链。监测所期望核酸链的进步步骤也可以按照下面描述的包括在内。
所述一种或多种多磷酸分解试剂可以以任意合适的浓度包含在所述反应混合物中。例如，合适的浓度可以是大约1-500μM。其它合适的多磷酸分解试剂浓度范围可以包括但不限于大约1-10μM、10-20μΜ、20-30μΜ、30-40μΜ、40-50μΜ、多达50μΜ、50-60μM、60-70μΜ、70-80μΜ、90-100μM、多达100μΜ、100-150μΜ、150-200μΜ、多达200μΜ、200-250μΜ、250-300μΜ、多达300μΜ、300-350μΜ、350-400μΜ、多达400μΜ、400-450μΜ、450-500μΜ。其它合适的多磷酸分解试剂浓度包括但不限于1μΜ、5μΜ、10μΜ、15μΜ、20μΜ、25μΜ、30μΜ、35μΜ、40μΜ、45μΜ、50μΜ、55μΜ、60μΜ、65μΜ、70μΜ、75μΜ、80μΜ；85μΜ、90μΜ、95μΜ、100μΜ、125μΜ、150μΜ、175μΜ、200μΜ、225μΜ、250μΜ、275μΜ、300μΜ、325μΜ、350μΜ、375μΜ、400μΜ、425μΜ、450μΜ、475μΜ、和500μΜ。特别合适的多磷酸分解试剂(s)浓度可以包括但不限于大约25μΜ,40μΜ,50μΜ、和100μΜ,150μΜ,200μΜ和250μΜ。其它合适的多磷酸分解试剂浓度可以是合适的，按照本领域技术人员的理解，并且也可以考虑此处描述的组成部分。
本文所描述的方法可以以任意的多种不同形式实施。在一些实施方案中，所述方法包括连续实施的下面所述的步骤：
(a)使所述模板链与互补可激活的寡核苷酸"P*"退火。
此可激活的寡核苷酸在它的3'末尾具有不可延长的核苷酸。它在它3'末尾处或者其附近没有与在所述模板上的相应核苷酸错配的核苷酸。因此，当所述寡核苷酸P*退火时，所述末端核苷酸与所述模板链杂交。
(b)用至少一种本文描述的多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解作用活性的酶，多磷酸分解所述退火的可激活的寡核苷酸P*。这通过去除所述杂交的末端核苷酸活化所述寡核苷酸P*。
(c)通过在存在4种核苷三磷酸酯和核酸聚合酶的情况下延长在所述模板链上的所述活化的寡核苷酸P*，来使核酸聚合，以合成所期望的核酸链。
所述APP的方法也可被用于扩增所期望的核酸链，通过，例如，加入以下附加步骤：(d)将所述模板链与所述步骤(c)所期望的核酸链分离，以及(e)重复步骤(a)-(d)，直到达到所希望的所需核酸链扩增水平。APP的步骤(a)至(c)，可以按顺序在热循环仪上按照两个或多个温度阶段实施，或者也可以在热循环仪上按照一个温度阶段实施。
如上文所描述的，APP可以用来扩增核酸分子，包括但不限于核糖核酸(例如，RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如，DNA)。在用于扩增DNA时，所述不可延长的、可激活的寡核苷酸P*通常是2'-脱氧寡核苷酸,所述末端的脱氧核苷酸可以是2',3'-双脱氧核苷酸，所述四种核苷三磷酸酯是2'-脱氧核苷三磷酸酯，并且所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。在步骤(c)中使用的所述DNA聚合酶还可以是在所述步骤(b)中使用的、具有多磷酸分解作用活性的所述酶。通过APP的扩增可以是线性的或指数的。当所述可激活的寡核苷酸P*是使用的所述唯一的互补寡核苷酸，获得线性扩增。当存在第二寡核苷酸与所期望的核酸链互补(例如，在PCR中)，获得指数扩增。所述第二寡核苷酸可以是可延长的，或者可激活、不可延长的寡核苷酸。所述可激活的寡核苷酸P*和所述第二寡核苷酸与扩增目标指向的区域侧翼相接。在步骤(a)中，所述第二寡核苷酸退火至步骤(d)的所述分离的期望的核酸链产品。在步骤(c)中，聚合作用延伸了在所述期望的核酸链上的所述第二寡核苷酸，以合成所述核酸模板链的复制本。在步骤(d)中,将所述合成的核酸模板链从所述期望的核酸链分离。然后步骤(a)至(d)可以被重复，知道达到了所期望的指数扩增水平。
在某些实施方案中，所述APP方法用于等位基因-特异的扩增。所述核酸模板链通常是一个等位基因的正义或反义链，并且与所述第二等位基因的相应(正义或反义)核酸链存在于混合物中。所述可激活的(例如，不可延长的)寡核苷酸P*在所述第一等位链的3'末尾附近没有错配，并且在它的3'末尾处或其附近具有至少一个核苷酸与所述第二等位链的相应核苷酸错配。在所述APP方法的步骤(a)中，寡核苷酸P*的所述末端的不可延长的核苷酸不与所述第二等位基因杂交。在所述步骤(b)中，多磷酸分解作用基本没有从退火至所述第二等位基因的所述可激活的寡核苷酸P*删除所述非杂交末端或末端附近的核苷酸。在所述步骤(c)中，因此，所述寡核苷酸P*基本没有被在所述第二等位基因上的聚合作用延长。作为结果，在所述模板链上合成的所述第一等位基因的所述期望的核酸链优先地被扩增(与在所述第二等位基因上合成的任意核酸链上相比)。在一个实施方案中，所述APP方法用于在含有一个或多个野生型等位基因的混合物中指数扩增罕见的、突变的等位基因。所述等位基因的链可以按照下述连续的步骤(a)-(e)分离，以提供单一链的DNA:
(a)使每个等位基因的所述正义或反义链退火互补的可激活的2'-脱氧寡核苷酸P*(在它的3'末尾具有不可延长的2',3'-双脱氧核苷酸)。P*在它的3'末尾处或其附近没有核苷酸与在所述突变链上的相应2'-脱氧核苷酸错配，但是它的3'末尾处或其附近具有至少一个核苷酸与在所述野生型链的相应2'-脱氧核苷酸错配。因此，当所述寡核苷酸P*退火时，所述末端的2',3'-双脱氧核苷酸与所述突变链杂交，但不与所述野生型链杂交。同时，与每个等位基因的所述反平行链(anti-parallelstrand)互补的第二2'-脱氧寡核苷酸退火至所述反平行链。所述可激活的2'-脱氧寡核苷酸P*和所述第二2'-脱氧寡核苷酸在被扩增的基因区域的左右两边。
(b)用至少一种多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解作用活性的酶，多磷酸分解退火至突变链的所述可激活的P*。这将通过除去所述杂合的末端2',3'-双脱氧核苷酸，而激活退火至所述突变链的P*。基本上没有激活退火至所述野生型链的P*，因为未杂化的末端2'，3'-双脱氧核苷酸基本上没有通过磷酸分解作用除去。
(c)在存在四种核苷三磷酸酯和DNA聚合酶的情况下，通过延长在所述突变链上的所述活化的寡核苷酸P*进行聚合作用，同时在突变型和野生型的反平行链上(两者上)延伸所述第二2'-脱氧寡核苷酸。
(d)分离步骤(c)的所述延伸产品；
(e)重复步骤(a)-(d)，知道达到所述突变等位基因的指数扩增的所述期望水平。
所述可激活的P*通常退火至所述等位基因的所述反义链，并且所述第二P*退火至所述正义链，反之亦然。
本文所描述的方法还可以通过实施以下的连续步骤，用于扫描在核酸序列中的未知序列变异，或者用于在核酸中预定序列的重新测序(re-sequencing)：
(a)在杂交条件下，混合所述核酸的模板链和四种可激活的寡核苷酸P*的多个集合(其与所述模板链充分互补)，而与之杂交。在每个集合内，所述寡核苷酸P*在具有不同的3'-末端的不可延长的核苷酸方面彼此不同，使得如果所述模板链与所述3'-末端的不可延长的核苷酸互补时，所述3'-末端的不可延长的核苷酸与所述模板链杂交。集合的数量对应于在所述待询问的序列中核苷酸的数量。
(b)以至少一种本文描述的多磷酸分解试剂和具有多磷酸分解作用活性的酶，处理所述最终双链体，以通过多磷酸分解作用，活化那些具有3'末端不可延长的核苷酸的寡核苷酸P*，其与所述模板链杂交。
(c)在存在四种核苷三磷酸和核酸聚合酶的情况下，通过延长在所述模板上的所述活化的寡核苷酸P*，进行聚合作用。
(d)从所述模板链，分离在步骤(c)中合成的核酸链。
(e)重复步骤(a)-(d)，直到达到扩增的预期水平，以及
(f)重排所述核酸序列，以分析寡核苷酸P*的重叠，其产生扩增。
应当理解，本文描述的特定的方法、反应混合物和/或系统可以变化。本文使用的所述术语目的是仅仅是描述具体的实施方案，而不是为了限制。进一步地，除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与属于本领域的普通技术人员相同的理解。如在本说明书和随附的权利要求书中使用的，所述单数形式“a”、“an”和“the”也包括复数指代，除非在其语境中清楚地提供其它含义。所有的数值范围意在涵盖在所述范围内的每个单个的值，就如同每个被分别地列出(例如，10-20可以包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20中的一个或多个)。就浓度范围而言，这些涵盖了分数范围，例如在10-20之间的所有值，如同每个值被单个地写出(例如10.8、11.5)。所述术语“大约”，当用于修饰一组数值时，意思是应用于每个单个的值，除非另有指出。
“扩增子”通常是指通过复制或转录另一分子制备的分子，例如，发生在转录、克隆和/或在聚合酶链式反应("PCR")中(例如链置换PCR扩增(SDA)，双链体PCR扩增等等)或者其它核酸扩增技术。通常，扩增子是选定核酸或者其部分(例如模板或者靶核酸)的复制本或者与其互补。所述术语在核酸语境中的“扩增”或者“扩增”是指产生多核苷酸、或所述多核苷酸的部分的复制本，通常从小量的所述多核苷酸(例如单一的过核苷酸分子)开始，其中所述扩增产品或扩增子通常是可检测的。已经使用任意的几种方法，来从所述样品扩增所述靶核酸。所述术语“扩增”通常是指在靶核酸中的“指数”增加，本文用来描述包括核酸的选定靶序列的数量的线性和指数增加。所述术语“扩增反应混合物”是指水性液体，包含用于扩增靶核酸的多种试剂。这些包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸和核苷三磷酸酯。根据情况，所述混合物可以是完整的或非完整的扩增反应混合物。本发明用于扩增所述靶核酸，对本领域的技术人员可以是可获得的。任何在体外的方式用于增殖核酸的靶序列的复制本，可以被利用。这些包括线性的、对数的和/任何其它的扩增方法。示例性的方法包括聚合酶链式反应(PCR；参见,例如，美国专利号4,683,202；4,683,195；4,965,188；和/或5,035,996),恒温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参见，例如，WO 2006/081222),链置换(参见，例如美国专利号RE39007E),引物分子的部分破坏(参见，例如，WO2006087574)),连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Wu,et al.,Genomics 4:560-569(1990)和/或Barany,et al.PNASUSA 88:189-193(1991)),QJ RNA复制酶系统(参见，例如，WO/1994/016108),RNA基于转录的系统(例如TAS,3SR),滚环扩增(RCA)(参见，例如，美国专利号5,854,033；美国公开号2004/265897；Lizardi et al.Nat.Genet.19:225-232(1998)；和/或Baner et al.Nucleic Acid Res.,26:5073-5078(1998)),和链置换扩增(SDA)(Little,et al.Clin Chem 45:777-784(1999))等等。许多系统适合于扩增靶核酸，并且被本文考虑，按照本领域技术人员的理解。
已经使用任意几种方法来检测APP-扩增的靶核酸，通过使用多种引物和/或探针。许多不同的试剂、系统和/或可检测的标记可以用于本文所描述的方法。这些包括：例如，系统,可检测的标记-淬灭系统(例如，FRET,水杨酸盐/DTPA配体系统化(参见例如，Oser et al.Angew.Chem.Int.Engl.29(10):1167(1990),置换杂交,同源探针,在EP 070685中分析描述),分子信标(例如，NASBA),Scorpion,锁定核酸(LNA)碱基(Singh,et al.Chem Commum4:455-456(1998)),肽核酸(PNA)探针(Pellestor,et al.European J.Human Gen.12:694-700(2004)),Eclipse探针(Afonina,et al.Biotechniques 32:940-949(2002)),发光探针(Svanvik,et al.Anal Biochem 281:26-35(2001)),分子信标(Tyagi,et al.Nat.Biotechnol.14:303-308(1996)),三重分子信标(Nutiu,et al.Nucleic Acids Res.30:e94(2002)),QuantiProbes(www.qiagen.com),HyBeacons(French,et al.Mol.Cell.Probes 15:363-374(2001)),置换探针(Li,et al.Nucliec Acids Res.30:e5(2002)),HybProbes(Cardullo,et al.PNAS 85:8790-8794(1988)),MGBAlert(www.nanogen.com),Q-PNA(Fiandaca,et al.Genome Res.11:609-611(2001)),Plexor(www.Promega.com),LUX引物(Nazarenko,et al.Nucleic Acids Res.30:e37(2002)),Scorpion引物(Whitcombe,et al.Nat Biotechnol 17:804-807(1999)),AmpliFluor(Sunrise)引物(Nazarenko,et al.Nucleic Acids Res.25:2516-2521(1997)),DzyNA引物(Todd,et al.Clin.Chem.46:625-630(2000))等等。在每个这种检测中，当所述反应在进行是，扩增产物的形成可以监测。检测由所述可检测的标记产生的信号的设备可以被用来检测、测量、和定量所述信号(在扩增之间、期间和/或之后)。所述特定类型的信号可以指示选择检测方法。例如，在一些实施方案中，荧光染料被用于标记探针和/或扩增产物。所述探针结合至单链的和/或双链的扩增产物，和/或所述染料插入到所述双链扩增产物，并且因此，所述最终荧光随着扩增产物增加而增加。在一些实施方案中，通过观察荧光随着所述双链扩增产物解离(dissociate)而降低，并且所述插入的染料从其释放，来确定所述Tm。荧光的所述量可以使用标准设备(例如光谱-荧光计)来定量。其它方法和/或试剂的用途也被本文考虑，按照本领域技术人员所理解的。
扩增和检测靶核酸的一个示例性的方法是商业可获得的，如(参见例如，美国专利号4,889,818；5,079,352；5,210,015；5,436,134；5,487,972；5,658,751；5,210,015；5,487,972；5,538,848；5,618,711；5,677,152；5,723,591；5,773,258；5,789,224；5,801,155；5,804,375；5,876,930；5,994,056；6,030,787；6,084,102；6,127,155；6,171,785；6,214,979；6,258,569；6,814,934；6,821,727；7,141,377和/或7,445,900)。检测的实施通常通过在靶多核苷酸上执行核酸扩增，使用：具有5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能够杂交至所述靶多核苷酸的引物、以及能够杂交至相对于所述引物的所述靶多核苷酸3'的寡核苷酸探针。所述寡核苷酸探针通常包括可检测的标记(例如，荧光报道分子)和能够淬灭所述报道分子荧光的淬灭分子。通常，所述可检测的标记和淬灭分子式单一探针的组成部分。随着扩增进行，所述聚合酶消化所述探针，从所述淬灭分子中分离所述可检测的标记。所述可检测的标记(例如荧光)在反应期间被监测，其中所述标记的检测对应于核酸扩增的发生(例如，所述信号越高，所述扩增的量越大)。检测的变化(例如LNATM spiked检测)对于本领域技术人员是已知的，并且适合于用于本文所描述的方法。
另一示例性的系统在置换杂交方法中利用双链探针(参见，例如Morrison et al.Anal.Biochem.,18:231-244(1989)；和/或Li,et al.Nucleic Acids Res.,30(2,e5)(2002))。在这种方法中，所述探针通常包括两种不同长度的互补的寡核苷酸，其中一个包括可检测的标记，另一个包括淬灭分子。当不与靶核酸结合时，所述淬灭子废止来自所述可检测标记的信号。所述探针在与靶核酸置换杂交后变得可检测。多种探针可以使用，每个含有不同的可检测的标记，使得在单一的反应中可以质询多个靶核酸。
其它用于扩增和检测靶核酸示例性的方法涉及“分子信标”，其为单链发夹状寡核苷酸探针。在靶序列存在下，探头展开，结合并发出信号(例如，发出荧光)。分子信标通常包括至少四个组成部分：1)“环”，与靶序列互补的18-30个核苷酸区域；2)环的任一端上的两个5-7个核苷酸“茎”并且彼此互补；3)在5'端的可检测的标记；以及4)在3'末端的淬灭染料，当探针处于闭合循环形状(例如，没有绑定到靶核酸)时，其防止可检测的标记发射单一。因此，在互补的目标的存在下，信标的所述“茎”部分分离出来从而导致探针与目标杂交。其它类型的分子信标也是已知的，并且可适合用于本文所描述的方法。分子信标可用于各种检测系统。一个这样的系统为核酸序列依赖性扩增(NASBA)，单一步骤等温过程，用于在无温度循环下将RNA扩增为双链DNA。NASBA反应通常需要禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT或AMV)，T7RNA聚合酶，RNase H，以及2个寡核苷酸引物。扩增后，可以使用分子信标检测扩增的靶核酸。分子信标的其它用途在本领域中是已知的，并且适用于本文所描述的方法中。
Scorpion系统是另一种示例性的分析形式，可用于本文所描述的方法。Scorpion引物是双功能分子，其中引物，以及可检测的标记(例如，一个荧光团)和淬灭子共价连接到探针。在靶核酸的存在下，可检测的标记与淬灭子分离，其导致从可检测的标记增加信号的发射。通常情况下，在扩增反应中使用的引物包括：在5'末端的探针元件以及在发夹环起点的“PCR阻断剂”元素(例如，HEG单体)。该探针通常包括自身互补的茎序列与末端的可检测的标记和在另一端的淬灭子。在最初的扩增循环(例如，PCR)中，引物与目标杂交并由于聚合酶的作用而发生扩增。Scorpion系统可被用于使用多个探针来检查和识别点突变，其可能是不同的标记以区分探针之间。利用PCR作为实施例，一个扩展周期完成后，新合成的目标区域将被连接到同一条链作为探针。之后的变性和退火的第二个循环，所述探针和目标杂交。然后，该发夹序列与新产生的PCR产物的一部分杂交。这将导致可检测的标记从淬灭子分离并导致发射信号。在本领域中分子信标的其它用途是已知的，并且适用于在本文中所描述的方法。
一个或多个可检测的标记和/或淬灭子通常连接到寡核苷酸(例如，P*)、引物和/或探针。当游离或当绑定到所述靶核酸时，所述可检测的标记可发出信号。当接近另一个可检测的标记时，所述可检测的标记也可发出信号。可检测的标记也可以与淬灭分子一起使用，使得当不与所述淬灭分子足够接近时，仅可检测到所述信号。例如，在一些实施方案中，检测系统可导致可检测的标记从淬灭分子中解放出来。任何一些可检测的标记可用来标记本文所述方法中使用的引物和探针。如上面提及的，在一些实施方案中，可检测的标记可连接到探针，其可被纳入到引物中，或可能以其它方式结合到扩增的靶核酸(例如，可检测的核酸结合剂，如嵌入或非嵌入染料)。当使用一个以上的可检测的标记时，每个的光谱特性应不同，使的所述标记可相互区别，或使得与可检测的标记一起发出信号，其不单独通过任何可检测的标记发出。示例性的可检测的标记包括，例如，荧光染料或荧光团(例如，可通过光激发发出荧光或磷光的化学基团),"受体染料"能够从荧光供体染料等，淬灭荧光信号。合适的可检测的标记可包括,例如，荧光素类(例如，5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-HAT(羟色胺)；5-羟色胺(HAT)；6-JOE；6-羧基荧光素(6-FAM)；FITC)；Alexa fluors(例如，350,405,430,488,500,514,532,546,555,568,594,610,633,635,647,660,680,700,750)；BODIPY荧光团(例如，492/515,493/503,500/510,505/515,530/550,542/563,558/568,564/570,576/589,581/591,630/650-X,650/665-X,665/676,FL,FL ATP,F1-神经酰胺,R6G SE,TMR,TMR-X缀合物,TMR-X,SE,TR,TR ATP,TR-X SE),香豆素类(例如，7-氨基-4-甲基香豆素,AMC,AMCA,AMCA-S,AMCA-X,ABQ,CPM甲基香豆素,coumarinphalloidin,羟基香豆素,CMFDA,甲氧基香豆素),钙黄绿素,钙黄绿素AM,钙黄绿素蓝,钙染料(例如，钙深红色,钙绿色，钙橙色，荧光增白剂),级联蓝,级联黄；CyTM染料(例如，3,3.18,3.5,5,5.18,5.5,7),青色GFP,环状AMPFluorosensor(FiCRhR),荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如，GFP.EGFP),蓝色荧光蛋白(例如，BFP,EBFP,EBFP2,Azurite,mKalamal),青色荧光蛋白(例如，ECFP,Cerulean,CyPet),黄色荧光蛋白(例如，YFP,Citrine,Venus,YPet),FRET供体/受体对(例如，荧光素/四甲基罗达明(tetramethylrhodamine),lAEDANS/荧光素,EDANS/dabcyl,荧光素/荧光素,BODIPY FL/BODIPY FL,荧光素/QSY7和QSY9),LysoTracker和LysoSensor(例如，LysoTracker Blue DND-22,LysoTrackerBlue-White DPX,LysoTracker Yellow HC-123,LysoTracker Green DND-26,LysoTracker Red DND-99,LysoSensor Blue DND-167,LysoSensor Green DND-189,LysoSensor Green DND-153,LysoSensor Yellow/Blue DND-160,LysoSensorYellow/Blue 10,000MW dextran),Oregon Green(例如，488,488-X,500,514)；若丹明(例如110,123,B,B 200,BB,BG,B extra,5-carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA),5GLD,6-Carboxyrhodamine 6G,Lissamine,Lissamine若丹明B,Phallicidine,Phalloidine,Red,Rhod-2,5-ROX(羧基-X-若丹明),Sulphorhodamine B can C,Sulphorhodamine G Extra,Tetramethylrhodamine(TRITC),WT),Texas Red,Texas Red-X,VIC和其它描述的标记，例如，美国公开号2009/0197254),其中包括那些在本技术领域的技术人员所知的。也可使用其它可检测的标记(见，例如，美国公开号2009/0197254),如将被本领域的那些技术人员已知的。
核酸结合剂也可用于检测使用本文所述方法扩增的核酸。许多合适的可检测的核酸结合剂对于本领域的技术人员是可以获得的，并且可单独或与其它试剂和/或检测系统的组分结合使用。示例性的DNA结合剂可包括,例如，丫啶类(例如，吖啶橙，吖啶黄),放射菌素D(Jain,et al.J.Mol.Biol.68:21(1972)),安曲霉素,BOBOTM-l,BOBOTM-3,BO-PROTM-1,色霉素(cbromomycin),DAPI(Kapuseinski,etal.Nuc.Acids Res.6(112):3519(1979)),柔红霉素，偏端霉素(例如偏端霉素D),美国专利号7,387,887中描述的染料,玫瑰树碱,乙锭盐(例如，溴化乙锭),fluorcoumanin,如在美国专利号4,257,774中描述的荧光嵌入剂,(CambrexBio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.),Hoechst 33258(Searle and Embrey,1990,Nuc.Acids Res.18:3753-3762),Hoechst 33342,homidium,JO-PROTM-1,LIZ染料,LO-PROTM-l,mepacrine,mithramycin,NED染料,纺锤菌素,4'6-diamidino-a-phenylindole,普罗黄素,POPOTM-l,POPOTM-3,PO-PROTM-l,碘化丙啶,钌多吡啶,S5,(美国专利号5,436,134和5,658,751),S YTOX blue,S YTOX green, 噻唑橙(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.),TOTOTM-3,和(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)等等。(见，例如，美国专利号5,436,134；5,658,751；和/或6,569,927),例如，已经用来监测PCR反应(通过在存在染料的情况下扩增靶片段，通过染料吸收的波长的光来激发生物样品，并检测来自其的发射)；并且,测定扩增靶片段的解离曲线。扩增产物的存在以及，因此，在所述样品中的靶序列，然后可被测定，例如，进行解离曲线分析(例如，多个高斯函数的总和的非线性最小二乘法回归)。应当理解的是，使用所述染料，作为实施例提出，并且许多这样的染料可用于本文所述的方法。其它核酸结合剂也可适合，如被本领域的技术人员理解。
在一个多核苷酸与其它多核苷酸(通常是反向平行的多核苷酸)的碱基配对相互作用中，核酸“杂交”或“退火”导致形成双链体或其它较高等级结构，通常被称为杂交复合物。反向平行的多核苷酸之间的主要相互作用通常为具体的碱基，例如，A/T和G/C，通过Watson/Crick和/或Hoogsteen-型相互作用。不要求两个多核苷酸在其整个长度上具有100％的互补性来实现杂交。在一些方面，可从分子间的相互作用来形成杂交复合物，或可选地，可以从分子内相互作用来形成。是由于多种完好特征的力而发生杂交，包括氢键，溶剂排斥，和碱基堆积。可能会在《Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes》，第I部分，第2章，“杂交原丽概述和核酸探针检测策略，”Elsevier(1993年)中发现核酸杂交的广泛指南。
“混合物”是指两种或两种以上不同组分的组合。“反应混合物”是指包含可参与和/或促进给定反应或测定的分子的混合物。为了说明这一点，扩增反应混合物一般包括含有需要进行扩增反应试剂的溶液，并且通常地含有引物、生物催化剂(例如，核酸聚合酶，连接酶，等)，dNTP、和适当缓冲液中的二价金属阳离子。如果其包含了所有必要的试剂来进行该反应，则反应混合物被称为完整的，并且如果其仅包含所述必要试剂的子集合，则反应混合物被称为不完整的。本领域中的技术人员将会理解：反应组分常规存储为单独的溶液，每个都含有全部组分的子集合(出于方便、贮存稳定性的原因)，或允许根据组分浓度调整应用，并且在反应之前反应组分相结合，以创建完整的反应混合物。此外，在本领域的技术人员将会理解：分开包装反应组分用于商品化，并且有用的商业试剂盒可以包含任何反应或测试组件的亚集合，其中包括本发明的生物分子。
“部分”或“基团”是指部分之一，在其中的一些，如分子，或可以被划分(例如，官能团、取代基等等)。例如，本文所述的寡核苷酸，在某些实施方案中包括至少一个供体部分和/或至少一个受体部分。
术语“突变”是指已被相对于其未改变的或天然形式的核酸或编码的蛋白质产物而言，改变了其核酸序列的核酸或核酸编码的蛋白质产物已经在其氨基酸序列内被改变。这样的改变包括，例如，点突变或取代、缺失和插入。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物，或其类似物。这包括核苷酸的聚合物，如RNA和DNA，以及它们的改性形式，肽核酸(肽核酸)，锁定核酸(LNATM)等。在某些实施方案中，核酸可以是聚合物，其中包括多个单体种类，例如，RNA和DNA亚基。核酸可以或可以包括，例如，染色体或染色体片段，载体(例如，表达载体)，表达盒，裸露的DNA或RNA聚合物，聚合酶链式反应(PCR)的产物，寡核苷酸，探针，引物，等。核酸可以是，例如，单链，双链，三链(等)，并不仅限于任何特定的长度。除非另有说明，特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列，除明确表示的任何序列。
核酸不限于具有天然存在的多核苷酸序列或结构,天然存在的骨架,和/或天然存在的核苷酸间键合的分子。例如，核酸含有一个或多个碳环糖，也包括在本定义中(Jenkins et al.(1995)Chem.Soc.Rev.pp 169-176,其通过引用纳入)。为了进一步说明,虽然核酸通常含有磷酸二酯键,在某些情况下，包括核酸类似物，其具有交替的主链。这些可能包括，但不限于，磷酰胺(Beaucage et al.(1993)Tetrahedron49(10):1925and the references therein；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35:3800；Sprinzl et al.(1977)Eur.J.Biochem.81:579；Letsinger et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:3487；Sawai et al.(1984)Chem.Lett.805；Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；and Pauwels et al.(1986)Chemica Scripta 26:1419),硫代磷酸酯(Mag etal.(1991)Nucleic Acids Res.19:1437和美国专利号5,644,048),二硫代磷酸酯(Brillet al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321),O-methylphophoroamiditelinkages(Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,OxfordUniversity Press(1992)),以及肽核酸骨架和联系(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895；Meier et al.(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31:1008；Nielsen(1993)Nature365:566；和Carlsson et al.(1996)Nature 380:207)。其它模拟核酸包括那些带正电的骨架(Denpcy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097)；非离子型的骨架(美国专利号5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English 30:423；Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；Letsinger et al.(1994)Nucleoside&Nucleotide 13:1597；Chapters 2and 3,ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in antisenseResearch",Ed.Y.S.Sanghvi and P.Dan Cook；Mesmaeker et al.(1994)Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395；Jeffs et al.(1994)J.Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖骨架，包括这些在美国专利号5,235,033和5,034,506,以及Chapters 6和7,ASC Symposium Series 580,CarbohydrateModifications in Antisense Research,Ed.Y.S.Sanghvi and P.Dan Cook中描述的,其均通过引用纳入。还在例如，Rawls,C&E News Jun.2,199735页中描述了几种核酸类似物。可以进行核糖-磷酸骨架的修饰，以方便添加额外的部分，如标记的部分，或在生理环境下改变这种分子的稳定性和半衰期。
除了天然存在的杂环碱，其通常在核酸(例如，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)中发现，核酸类似物还包括那些具有非天然存在的杂环或其它修饰的碱基。例如，某些用于核苷酸的碱基，其作为温度改性剂，是任选包括的。示例性的这些有：7-去氮杂嘌呤(例如7-去氮杂鸟嘌呤,7-去氮杂腺嘌呤等等)；吡唑并[3,4-d]嘧啶,丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU,丙炔基-dC,等等)；次黄嘌呤；肌苷；黄嘌呤；2-氨基嘌呤,2,6-二氨基嘌呤,2-氨基-6-氯嘌呤,次黄嘌呤,肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤,鸟嘌呤,2-氨基嘌呤,2,6-二氨基嘌呤,2-氨基-6-氯嘌呤,次黄嘌呤,肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞苷；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-propynylcytosine；5-bromovinyluracil；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-methoxymethyluracil；5-乙炔尿嘧啶；5-propynyluracil；非天然存在的碱基，如所描述的，例如，Seela et al.((1991)Helv.Chim.Acta 74:1790；(1999)Helv.Chim.Acta 82:1640)；Grein et al.((1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.4:971-976),美国专利号5,484,908,5,645,985,5,990,303,5,830,653,6,639,059,6,303,315,美国专利申请号2003/0092905等等。
“核苷”通常是指核酸组分，其包括碱基或碱性基团(例如，包含至少有一个碳环，其中至少一个杂环，至少一个芳基，等等)共价连接到糖部分(例如，核糖等)，糖部分的衍生物，或糖部分的功能等同物(例如，类似物，如碳环)。例如，当核苷包括糖部分，碱基通常是连接到该糖部分的1'位置。如上所述，碱可以自然生成(例如，嘌呤碱，如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，嘧啶碱，如胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，或尿嘧啶(U))，或者非天然生成(例如，7-脱氮嘌呤基，吡唑并[3,4-d〕嘧啶碱，丙炔基-dN碱，等等)。示例性的核苷包括核糖核苷，脱氧核糖核苷，双脱氧核糖核苷，碳环核苷，等等。“核苷酸”是指核苷的酯，例如，核苷的磷酸酯。为了说明，核苷酸可以包括1，2，3，或多个磷酸基团共价连接到核苷糖部分的5'位置。核苷三磷酸酯和2'-脱氧核苷三磷酸酯或它们的化学修饰的形式可被用作底物，用于通过APP的多核苷酸延伸，其中，例如，一个核苷酸结合到延伸链可以进一步延伸。2',3'-双脱氧核苷三磷酸酯，其化学修饰的形式，或其它合适的化合物(例如，如US 2005/0037398A1中，acycloNMP)可被用作为终止子，用于单核苷酸延伸的进一步延伸。2'-终止的NTP进一步的实施例在USPN 7,745,125B2中描述，其全部内容通过引用纳入。2',3'-双脱氧核苷三磷酸酯可能被标记上放射性或荧光染料，以与寡核苷酸P*的3'端双脱氧核苷酸区分。也可以使用核苷三磷酸酯或2'-脱氧核苷三磷酸酯混合物，和2',3'-双脱氧核苷三磷酸酯
“核苷酸结合的生物催化剂”是指催化剂，其催化核苷酸掺入到核酸。核苷酸结合的生物催化剂是典型的酶。“酶”是蛋白质-和/或基于核酸的催化剂，其起到减少涉及其它化合物或“底物”的化学反应的活化能的作用。“核苷酸结合酶”是指酶，其催化核苷酸掺入到核酸，例如，在核酸扩增，等过程中。示例性的核苷酸结合酶包括，例如，聚合酶，末端转移酶，逆转录酶(例如，上述RQY聚合酶)，端粒酶，多核苷酸磷酸化酶，等。“热稳定的酶”是指对热稳定的酶，具有耐热性，并进行对选定时间内的温度升高时保持足够的催化活性。例如，当选定时间内的温度升高影响到双链核酸变性时，热稳定的聚合酶保持足够的活性以实现随后的引物延伸反应。加热条件是核酸变性所必需的，这在本技术领域的技术人员是公知的，并在示例性的，例如，美国专利号4,683,202,4,683,195和4,965,188中。为了进一步说明，“热稳定的聚合酶”是指酶，它是适合使用于在温度循环反应中，如聚合酶链式反应(“PCR”)。对于热稳定的聚合酶，酶活性是指以合适的方式催化核苷酸组合，以形成与模板核酸互补的引物延伸产物。本文所述的示例性的热稳定的聚合酶，以及其它适用于本领域技术人员的，也可能是合适的。
“寡核苷酸”是指包括至少两个核酸单体单元(例如，核苷酸)的核酸，通常超过3个单体单元，更通常地超过10个单体单元。寡核苷酸的确切大小一般取决于各种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。通常情况下，核苷单体被磷酸二酯键或其类似物连接，包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，phosphoroselenoate，phosphorodiselenoate，phosphoroanilothioate，phosphoranilidate，氨基磷酸酯等，包括相关联的抗衡离子，例如H+,NH,Na+，等，如果这种抗衡离子存在的话。通常情况下，P*的3'末端连接为磷酸二酯键。寡核苷酸可以通过任何合适的方法来制备，包括，但不限于，分离现有的或天然的序列，DNA复制或扩增，反转录，克隆和限制性酶切合适的序列，或通过方法直接化学合成，如磷酸三酯法，Narang etal.((1979)Meth.Enzymol.68:90-99)；磷酸二酯法，Brown et al.((1979)Meth.Enzymol.68:109-151)；二乙基亚磷酰胺法，Beaucage et al.((1981)Tetrahedron Lett.22:1859-1862)；三酯法，Matteucci et al.((1981)J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191)；自动合成法；或在美国专利号4,458,066中描述的固体支持物法，和/或本领域技术人员已知的其它方法。
如上所述，“P*”代表寡核苷酸，具有不可延伸的3'端(“P*”)是可通过多磷酸水解作用去除的。P*寡核苷酸也可被称为“活化”，其除去不可延伸的3'端，呈现寡核苷酸适合于聚合反应(例如，“活化P*”)。P*寡核苷酸不可延伸的3'端可能是双脱氧核苷酸，acyclonuclotide，具有3'-羟基的终止子，但2'修饰以体积较大的分子，以防止从3'-OH延伸(例如，US 2007/0154914A1)，或“虚拟”末端，碱基上具有修改，以防止通过AmpliTaqFS从3'OH延伸(Wu,et al Nucleic Acid Research,35(19):6339-6349(2007))。也可考虑其它形式的P*，并且可以在本文所述的方法中使用，如将被本领域的技术人员理解。
“引物核酸”或“引物”是核酸，其可以与目标或模板核酸杂交，并允许链延伸或在适当的反应条件下，使用例如，核苷酸结合的生物催化剂，如聚合酶伸长。引物核酸是典型的天然或人工合成的寡核苷酸(例如，单链寡脱氧核苷酸)。虽然其它引物核酸长度是可任选使用的，但它们通常包括范围从约8至约100核苷酸长度的杂交区域。较短的引物核酸一般要求较低的温度，以形成足够稳定的杂交复合物与模板核酸。引物核酸，其至少部分地与模板核酸的子序列互补，通常是足够的与模板杂交以进行延伸。如果需要的话，通过引入如本文所述的可检测的标记，可对引物核酸进行标记。
术语“核酸探针”或“探针”是指标记或未标记的寡核苷酸，在适当的条件下其能够选择性地与目标或模板核酸杂交。通常，探针与核酸样本中包含的特定的靶序列充分互补，选定的杂交条件下，与靶序列形成稳定的杂交双链体。在足够严格的杂交条件下，使用探针进行杂交检测，允许选择性地检测特定的靶序列。术语“杂交区域”，是指是完全或实质上互补的核酸区域，因此，能够与靶序列杂交。使用杂交检测用于鉴别序列中的单核苷酸差异，杂交区域通常是约8至约100个核苷酸的长度。尽管杂交区一般指的是整个的寡核苷酸，探针可以包括附加的核苷酸序列的功能，例如，作为连接器的结合位点，以提供位点，用于将探针序列连接到固体支持物。本发明的探针一般可以包括在核酸中，其包含一个或多个标记(例如，供体部分，受体部分，和/或猝灭部分)，如5'-核酸酶探针，杂交探针，荧光共振能量转移(FRET)探针，发夹探针，或分子信标，其也可以被用来检测样品中探针与靶核酸之间的杂交。在一些实施方案中，探针的杂交区域与靶序列完全互补。然而，在一般情况中，没有必要完全互补(例如，核酸可部分彼此互补)；稳定的杂交复合物可含有错配碱基或不匹配的碱基。修改严格的条件可能是必要的，允许稳定的杂交复合物具一个或多个碱基对不匹配或不匹配的碱基。Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)提供了合适的修改指导。目标/探针杂交复合物的稳定性取决于一些变量，包括寡核苷酸的长度，碱基组合物和寡核苷酸的序列，温度和离子条件。在本技术领域的一名技术人员将认识到，在一般情况下，给定探针的完全互补作为探针同样是有用的。在本技术领域的技术人员也将认识到，在某些实施方案中，探针核酸也可用作为引物核酸。
本文描述的方法可能是有用的，用于从试验样品检测和/或定量多种靶核酸。靶核酸是任何核酸，对于其设计检测系统以识别或检测存在(或不)，和/或量化测试样品。这样的核酸可包括，例如，传染性病原体(如，病毒，细菌，寄生虫，等)，疾病过程，如癌症，糖尿病，等，或测量免疫应答。示例性的“试验样品”包括各种类型的样品，如生物样品。示例性的生物样品包括，例如，体液(如，血液，唾液或脊髓液)，组织样品，食物(如，肉)或饮料(如，牛奶)的产物，等。表达的核酸可包括，例如，基因，其表达(或缺乏)与医疗条件相关，例如感染性疾病(例如，细菌，病毒，真菌，原虫感染)或癌症。本文所述的方法也可被用于检测制药，食品或饮料产品中的污染物(如，细菌，病毒，真菌和/或原生动物)。本文所述的方法也可被用来检测存在于野生型等位基因中的稀有等位基因(如，存在于106-109个野生型等位基因中的一个突变等位基因)。该方法是有用的，例如，检测微小残留疾病(如，在缓解期中稀有的剩余癌细胞，特别是p53基因中的突变或先前在肿瘤内确定的其他肿瘤抑制基因)，和/或测量突变负载(如，存在于正常组织中，如血液或尿液，特定的体细胞突变频率)。
还提供了用于进行本文所述方法的试剂盒。试剂盒通常包括至少一对寡核苷酸(例如，至少一对为P*寡核苷酸)，用于从样品中扩增至少一个靶核酸，本文中描述的一个或多个多磷酸分解试剂，生物催化剂(如，DNA聚合酶)和/或相应的一个或多个探针，标记以可检测的标记。该试剂盒还可以包括预先定义的样品中含有靶核酸的对照反应中要使用。该试剂盒也可任选包括储备溶液，缓冲液，酶，可检测的标记，或检测，管，膜，等所需的试剂，其可用于完成扩增反应。在一些实施方案中，多个引物组包括在内。也可以设想特定系统和试剂盒的其它实施方案，其将被本技术领域的技术人员理解。
在下面的实施例中将进一步地描述某些实施方案。仅作为实施例来提供这些实施方案，并且不打算以任何方式进行限制所述权利要求的范围。在本申请中引用的所有文献，其全部内容通过引用纳入本申请。
实施例
实施例1
用三磷酸酯滴定人类DNA
在存在与不存在人类基因组DNA下，对人类DNA模板进行滴定。图1显示了在250ng，25ng，2.5ng，250pg和25pg的人类DNA以及无模板对照(TC)(测试非特异性扩增)的存在下的扩增曲线。这些数据表明，使用三磷酸酯-催化的反应可以实现基于染料的扩增检测。使用ABI7900序列检测系统，温度如下进行反应：95℃下进行3秒，50个循环，然后65℃下进行60秒。每个20μl的反应中含有：50mMTris(pH8.25)，1X EvaGreen，31μΜdNTPs，3mMgCl2，60mMCl2，Tween0.1％，40μΜ三磷酸酯(三磷酸五钠，Sigma-Aldrichcat.No.72061)，每100μl反应10pg/μl TaqFY突变体DNA聚合酶10A，500nM PA-1F(5'-CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCTAA(ddC)-3'；SEQIDNO.:1)，500nMPA-1R(5'-GGGAGAAAAAAGCCAACCTTAATG(ddC)-3'SEQIDNO.:2)，和指定浓度的人类DNA(Cat.No.#403062，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。
实施例2
使用Power SYBR滴定人类DNA
存在和不存在人类基因组DNA情况下，用ABIPowerSYBR对人类DNA模板进行滴定。图2显示了在250ng，25ng，2.5ng，250pg，和25pg的人类DNA以及无模板对照(NTC)(测试非特异性扩增)存在情况下，使用PowerSYBR(虚线)的扩增曲线与实施例1中所描述的三磷酸酯-催化的反应(实线)进行比较。这些数据表明，三磷酸酯-催化的反应可提供更好的CT和/或信号强度。使用ABI7900序列检测系统，温度如下进行SYBRGreen反应：95℃进行3秒，50个循环，然后60℃下进行60秒。每个20μl的反应中含有：1XPowerSYBR master mix(Cat.No.#4385372，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)，500nM PA-1F(5-CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCTAAC-3'；SEQIDNO.:1)，500nM PA-1R(5'-GGGAGAAAAAAGCCAACCTTAATGC-3'SEQIDNO.:2)，和指定浓度的人类DNA(Cat.No.#403062，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。
实施例3
通过Power SYBR扩增质粒模板
用ABI的Fast SYBR进行质粒DNA的滴定。结果显示，所述master mix没有得到特定的产物。图3A-C显示了，在1μl未稀释的质粒prep(迹线1)，10倍稀释的质粒prep(迹线2)，100倍稀释质粒prep(迹线3)，1000倍稀释的质粒prep(迹线4)，和NTC(迹线5)存在下，使用Fast SYBR的扩增曲线，如随后进行热曲线描述，如在实施例1中所描述的。解离曲线在图3B中所示，其中迹线6，7，8，9和10分别对应与图3A迹线1-5表示的扩增。图3C示出了PCR反应的琼脂糖凝胶电泳图像，通过迹线1(泳道7C1)和5(泳道7C2)显示。使用ABI7900序列检测系统，温度如下进行Fast SYBR反应：95℃进行3秒，40个循环，然后60℃下进行60秒。每个20μl的反应中含有：1XFast SYBR master mix，500nM vD-引物：TGCAATACCGTGAGCTGACCC(SEQ ID NO.:3),500nM v l 699LR引物：GTCTGGTTGAAACGAGTGTGCAGGC(SEQ ID NO.:4)，以及约一千万拷贝的p540D质粒DNA(基于pUC的质粒含有插入序列SEQ ID NO：7)。从质粒540D扩增的序列为：
TGCAATACCGTGAGCTGACCCgtctgcgttcgacctacatcgacccactgccggacctgattcatccacgtaccggcc GCCTGCACACTCGTTTCAACCAGAC(SEQ ID NO.:5)(引物结合在大写的序列处)。
实施例4
来自质粒DNA的三磷酸酯-催化的APP扩增
与实施例3中描述的SYBRGreenI的反应对比，使用ddC-终止的引物对上述质粒DNA(p540D)进行三磷酸酯-催化的扩增，得到特定的产物。更具体地，用于反应的ddC终止引物为TGCAATACCGTGAGCTGACC(ddC)(D引物，SEQID NO.:3)和GTCTGGTTGAAACGAGTGTGCAGG(ddC)(1699LR引物，SEQID NO.:4)。每20μl反应中含有50mM的Tris(pH值8)，1XEvaGreen，31μΜdNTP，2.5mM MgCb，Tween0.1％，50μΜ的三磷酸酯，每100μl反应10pg/μl10A(F667Y突变的Taq DNA聚合酶)，500nM D-引物，500nM 1699LR引物，以及约一千万拷贝的p540D质粒DNA。使用ABI7900序列检测系统，温度如下进行三磷酸酯-催化的反应：95℃进行3秒，40个循环，然后65℃下进行60秒。结果分别示于图4A-C中。通过质粒DNA的扩增曲线由图4A中的迹线11所示，以及解离曲线由图4B中的迹线13所示。通过所述反应所产生的特定产物由图4C中的琼脂糖凝胶电泳的泳道8C1所示。结果表明，三磷酸酯-催化的反应比Power SYBRPCR产物(例如，如图3A-C中所示)更特异和严格。
实施例5
比较三磷酸酯-催化的反应和PPi-催化的反应。
通过使用引物PA-10F(GCATAGCAGTCCCCAAGAATGA(ddC)；SEQ ID NO.:6)和PA10R(CGGTTCCCACGAAAAGCAAC(ddC)；SEQ ID NO.:7)，滴定人类DNA，对三磷酸酯和焦磷酸之间进行比较。设计这些引物从人类的DNA模板来产生127bp的扩增子。每20μl三磷酸酯-催化的反应含有：50mM Tris(pH值8)；1X EvaGreen；31uM dNTP；2.5mM MgCl2；Tween 0.1％；25,50,100,或150uM三磷酸酯；每100uL反应10pg/μl 10A；500nM PA-10F；500nM PA-10R和125ng、12.5ng、1.25ng、125pg,或0ng的人类DNA。除了PPi用来代替三磷酸酯外，PPi催化的反应作为三磷酸酯-反应的设计相同。使用ABI 7900序列检测系统，温度如下进行滴定反应：95℃进行3秒，40个循环，然后60℃，60秒。PCR扩增后进行解离分析。在图5中绘制了使用各种浓度的PPi和三磷酸酯的CT滴定。PPi在100μΜ和150μΜ浓度表现抑制，而在任意这些测试浓度下三磷酸酯没有表现出显著的抑制作用。在图6A/C和6B/D/E中分别显示了50μΜ三磷酸酯和50μΜPPi的扩增曲线。三磷酸酯反应(图6C)的解离曲线表明，所有产物为清洁产物。与此相反，1.25ng人类DNA(图6E)和125pg人类DNA(图6F)的PPi反应的解离曲线，除了特异性峰值外表现出非特异性的峰。应当指出的是，在测试的PPi浓度中，50μΜPPi得到了最有效的反应。然而，在低输入DNA下，这种浓缩得到非特异性反应。在25μΜPPi下，输入125pg人类DNA(图7)，观察到非特异性产物。另一方面，当输入低浓度的DNA时，100μΜ和150μM PPi极大地抑制扩增。对于这种扩增，PPi并没有表现出最佳的浓度，该浓度的反应是高效而特异的。
实施例6
比较三磷酸酯-催化的反应和PPi-催化的反应。
通过使用引物PA-17F(GCTCCAG ACAGAAACACCGTA(ddC)；SEQ ID NO.:8)和PA-17R(CCATAACCAGACTCAGCAGAGAA(ddC)；SEQ ID NO.:9)，滴定人类DNA，对三磷酸酯和焦磷酸之间进行比较。设计这些引物从人类的DNA模板来产生108bp的扩增子。进行三磷酸酯-反应和PPi反应，如实施例5所描述的反应。图8中显示了在各种PPi和三磷酸酯浓度下，CT的滴定。PPi展现出的抑制浓度为100μΜ和50μΜ，在低输入DNA下，失败的反应表明的，而在这些测试的浓度下，三磷酸酯没有表现出显著的抑制。
实施例7
比较三磷酸酯-催化的反应和PPi-催化的反应。
线性扩增是比较反应速率的方便方式。本文，我们采用荧光底物，一旦他们从部分双链体转换成基本上全双链体，其产生荧光信号。这个例子表明，三磷酸酯-启动的解封比PPi-启动的解封反应更为严格。
制作本实施例中的四个底物，详述如下：
(1)引物vPAlF(5'-CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCTAAC-3'；SEQ ID NO.:1)允许退火到PAPbttm(5'-/TAM/C AGCGTGTGGT ATGCG/F AM-dT/CGACGTTAGGCAA AACACAAACCAGGATG-3'；SEQ ID NO.:10)以形成双链体，如下列vSub(PM)所示:
(2)类似地,引物vPAl(msl)F(5'-CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCTAAT-3'；SEQID NO.:11)允许退火到PAPbttm以形成双链体，如下列vSub(ms-l)所示:
(3)类似地,引物PA IF(5'-CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCTAA/ddC/-3'；SEQ IDNO.:1)允许退火到PAPbttm以形成双链体，如下列Sub(PM)所示:
(4)类似地，引物PA IF允许退火到PAPbttm-T(5'-/TAM/CAGCGTGTGGTATGCG/FA-.dT/CG ACTTTAGGCAAAACAC AAACCAGGATG-3'；SEQ ID NO.:12)以形成双链体，如下列Sub(ms-1)所示:
在vSub(PM)和vSub(ms-l)中的引物是不封闭的。两个底物用于常规反应。在Sub(PM)和Sub(ms-1)中的引物是封闭的。两个底物用于线性反应，其参与解封闭和延伸，称为偶联反应。
每个线性扩增试验含有50mM Tris,pH 8(Teknova,Hollister,Ca),2.5mMMgCl2(ABI,Foster City,California),0.1％Tween 20(Thermo Fisher,Rockford,IL),0.25mM总dNTP(ABI,Foster City,California),500nM底物,约1uM的ROX(Molecular Probes,Eugene,Or),150μΜ三多磷酸酯(Cat#T5633,Sigma-Aldrich,St,Louis,Mo)用于三磷酸酯反应或30μΜ焦磷酸酯用于PPi-反应,以及没有三磷酸酯或PPi用于香草反应(vanilla reaction)，并且16.76pg/μl 10A用于香草反应或1.47ng/μL·10A用于三磷酸酯-或PPi-启动的反应。三磷酸酯-启动的反应以Sub(PM)和Sub(ms-1)的所述反应时间进程，示于图9A中。
在图9B中，载列了反应相关的反应速率，相对于以其各自完全匹配底物获得的速率。对于所述香草反应的速率，使用vSub(ms-l)得到的速率为使用vSub(PM)得到的速率的28％。与此相反，对于偶联反应，使用Sub(ms-l)得到的速率为使用Sub(PM)得到的速率的0.98％，其中，PPi用于解封引物。反应速度的巨大差异可以解释早些时候报道的严格反应。
此外，当三磷酸酯被用来解封反应时，使用Sub(ms-l)得到的速率为使用Sub(PM)得到的速率的0.46％。而PPi反应表现出每10,000正确起始98的错误率，三磷酸酯-催化的反应表现出每10,000正确起始只有46的错误率。因此，三磷酸酯-启动的解封反应意外地显示出改进的严格性，超过PPi-启动的解封反应，与实施例5和实施例6中所示的PCR结果一致。因此，三磷酸酯-催化的反应不是由于三磷酸酯转换到PPi。
实施例8
用三磷酸酯的解封和延伸
Therminator III DNA聚合酶为9°Nm DNA聚合酶变体，具有增强的能力，以合并修饰的底物，例如双脱氧核苷酸(Gardner,AF and Jack,WE,1999,NAR27:2545-2555；Gardner,AF and Jack,WE,2002,NAR 30:605-613)。其属于Pol B家族。本实施例表明：使用Therminator III，三磷酸酯-启动的解封是有效的。
在实验中，引物PA 16(5'-GATCCTTTAGTGCTGGACTGACC-3'；SEQ IDNO.:67)首先允许退火到PA 16Fbottm(5'-/TAM/CAGCGTGTGGTATGCG/FAM-dT/CG ACGGTCAGTCCAGCACTAAAGG ATC-3'；SEQ ID NO.:13)以形成双链体，如下列Sub(PA 16F)所示：
然后，在65℃下，在1X ThermoPol Buffer(由New England BioLabs提供)中，添加dNTP至最终0.25m和0、50、150、或250μΜ的三磷酸酯，终浓度为500nM的底物，允许与Therminator III(终浓度为0.027单位/L)反应。图10中显示了反应时间进程。随着三磷酸酯浓度的增加，荧光变化率加快。
实施例9
在三磷酸酯和Μn2+的存在情况下，通过RQY的解封和延伸
RQ 1为热稳定的DNA聚合酶，来自Thermus thermophilus(美国专利号7,422,872，其全部内容通过引用纳入本文)。其属于Pol A家族。实施例7中的所述Sub(PM)最终浓度为500nM，用于反应，其含有50mM Tris/HCl,pH8.0,2.5mMMnOAC2，三磷酸酯，和250或100μΜdNTP和所述RQY聚合酶(RQ 1的突变体，包括用酪氨酸取代苯丙氨酸669)。反应时间进程在图11中显示。很明显，在存在三磷酸酯和Mn2+下，RQY能够解封ddC，并且延伸活化的引物以产生荧光变化。如果没有三磷酸酯，所述解封无效。
实施例10
四磷酸酯为有效的解封剂(deblocking agent)
四磷酸酯为多磷酸酯，如下式：
其中n＝2(图12B)。本实施例表明：33μΜ的四磷酸酯为有效的解封剂并且在APP中是有用的。
所述20μl-反应含有50mM Tris/HCl,pH8.5,2.mM gCl2,33μΜ四磷酸酯,1.5X SYBR Green,31μΜdNTP,15mM(H3)2S04，Tween 0.1％,2pg/μl 10A每20μl反应,500nM PA-1F(5'-CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCT AA(ddC)-3'；SEQ IDNO.:1),500nM PA-1R(5'-GGGAGAAAAAAGCCAACCTTAATG(ddC)-3'SEQ IDNO.:2),以及总共20ng的人类DNA。所述阴性对照反应不含有四磷酸酯。使用ABI 7900序列检测系统，温度如下进行所述四磷酸酯-催化的反应：95℃进行50个循环，3秒钟，然后65℃,60秒钟。所述结果在图12A中显示。具有四磷酸酯的反应表现出阳性扩增曲线，而没有四磷酸酯时，所述反应在50个循环中不起飞。实施例11
使用亚氨基二磷酸酯(IDP)的APP
IDP(亚氨基二磷酸酯,Sigma-Aldrich Cat#,CAS#26039-10-1；图13B)具有如下所示的分子式：
本实施例表明，IDP在APP中是有用的。
所述20μl-反应含有50mM Tris/HCl,pH8.25,1.5mM MgCl2,62.5μΜdNTP,0.1％Tween 20,5单位的TaqFS,500nM SBTaqGnl 598Fmu,500nM1699LR(SEQ ID NO.:9),约1百万拷贝的p540D具有插入序列，SEQ ID NO.:7并且具有饱和的IDP溶液最终(a)1/4860稀释，或饱和的IDP溶液(b)1/18580稀释或(c)无IDP。
SBTaqGn l 598Fmu具有所述序列，如5'-(BHQ)-TGCAATACCGTGAGC(FAM-dT)GACC(ddC)(SEQ ID NO.:14)。使用ABI 7900序列检测系统，温度如下进行所述IDP-催化的反应：95℃进行50个循环,3秒钟，然后65℃,120秒钟。所述PCR产物在溴化乙锭琼脂糖凝胶(1％)上进行电泳，如图13A所述。只有具有IDP的反应产生特异性产物，而没有IDP的反应不产生产物。
实施例12
五磷酸酯和六磷酸酯是有效的解封剂
五磷酸酯为多磷酸酯，如下式：
本实施例表明，五磷酸酯为有效的解封剂，并且有用于进行APP反应。
所述20μl-反应含有50mM Tris HCl,pH8.5，2.mM MgCl2,33μΜ五-或六-磷酸酯,1.5X SYBR Green,31μΜdNTP,15mM(NH3)2S04,Tween 0.1％,2pg/μl10A每20μl反应,500nM PA-I F(5'-CATCCTGGTTTGTGTTTT GCCTAA(ddC)-3'；SEQ ID NO.:1),500nM PA-1R(5'-GGGAGAAAAAAGCC AACCTTAATG(ddC)-3'SEQ ID NO.:2)，以及总共20ng的人类DNA。所述阴性对照反应不含有五磷酸酯。使用ABI 7900序列检测系统，温度如下进行所述五磷酸酯-催化的反应：95℃进行50个循环,3秒钟,然后65℃,60秒钟。所述反应预期显示阳性扩增曲线。
实施例13
避免引物-二聚体形成
当引物的3'区域互补或部分彼此互补时，PCR容易形成引物二聚体。本实施例正好说明，APP是减少PCR中形成引物二聚体的有效的工具，即使引物之间大量存在互补性。
表I中列入了引物和其用于本实施例的序列，以评估形成引物二聚体的电位。合成常规引物vPA 17PD4F(SEQ ID NO.:16),vPA 17PD6F(SEQ ID NO.:17)和vPA17PD9F(SEQ ID NO.:18)，以便它们使4,6和9碱基对在3'端具有vPA 17R(SEQ IDNO.:15)。PA 17PD4F,PA 17PD6F,和PA 17PD9F,和PA 17R为具有双脱氧末端的所述APP配对物。表I中的所述下换线表示与所述对应反向引物的互补区域。
表I:引物-二聚体形成试验中的引物序列和Ct
引物 引物序列 SEQ ID Number 在PCR中的Ct*
vPA17R CCATAACCAGACTCAGCAGAGAAC SEQ ID NO.：15 -
vPA17PD4F GCTCCAGACAGAAACACCGTTC SEQ ID NO.：16 33
vPA17PD6F GCTCCAGACAGAAACAGTTCTC SEQ IDNO.：17 19
vPA17PD9F GCTCCAGACAGAAGTTCTCTGC SEQ ID NO.：18 2
PA17R CCATAACCAGACTCAGCAGAGAA/ddC/ SEQ ID NO.：15 -
PA17PD4F GCTCCAGACAGAAACACCGTT/ddC/ SEQ ID NO.：16 40
PA17PD6F GCTCCAGACAGAAACAGTTCT/ddC/ SEQ ID NO.：17 34
PA17PD9F GCTCCAGACAGAAGTTCTCTG/ddC/ SEQ ID NO.：18 29
*-在PCR中的Ct，当与对应的反向引物配对时
20μl常规的PCR反应含有1X Fast SYBR Green Master Mix(LifeTechnologies，ABI Cat#4385612)，和500nM的正向和反向引物，每个引物对具有4，6和9个碱基分别重叠。使用ABI 7900序列检测系统，温度如下进行试验：95℃进行40个循环，3秒钟，然后65℃，60秒钟。在图14中显示了反应图谱。迹线30，31和32为4，6和9碱基对重叠的常规反应。
20μl的所述APP反应含有50mM Tris/HCl，pH8.5，2.5mM MgCl2，350μιM三磷酸酯，0.5X SYBR Green，31μM dNTP，15mM(NH3)2SO4，Tween 0.1％，6ng/μl10A，500nM的每个正向和反向引物，每个引物对具有4，6和9个碱基分别重叠。使用ABI 7900序列检测系统，温度如下进行试验：95℃进行40个循环，3秒钟，然后65℃，60秒钟。在图14中显示了反应图谱。迹线33，34和35为由4，6和9碱基对重叠的APP引物进行的APP反应。
对于4-碱基重叠反应，常规反应和APP反应的所述Ct′s分别为33和40，显示出在APP反应(假设每1循环延迟减少2倍)中，潜在的引物二聚体形成减少128倍。对于6-碱基重叠反应，常规反应和APP反应的所述Ct′s分别为19和34，显示出在APP反应中，潜在的引物二聚体形成减少接近33万倍。对于9-碱基重叠反应，常规反应和APP反应的所述Ct′s分别为19和34，显示出在APP反应中，潜在的引物二聚体形成减少超过1.3亿倍。
实施例14
多重试验中引物-二聚体的形成
在多重反应中，形成引物二聚体的机会随引物数量的增加而增加。常规的20μl多重PCR反应，在95℃进行5秒钟和65℃进行1分钟之间循环，含有1X PowerSYBR Green Master Mix(Life Technologies，ABI Cat#4368706)和每个表II中所列的104nM引物，非特异性信号出自循环31(迹线36，图15)。当所述引物序列保持相同，但最后碱基改变末端(表III)，并在APP多重反应中进行扩增(20uL的50mMTris/HCl，pH8.5，2.5mM MgCl2，300μM三磷酸酯，0.5X SYBR Green，31μM dNTP，15mM(NH3)2SO4，Tween 0.1％，6ng/μl 10A)，所述非-特异性反应在40个循环中不出现(迹线37，图15)。
表II：常规和APP反应的引物库
引物序列 SEQ ID NO.
CATCCTGGTTTGTGTTTTGCCTAAC 19
GACAATACTGTTCCAATTTGGCTCATC 20
GCTCCAGTTGTATCATCCCCTTTTC 21
CACAAAGACACGAAGAACATCATTGAC 22
GGGATGGCTCTATGGACAAAAAGAC 23
TGCCATGGTGCTTCATACAAGTATC 24
CCCGGTTAAATACCATGAGATTCTAAGC 25
GGAGCAAGCTTGAAGGAGTTAGAATC 26
CCATCAGGGAAGACTATCCTCAAAC 27
GCATAGCAGTCCCCAAGAATGAC 28
CTCGCCATCCCCACCATAC 29
CCTCTTCATCCTCACCCTTGC 30
CCTGCCCTTCAGAACCTAACAC 31
TCAGCACACCTATCGGAAAGC 32
GCGGATGCCTCCTTTGC 33
GATCCTTTAGTGCTGGACTGACC 34
GCTCCAGACAGAAACACCGTAC 35
ATCCTTGGTGGGACTGAACAC 36
CAGAGAGCGCCTCCTATTCTAC 37
引物序列 SEQ ID NO.
GGAGAGAGACCTGGGAAAAGTC 38
AAGCGCTATGCAGAGAAGTACTC 39
GACACGTGCTTGAGGAAACAC 40
GCAGACTAGGCTGCATTCACTC 41
AGAGCTGCGTGGACACTAC 42
GGGAGAAAAAAGCCAACCTTAATGC 43
ATTAAACGATTACCCTGAGGATGATATGC 44
GGTGCGTTTTCTTCCCATATTCC 45
TCTTTTATATCCCCTTCGTCTGCAAAC 46
GTTAAATGGTGGTGGTGCATTCAC 47
GCGGTCCAAGGAATTTTGCTAAC 48
CAAACACCCCTTATTCCAGTCAAAC 49
CCACTTTTTCCCAACCCCAAAATTC 50
GCAGACCCAAGTTTCCTTTCTCC 51
CGGTTCCCACGAAAAGCAAC 52
CACTGAGCAACACAATTGGACTTTC 53
CCTGGCTTATCACCTTGGACTTC 54
TGTCTTGGGTGGGTTTCTCTTAAC 55
CCCAGACTCCTCCCTTGTTTC 56
ACCTCAGCCATTGAACTCACTTC 57
CTGCTCTACTGGTTTCCCTAGATTC 58
CCATAACCAGACTCAGCAGAGAAC 59
CAAACCCACCGCAGTAACTTAC 60
GCCTGCCCAGGACTTACTC 61
AGGTATGTGGCTGCTGTCTTC 62
AAGGAGGCGTCGCTGTAC 63
GCAGCCAGTCAACTCTGAAC 64
ACAGTCACCCTGCACACTTAC 65
CCCCGGGTGCGAAGTC 66
实施例15
使用APP的数字PCR
数字PCR(dPCR，digital PCR)为传统聚合酶链式反应方法的改进，其可用于直接定量和克隆扩增核酸。通过dPCR，样本进行分区，使得样品中的单个核酸分子在许多单独的区域内定位和集中。样本的分区允许人们根据泊松分布的评估来计算分子。其结果是，每个部分将包含“0”或“1”分子，或分别为阴性或阳性反应。PCR扩增后，可通过计数所述区域(其中包含PCR最终产物，阳性反应)来进行量化核酸。“样品分区”可以在单独的孔内完成，如在盘内的孔，在卡内的孔，或在乳液中的微胶粒。也可以在空间分区，而没有实际的物理屏障，如在桥式PCR，“polony”中等。
按照惯例，dPCR采用TAQMAN检测广泛监控。然而，TAQMAN检测涉及昂贵探头，从而阻碍其广泛应用。本实施例表明，APP，更便宜的方法，可能是此应用程序的理想选择，并可能优于以常规染料为基础的试验。
dPCR使用APP，涉及96个分区，每10个分区含有50mM Tris/HCl，pH8.5，1.5mM MgCl2，350μM四磷酸酯，0.5X SYBR Green，31μM dNTP，15mM(NH3)2SO4，Tween 0.1％，6ng/μL10A，500nM PA 14F和PA 14R，1.5ng的人类DNA。每个反应在95℃下进行5秒和65下进行1分钟之间循环50次。96反应，34(34)显示增长曲线(图16A)和解离曲线TM＝86℃(图16B)。通过定义，这些为阳性反应。其余62(62)为阴性反应，表现出既无增长曲线(图16C)，也无解离曲线(图16D)。
当使用常规染料-型PCR技术进行dPCR时，不能直接从阴性中找出阳性。具体而言，在96个分区中进行常规染料-型dPCR，每个分区的10μl含有1X SYBRGreenER qPCR Supermix(Life Technologies Cat#11760-500)，500nM PA14F，500nMPA 14R和1.5ng的人类DNA，在95℃下进行5秒和65℃下进行1分钟之间，5个循环。所有96个分区显示出增长曲线(图17A和17C)。在86℃下，没有一个反应孔显示单一的解离曲线峰值，如图16B的情况。相反，在约86℃下，39个(39)反应孔具有峰值，除了其它峰表示附加的非特异性扩增产物。在86℃以外，其它57个(57)反应孔也表现出多个峰值。39个的组被指定为阳性，而57个的组被指定为阴性。比较容易从阴性中辨别阳性，并且，与常规PCR相比，使用APP-dPCR具有更高的置信度。
表IV：引物序列用于数字PCR
引物名称 引物序列 SEQ ID Number
vPA14F TCAGCACACCTATCGGAAAGC SEQ ID NO.：68
vPA14R CCCAGACTCCTCCCTTGTTTC SEQ ID NO.：69
PA14F TCAGCACACCTATCGGAAAG/ddC/ SEQ ID NO.：68
PA14R CCCAGACTCCTCCCTTGTTT/ddC/ SEQ ID NO.：69
使用JMP软件，APP阴性Ct，APP阳性，常规反应的阴性和常规反应的阳性的分布，绘制在图18中。相同的数据绘制在图18B中，以指示平均和1X标准偏差。很显然，在dPCR-APP中，基于Ct，阳性很好地从阴性分离，而在dPCR-常规中，基于Ct，阳性不能从阴性分离，表明了实用性和APP的优越性。
图16B和图17B之间的解离曲线表明，在克隆扩增核酸中，APP会产生更清洁的产物。
在本公开引用的所有文献通过引用的方式纳入本文。虽然某些实施例中已经优选实施方案中描述，可以理解，本领域技术人员将想到变化和修改。因此，其目的是，所附的权利要求覆盖所有这样的等同变化，在下列权利要求的范围之内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其包括
用于从样品中扩增至少一个靶核酸的至少一对寡核苷酸引物，其中所述引物对的至少一个是具有不可延长的3’末端的寡核苷酸，所述不可延长的3’末端可通过多磷酸分解作用除去；
一种或多种多磷酸分解试剂；和
具有多磷酸分解作用活性的生物催化剂；
其中一种或多种多磷酸分解试剂选自：
通式I的化合物：
其中，n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；或
通式II的化合物：
其中，n和/或m选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，条件是n和m不能都为0，和
X选自：
2.根据权利要求1的试剂盒，其中一种或多种多磷酸分解试剂选自三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、六磷酸酯，
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括焦磷酸酯。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括可检测的DNA结合试剂或一种或多种被可检测标记物标记的探针。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中生物催化剂是DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中生物催化剂是热稳定的DNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述热稳定的DNA聚合酶选自热稳定的Tfl、Taq、AMPL1TAQFS、THERMOSEQUENASE、RQ l、RQY、THERMINATOR I、THERMINATOR II、THERMINATOR III和THERMINATOR GAMMA。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中生物催化剂具有逆转录酶活性。
9.一种用于扩增靶核酸的反应混合物，其包括
用于扩增至少一个靶核酸的至少一对寡核苷酸引物，其中所述引物对的至少一个是具有不可延长的3’末端的寡核苷酸，所述不可延长的3’末端可通过多磷酸分解作用除去；
至少一个靶核酸；
一种或多种多磷酸分解试剂；和
具有多磷酸分解作用活性的生物催化剂；
其中一种或多种多磷酸分解试剂选自：
通式I的化合物：
其中，n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；或
通式II的化合物：
其中，n和/或m选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，条件是n和m不能都为0，和
X选自：
10.根据权利要求9所述的反应混合物，其进一步包括可检测的DNA结合试剂或一种或多种被可检测标记物标记的探针。
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