CN104678540B - 一种预测焦平面的迭代离焦扫描方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种用来操作一个扫描显微镜系统的方法和设备。离焦扫描是用来预测物体产生最小模糊度的图像时物镜的焦平面位置，其中需要的最佳数值不是预估的，而是通过根据样品扫描操作本身而实时反复计算确定的。

Description

一种预测焦平面的迭代离焦扫描方法和设备

技术领域

本发明涉及扫描显微镜下放大物体的图像，尤其涉及到判定和保持当物体达到最小模糊程度的成像时焦平面最佳位置的系统和方法。

背景技术

考虑到用扫描显微镜成像的物体在厚度上很难一致，而且通过离焦扫描物体的大面积区域来收集数据从而得到物体的最佳成像条件是有问题和通常的做法。在缺少被成像物体准确的厚度分布信息的情况下，定义离焦扫描的最佳数据是不确定性事件。因此，成像的整个过程还不是最佳的，获得的物体成像的质量也有待改进，由于被成像物体的某个元素使得物镜达不到最佳位置，所以至少一些部分的物体成像是模糊的。因此，我们就需要一个方法和系统来自动确定离焦扫描的最小次数，这些扫描可以在对整个物体成像产生最小模糊程度的情况下，预测物体物镜聚焦面的最佳位置。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种预测焦平面的迭代离焦扫描方法和设备。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

本发明的实施例提供了一种产品，该产品包括一个可编程的处理器；一个非瞬时有形的计算机可读存储介质，其中包含计算机可读程序，用于通过使用一个扫描显微镜系统中的光学探测器确定光学成像聚焦的质量，所述的显微镜系统与上述产品相通信，计算机可读程序中包含计算机可读代码，一旦在计算机上加载，可编程处理器就会执行处理动作。在上述动作中，其中有一动作会在样品感兴趣区(ROI)的多个位置迭代执行离焦显微镜扫描，以此获得代表样品光学成像的光学数据，并基于上述多个位置的光学数据确定上述显微镜系统中物镜最佳实验对焦位置。除此之外，还有一个用户可感知的系统，该系统中包含图像处理步骤准备状态的指示性步骤，所述图像处理步骤基于下面两者的比较(i)从的最佳聚焦实验数值得到物镜的最佳聚焦位置，辅助位置同样在上述的多个位置中选择，(ii)确定的上述辅助位置对应的物镜的最佳实验聚焦位置。

本发明的实施例提供了一种使用扫描显微镜系统确定样品成像最佳聚焦条件的方法。这个方法包括在多个位置上对样品感兴趣区(ROI)迭代执行离焦扫描，从上述多个位置的收集的光学数据确定最佳实验聚焦数值。这个方法还包括产生一个用户可感知的系统系统中包含图像处理步骤准备状态的指示性步骤，所述图像处理步骤基于以下两者的比较(i)从辅助位置中最佳聚焦实验数值得到的最佳聚焦位置，辅助位置同样在上述的多个位置中选择，(ii)上述辅助位置的最佳实验聚焦数值。

在一个具体实施方式中，生成步骤可以包括由计算机设备产生一个标记，两者存在差异(i)测量得到的一个辅助位置最佳聚焦数值，(ii)上述辅助位置中插入的最佳聚焦数值小于或等于上述系统物镜的聚焦深度。迭代执行步骤可以包括执行离焦显微镜扫描直到下列两者之间产生差值(a)多个位置中一个特殊位置的最佳聚焦实验数值，(b)一个落在系统中物镜的聚焦深度内的某个特殊位置的最佳对焦数值，该数值由多个位置中的相邻位置的最佳对焦数值差值决定的。

可选择地或者附加的，该方法可包括创建一个感兴趣区(ROI)的最佳聚焦数值的图谱，这个图谱包括(i)多个位置的最佳聚焦实验数值，(ii)多个位置中附加位置的最佳聚焦数值，所述数值由上述最佳聚焦实验数值和在辅助位置上的最佳聚焦实验数值的偏差不大于系统中物镜的聚焦深度决定的。

本发明的实施例还包括使用扫描显微镜系统成像确定最佳聚焦条件的方法。该方法的步骤包括a)在样本的目标区域至少三个最初的横向位置上进行离焦扫描后，通过光学探测器可以获得光学数据，此处的光学数据代表最佳聚焦点的位置，这些最佳聚焦点通过与各自相应的至少三个最初的横向位置的最初的离焦扫描来确定的；该方法还包括步骤b)使用一个计算机处理器形成目标区域的一个聚焦图谱，这个聚焦图谱包括i)获取的光学数据，ii)与各自相应的目标区域中横向位置相一致的现有推断数据，该数据代表通过光学数据推断出的目标区域中横向位置的最佳聚焦点。c)从样品辅助离焦扫描中获取更新的光学数据，该光学数据代表各自相应的目标区域横向位置一致的辅助最佳聚焦点的位置，在上述目标区域中一个者多个检验点的辅助离焦扫描；此外，该方法包括步骤d)计算以下两者差异的数值(i)与上述一个或多个检验点横向位置相对应的轴向位置，(ii)与上述一个或多个检验点的横向位置相对应的最佳聚焦点的轴向位置，上述最佳对焦点来自于上述现有推断数据。

另外，该方法的实施例包括(当上述差异数值中的一个差异数值大于扫描显微镜系统物镜的聚焦深度时)形成包含上述更新光学数据的实验数据，并且重复步骤(b)至(d)。当当上述差异数值中的一个差异数值小于或者等于上述物镜聚焦深度时，该方法另外包括生成一个代表扫描显微镜系统在最佳聚焦状况下对样本成像准备状态的输出。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

下列详细说明是根据以下附图做出的：

图1A代表渐进离焦扫描方法的实施例的流程图，该方法确定了物镜的最佳聚焦位置；

图1B是本发明方法的一个简要流程图；

图2A、2B、2C、2D、2E为基于样品表面目标位置的离焦扫描推断得出的聚焦图谱提供了附加的图解；

图3A和3B提供了样品任意形状区域一个俯视图，也解释了样品表面目标位置的定位选择；

图4根据图3A、3B中选中的目标点的一个方法实施例的流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

通过使用一个显微镜工具来形成一个高分辨率的物体(例如放置在载玻片上的一块组织)有很多现实因素的考量。其中一个要考虑到的因素是关于显微镜镜头或物镜的数值孔径。为了形成一个高对比度、清晰的图像，在成像过程中，物体需要放置在物镜聚焦的深度以内，否则会造成图像的脱焦和模糊。聚焦深度与数值孔径具有以下一个倒数比例

具有较大数值孔径的物镜具有一个较小的聚焦深度。因此，当物体由一个大数值孔径的显微镜物镜成像时，相较于一个小数值孔径的物镜，物镜与物体之间的工作距离需要更高的精确度。

另一个需要考虑到的因素是被成像物体的尺寸。当物体感兴趣区域基本符合所使用显微镜物镜视野时，相对直接的方法是控制工作距离和寻找最佳聚焦点。这样的控制和确定可以在足够的活动区域内通过轴向调动显微镜物镜来实现(这条轴是与物体表面垂直的—本发明中即z轴方向)，物镜的前聚焦平面始终位于上述区域内。这个步骤就称之为“离焦扫描”。在离焦扫描过程中，当物体被放在正确的前聚焦平面上，所得图像的清晰度被最大化。相对比的，当物体很大时，它的成像区域会扩展成许多视野(实践中即玻璃片上的一块组织有时有成百上千个视野)，需要与物体对应的显微镜物镜来扫描。然而，由于在实践中成像的物体是不平的而且厚度不均，使寻找好的焦点并使物体上不断变化的点在焦点上变得困难。实际上，不仅是固定样品组织用的玻璃(包括玻璃底片和盖玻片)在显微镜下的厚度上有差异，不同扫描部分的组织也有厚度上的差异。

在成像一个大块组织时，扫描显微镜系统寻找和保持焦点的通常方法是在于被成像组织的相同位置上进行多次离焦扫描。离焦扫描允许使用者和/或系统在每一个位置确定最佳聚焦位置(参考z向或者轴)。基于这些多个位置的一系列最佳聚焦位置，该组织上其他区域的最佳聚焦位置可以通过推断得出。在大多数情况下使用的方法是线性外推法。该方法可以理解为，基于载玻片厚度的不同(包括量值的不同和空间频率的不同)，应该存在准确预测物体其余部分的最佳聚焦位置的离焦扫描优选最小数值。同时，在没有精确的玻璃厚度结构和几何方面的先备知识的情况下，无论是离焦扫描的最佳次数还是扫描的最佳位置都无法被预先确定。因此，在很多时候离焦扫描的次数和位置是使用者凭经验来确定的。不充分地、低于最佳次数的离焦扫描会导致聚焦困难和图像上一些区域的模糊。当离焦扫描重复次数过多时，操作和数据处理的时间就会被浪费。因此，我们需要一个可以智能的、自动的确定最小离焦扫描次数的方法和系统，该方法和系统可以预测物镜聚焦的最佳位置，使成像整个组织的图像的模糊斑点最小。

本发明的创意来自于对离焦扫描最佳次数的认知，使可以预测产生具有最小模糊度的图像时物镜聚焦的位置，不需要预先确定而是可以在实时扫描操作中临时确定。

根据一个实施例，离焦扫描最初是在很多位置上进行的(指的是最开始的离焦点)，这些位置是基于使用扫描显微镜系统成像的组织合适的大小和尺寸方面的信息确定的。所有组织的大小和形状是在没有复杂的测量方法下被快速确定的。每次最初的离焦扫描收集的数据都会被进一步分析后形成组织切片的一个聚焦图谱，并且会进行辅助的、所谓的辨识离焦扫描来确认聚焦图谱的准确性和/或质量，确认是否需要辅助的迭代离焦扫描来对组织所对应的显微镜物镜的焦平面工作位置进行更好的测量，如果这样的辅助的离焦扫描确实需要，上述辅助的、辨识离焦扫描会确定组织切片的焦点位置。更进一步，一旦就行了辅助离焦扫描，收集的本次数据会得到精炼，并且比先前的数据更精确，并且有助于形成本次的聚焦图谱，决定是否需要辅助的离焦扫描。这个重复的过程需要一直继续，直到达到预计的状况和品质因素(FOM)。这个品质因素代表了至少一次对组织进行离焦扫描形成的聚焦图谱和由玻璃厚度参数与物镜距离决定的实际“最佳聚焦面”(很多点中的每个点代表成像组织中特定横向坐标的最佳焦点)之间的相互关系。

为了解决确定扫描显微镜工具最佳扫描次数的问题，可以逐步地重复对物体的离焦扫描并且构建代表最佳工作(轴向)距离的聚焦图谱，在解决方法中，与组织对应的物镜位置是基于物体和玻璃厚度的信息组织横向坐标的函数。每次反复扫描得到的代表成像组织的数据添加到聚焦图谱上来帮助预测下一次重复的离焦扫描。

一个实施例的例子如图1所示，图2A、2B、2C、2D、2E进一步简要解释了物体210的一个二维横截面(沿着z轴)。尽管如此，值得提出的是本发明的范围包含了一个三维的方法。

如图2A所示，样本组织210的任意形状的切片被固定在底层玻璃片218和盖玻片214之间，一般情况下各个薄片之间的厚度差异都是未知的。图2A的元素都是不按比例展示的，厚度差异在图中被放大了，以起到示范的作用。最初的离焦测量方法被应用在步骤110中，至少有三个最初离焦点：如图中的A、B、C所标识的。这组最初的离焦点代表基于样品组织210的尺寸和一般的显微镜切片的公知参数的最小的一组点。

这样一组最初离焦测量收集的数据(特别地，这些数据代表物镜聚焦平面轴230、234、238，与位置A、B、C上物体最佳成像相对应)在步骤120被用来推断第一组最初的最佳聚焦图谱。(这个外推是基于线性外推法、立方外推法，或者其他高位多项式外推)。线性外推聚焦图谱的一个例子如图2B中的240。其中包含一个物镜轴向位置的图示，如图样本210中的点，样品的图像应该分成这些点来减少第一个图像的模糊斑点。

在步骤130，这样形成的第一代聚焦图谱的质量被第二代在不同辅助点(在步骤120中没有明确指出，以X、Y为例)的辨识离焦扫描所证实，目的是经验性地确定成像样本210上X和Y的最佳聚焦点244、248。如果在已测量的最佳聚焦z位置和预测的对应位置之间有差异，如步骤140，上述预测是基于步骤150中X和Y取小值(例如，小于预定的阈值)时确定的最初聚焦图谱，那么系统在步骤160中生成，一个相应的输出指示最初的最佳聚焦图谱满足组织的这个部分的成像要求。如图2C，这是一个最佳聚焦图谱值仅仅满足点Y的例子，其中图谱240预计值与实验值248之间的差别261在阈值以下。然而，如果在至少一个辅助点(例如z间隙260展示的点X)上相关经验和预计的z位置之间的差别140过大，那么目前为止对样品210上所有的点(如点A、B、C、X、Y)离焦扫描确定的z位置，会进一步在步骤170重新推断最佳聚焦点的图谱，以此来形成第二代的图谱270，如图2D所示。

重新推断得出的第二代最佳焦平面270质量通过在样本210上执行第三代辨识离焦扫描的确定，样本210上的区域迭代扫描中在预计的和经验的值间产生一个错的匹配。例如图2C，第三代辨识离焦扫描即在点A和B之间样品区域的点J和K上。

样本210中点J和K成像相关的物镜最佳聚焦z位置的经验值被确定，即图2E中的274和278。图2E也展示了另一个图谱推断形成的第三代聚焦图谱280(基于对值274、278与图270的预测值的比较)。根据一个实施例，这个重复的过程需要持续到，通过某一代离焦扫描测量得到的所有z位置的经验值与相应的匹配预测值(基于之前的聚焦图谱)预定的阈值范围内。当通过扫描显微镜物镜的聚焦深度和物体的形状来确定图谱的预计值与实验定的值之间的可接受的差值阈值时，所述的聚焦图谱提供一个成像物体210产生无模糊斑点图像的方案。

选择最初的最佳聚焦点

最初离焦扫描(例如，在图2中讨论到的点A、B、C的最初离焦扫描)的数量和横向位置是基于样本的大小和形状并且可以通过多种方法确定的。任何样本部分可先验获得的的附加信息可以有助于更好地选择最初离焦测量的操作特性。如图3中的一个代表最简单场景的示例，最初的离焦扫描可以在点A、B、C处进行，这些点位于样本310的边缘320处，这些点可以基于边缘320形成最大的三角区域。可选择地，也可以使用超过三个点，这样可以形成一个多边形的封闭区域，包括在样本310上连续的区域和在边缘320内最大的区域。后者的优点在一个复杂不规则形状边缘320中展现出来。在一般情况下，由点A、B、C确定的三角样本可能不能完全覆盖样本部分310，非三角形的多边形可以通过添加更多的点(如图3B中的点D、E、F)来形成多个不小于阈值区域的三角形区域。一个可能的在整个阈值(最小)区域中的多边形因数可以用比例R₀来表示：

如图4所示，该方法实施例阐述了如何确定样本区域中最初离焦扫描位置。在步骤410中，那些最初的点成为最初离焦扫描的依据。在410A中，为了形成最大的封闭三角形，至少要在预先确定的组织切片边缘确定至少三个这样的点，得出的比率值R₀在步骤410B中与预先确定的最小值R_min相比较。如果R₀<R_min，在步骤410C中，在最初多边形外围组织切片的边缘附近选择一个附加点，新的顶点与所有的这些点连接形成新的多边形。代表新多边形区域的比率R₀与临界比率R_min进一步比较。这种在边缘320区域内添加顶点形成新多边形的过程一直持续到比率R₀达到最小值R_min，这时形成最初的一组点。如图3A中的例子所示，最初的一组点是根据图4的方法选择的，包括点A、B、C(在三角形ABC满足临界条件的情况下)。图3A也展示了一种可能的情况，即最初的一组点包括点A、B、C、D、E、F(在多边形ABCDEF满足上述临界条件的情况下)。

验证已选择的最佳聚焦点

当最初的第一组点被选定过后，最初的(第一代)离焦扫描执行后，最初的(第一代的)聚焦图谱也就形成(与图1和2B相对比)，这些点的位置在步骤420中被进一步确认，根据图1中的实施例100可以验证第一代的聚焦图谱。验证的点可以被选为最初离焦点确定的三角形几何中心。

例如，对于图3A和3B中组织切片310，用来验证离焦扫描的点可以选择作为三角形ABC的点A’。在点A’沿着z轴测量的最佳聚焦位置与推断的值相比较(如图1和图2A-2E)，来确定最初聚焦图谱的质量。如果图1中步骤150的匹配条件没有达到要求(例如，根据聚焦图谱预测的最佳聚焦位置和根据快速验证离焦扫描得出的经验性最佳聚焦位置之间的的轴向分离度大于物镜聚焦的深度)，就会随之形成另一组(下一代)点。例如，图3中的三角形ABC被分成三个子三角：三角形ABA’(△ABA’)、三角形ACA’((△ACA’)和三角形BCA’((△BCA’)。然后使用新的离焦扫描数据重新推断聚焦图谱；辅助验证离焦扫描可以在点A”、B”、C”处进行，确定为形成图3B中的多边形的相应三角形的几何中心。

确定组织的形状

为了根据上述实施例实现离焦扫描的测量，我们需要知道物体(组织切片)的大概形状和大小。形状信息可以通过低分辨率的图像获取，该图像通过与主显微镜物镜相独立的放置于扫描显微镜工具上的次级成像系统获得。该次级成像系统可以是一个摄像模块,例如手机上的摄像头，来提供快照获取低分辨率的图像。

可选择地，物体的低分辨率图像可以使用低放大倍数物镜通过预先离焦测量得到，例如在最开始的时候用一个1倍的物镜代替主物镜。在这种情况下，需要预先对物体进行离焦扫描，来捕捉本组织切片的整体图像。这样的低放大倍数物镜的聚焦深度一般都较大(可以达到几百纳米)，并且最佳焦平面的位置可以轻易的通过切片的机械特性测量出来。例如，可以使用机械测量器或者光学感应器来测量低放大倍数物镜载玻片顶面或者盖玻片的顶面轴位置(在轴的方向)。基于对现有技术中的盖玻片厚度的设想(例如，大约150微米)，组织切片的轴向位置可以被估计出来。

其他考虑因素

显微镜工具在最初离焦扫描时在轴(z-)向上移动的范围要求足够大，以此来补偿显微镜物镜与组织样本相互定位的不足和在实验确定的移动范围内承受最佳聚焦平面的最初位置。基于成像物体类型和病理研究中标准玻璃片，最初离焦扫描的移动范围可能在几百微米之间，以此来补偿不确定的参数，例如载玻片顶面的轴向位置、组织切片的厚度、盖玻片的厚度。相比较之下，基于通过最初的、第一代离焦扫描确定的轴向沿着所述轴向合适的、最初的最佳焦表面的定位，验证离焦扫描(任何层次或者任何代的数据)的移动范围可以更小和有限。离焦扫描的移动范围需要足够大来补偿最初离焦点(这些点一般很小，大概几十微米)之间的差异。使用一个更小的验证离焦扫描移动范围，需要的时间可以确定样本中点最少的最佳聚焦位置，优化本发明的过程。对于每一代的推进，经验确定的最佳聚焦点和理论推断的轴向差别逐渐减小。因此，离焦扫描使用的显微镜物镜的轴向移动范围也可以减少反复推断聚焦的过程。

在实践中，一个小组织切片210的最初离焦扫描测量，可以将测量减少到一个点或者组织切片中心附件点的单点测量，该小组织切片210的区域一般只有显微镜物镜的一些视野。

上述说明中涉及到的“一个实施例”、“某一实施例”、“某一相关实施例”或者其他类似的词语代表的是包括在本发明中至少一个“实施例”中的一个特定的特征、结构或者性质。因此，在本文章中的“在一个实施例中”、“在某一实施例中”和类似的短语可能或不一定指的是同一个实施例。同时需要声明的是，本文中任何一部分都不可以舍弃图片来单独理解，文字连同图片是一起用来提供本发明所有特征的完整表述方式。

另外，当本文参考相应图纸来说明的时候(例如数字代表相同或相似的元素)，图中描述的结构元素通常都是不成比例的，特定的组成元素可能被放大来显示着重强调。本文的声明与本文是同一个整体，包括一个重点和参考。

公开的内容或者部分内容在上文中可能被结合在一起。应用本发明的原则可以得到无数的方案，因此本发明不仅仅局限于上述实施例。例如，本发明的实施可以应用到下列发明中的任何光学系统和方法，Ser Nos.13/799，068；13/803，936；13/861,121；14/031，340。这些专利申请中的每一个都在文章中被参考。

本发明可以以不同的形式被应用，例如一个系统、一个方法或者计算机程序产品。例如，本技术领域的人员可以迅速将了解到本发明方法的所有或一部分的功能、操作、决策等可以被用在计算机程序说明、软件、硬件、固件或者这些的结合产品中。本技术领域的人员也可以了解到本发明功能的说明或程序可以以许多形式发送到处理器中，包括也不仅仅局限于永久储存在不可写存储介质中的信息(如计算机的只读记忆设备如只读存储器，或者计算机输入输出可读设备，如只读光盘、或DVD盘)，信息也可储存在可写存储介质中(例如软磁碟、可移动闪盘或硬盘)，或者将信息通过通讯设备传送到计算机，包括有线或无线的计算机网络。

另外，当本发明应用到软件中时，需要用到的本发明中的功能可以选择性地选取部分或全部，应用到固件或硬件中(例如组合逻辑、特定用途集成电路、现场可编程门阵列，或者其他硬件或一些硬件、软件、固件组成部分的结合)，也可能包括一个通过存储有指示说明的有形非临时介质控制的特定的电路或处理器。计算机可用或计算机可读的介质包括一个电子的、磁性的、光学的、电磁的、红外的或者半导体系统、装置、设备或者传播介质。例如，计算机可读或计算机可用的介质包括一个有形非临时的存储介质，例如但不仅仅局限于随机存储存储器、只读存储器、可擦程序只读存储器(可擦可编只读存储器或者闪盘)、只读光盘，或一个光学存储介质，或者其他任何存储器或者上述的结合，只要适合存储控制软件或其他说明和数据。计算机可用或计算机可读介质可以使用一个装置，可以包含、储存、连接、传播进程编码到执行系统、设备。计算机程序产品可能包含存储在计算机可读介质中的程序编码，当在一个计算设备上操作是时，计算设备需要控制上述的一个或多个计算设备。计算机程序产品可以用任何程序语言来编写(例如C++)等。

Claims (7)

1.使用扫描显微镜系统确定样品成像的一个最佳聚焦状态的方法，该方法包括：

a)使用上述扫描显微镜系统的一个光学探测器，获得在样本目标区域至少三个点上离焦扫描的光学数据，所述光学数据代表由至少三个点的最初离焦扫描确定的最佳聚焦点的位置；

b)使用一个计算机处理器，形成目标区域的一个聚焦图谱，该聚焦图谱包括：

i)上述光学数据，

ii)与各自对应的目标区域中横向位置相一致的现有推断数据，所述现有推断数据代表从所述光学数据的目标区域推断得到的最佳聚焦点；

c)从样本辅助离焦扫描得到更新的光学数据，这些数据代表与各自目标区域横向位置相对应的辅助最佳聚焦点的位置，上述的辅助离焦扫描在目标区域的一个或多个验证点进行；

d)计算两者之间的差值

i)上述辅助最佳聚焦点的轴向位置，与上述一个或多个验证点的横向位置相对应，和

ii)从上述现有推断数据得到的最佳聚焦点的轴向位置，与上述一个或多个验证点的横向位置相对应；

e)当上述多个差值中的某一个差值大于上述扫描显微镜系统物镜聚焦深度时，形成包含上述更新的光学数据的实验数据，重复步骤(b)到(d)。

2.根据权利要求1所述的一个方法，所述方法还包括：

f)当上述多个差值中的某一个差值不大于上述物镜聚焦深度时，生成一个代表扫描显微镜系统成像的样本处于最佳聚焦状态准备就绪的输出。

3.使用一个扫描显微镜系统确定样本成像的最佳聚焦状态的一个方法，该方法包括：

在样本感兴趣区的多个位置上迭代进行离焦显微镜扫描，通过收集的光学数据来确定上述多个位置的最佳聚焦实验值；

基于以下的比较生成一个用户可感知的系统成像步骤准备就绪的指示标记，(i)辅助位置的所述最佳聚焦实验值得到的最佳聚焦值，所述辅助位置是所述多个位置的一部分，和(ii)实验确定的辅助位置的最佳聚焦值；

其中所述迭代执行包括执行所述离焦显微镜扫描直到以下两者的距离落在所述系统某个物镜的聚焦深度之内，(i)上述多个位置中特定位置的最佳聚焦实验值，(ii)上述特定位置的一个最佳聚焦数值，所述特定位置是由所述多个位置中相对应的相邻位置的最佳聚焦实验值确定。

4.根据权利要求3所述的一个方法，其中所述的生成包括使用一个计算机设备生成上述标记，通过测量得到的一个辅助位置的最佳聚焦数值和插入的上述辅助位置的最佳聚焦值之间的差异小于或等于所述系统物镜的聚焦深度。

5.根据权利要求3所述的一个方法，还包括创建感兴趣区的一个最佳聚焦值图谱，所述图谱包括(i)多数区域的最佳聚焦实验值(ii)上述多个位置中辅助位置的最佳聚焦值，所述最佳聚焦值通过最佳聚焦实验值的插值确定，并且所述辅助位置的最佳聚焦实验值的偏差不大于系统物镜的聚焦深度。

6.使用一个扫描显微镜系统确定样本成像的最佳聚焦状态的一种设备包括：

一个可编程的处理器；

一个非临时可见的计算机可读介质，其内置有计算机可读程序，通过使用扫描显微镜系统的光学探测器来确定光学成像聚焦的质量，其中上述显微镜系统与上述设备相关，计算机可读程序包括计算机可读编码，当在计算机上可加载所述可读编码时，上述可编程处理器在样本感兴趣区的多个位置上迭代执行离焦扫描，以此获得代表上述样本光学图像的光学数据，从而在上述多个位置中确定显微镜系统某个物镜的最佳聚焦实验位置；

基于以下的比较，产生一个系统成像准备就绪的用户可感知的指示标记，

(i)从最佳聚焦实验值插入的辅助位置的物镜最佳聚焦位置，所述辅助位置是所述多个位置中的一部分；

(ii)辅助位置上实验性确定的物镜最佳聚焦位置；

其中安装了所述计算机可读编码的可编程处理器能够持续对样本执行离焦显微镜扫描和使用光学探测器获取相应的光学数据，直到下列两者间有差异落在物镜的聚焦深度内，

(i)所述多个位置中的一个特定位置的物镜的实验性最佳聚焦位置，和

(ii)所述特定位置的物镜最佳聚焦位置，所述特定位置通过在所述多个位置中相邻位置插入相应的物镜的实验性最佳聚焦位置确定。

7.根据权利要求6所述的一种设备，还包括生成感兴趣区的最佳聚焦数值图谱，所述图谱包括：

(i)多个位置的物镜的实验性最佳聚焦位置，和

(ii)所述多个位置中辅助位置的物镜最佳聚焦位置，最佳聚焦值通过最佳聚焦实验值的插值确定，并且所述辅助位置的最佳聚焦实验值的离差不大于系统物镜的聚焦深度，

和代表轴向位置上的显微镜系统中的物镜应该根据样本感兴趣区成像过程中的差异点来放置。