CN104664551A - 一种抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的抑制剂，利用药物敏感性实验测定桃拓酚对金黄色葡萄球菌浮游菌抑制效果，再通过溶血实验，蛋白免疫印迹进一步验证桃拓酚的抑菌效果。在基因水平上，利用PCR技术对hla,sea,seb三种基因转录水平的考察来探究桃拓酚抑制外毒素分泌的作用机制，说明桃拓酚对抑制金黄色葡萄球菌外毒素的分泌具有良好的作用。桃拓酚与其它抗金黄色葡萄球菌素配合做为食品防腐剂，在不能有效抑制耐药金黄色葡萄球菌菌株生长时，可有效地抑制金黄色葡萄球菌外毒素的分泌。防止金黄色葡萄球菌外毒素中毒。为避免食物外毒素中毒，多一个安全保障。

Description

一种抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的抑制剂

技术领域

本发明属生物医药领域，具体涉及桃拓酚一种抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的抑制剂应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界，是引起化脓性疾病的重要病原菌，也是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。食品受金黄色葡萄球菌污染后，不仅会腐败变质，而且部分菌株产生金黄色葡萄

球菌肠毒素而引起食物中毒，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的首位。近年来, 由金黄色葡萄球菌所致医院感染的发病率呈上升趋势, 其耐药性也逐年增加。细菌感染已成为感染性疾病的主要原因之一, 严重威胁到了人类和动物的健康, 引起了基础和临床研究的极大关注。金黄色葡萄球菌分泌的外毒素主要包括以及肠毒素等。金葡菌分泌的溶血素是其致病力构成的重要因素之一，而其中又以α-溶血素最为常见，毒性最强，该毒素分泌至细胞外可与宿主体内的红细胞、内皮细胞、免疫细胞等大部分细胞膜结合，也是广受人们关注的一类毒力因子。肠毒素主要是指在特定条件下由金黄色葡萄球菌所产生的一类结构相似、毒力相似、而抗原性各不相同的胞外单链小分子蛋白质，具有很高的热稳定性，此外还具有的超抗原活性，属于超抗原蛋白，可以刺激非特异性T细胞增殖。

桃拓酚是用超临CO₂技术从桃拓罗汉松的心材中萃取出的专利活性产品，桃拓酚经口无味，有轻微的芳香气味。桃拓酚已经广泛被独立实验室证实认可并且显示其高效的生物抗菌活性、人体安全性和产品配方兼容性，在欧美均被列入药妆品范畴。本发明采用桃拓酚作为抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的物质，为研究开发新型的金黄色葡萄球菌外毒素分泌的食品防腐奠定基础。

桃拓酚为本发明提供的一种抗金黄色葡萄球菌外毒素分泌的天然化合物。

发明内容

本发明的目的是为解决金黄色葡萄球菌变异，耐药性逐渐增强的，食品防腐剂不能有效抑制食品中金黄色葡萄球菌的生长，而产生毒素，引起食品中毒的问题，而提供一种抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的抑制剂--桃拓酚。

桃拓酚抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的用途。

一种食品防腐剂，它包括：桃拓酚和抗金黄色葡萄球菌素；

一种食品防腐剂的使用方法，所述的桃拓酚的添加量为每克食品中添加0.5-8 μg；

所述的桃拓酚的添加量为1-2μg。

本发明人利用药物敏感性实验测定桃拓酚对金黄色葡萄球菌浮游菌抑制效果，再通过溶血实验，蛋白免疫印迹进一步验证桃拓酚的抑菌效果。在基因水平上，利用PCR技术对hla, sea, seb三种基因转录水平的考察来探究桃拓酚抑制外毒素分泌的作用机制，说明桃拓酚亚最小抑菌浓度下，对抑制金黄色葡萄球菌外毒素的分泌具有良好的作用。因此可以应用于食品防腐，避免食物中毒。

桃拓酚与其它抗金黄色葡萄球菌素配合做为食品防腐剂，在不能有效抑制耐药金黄色葡萄球菌菌株生长时，可有效地抑制金黄色葡萄球菌外毒素的分泌。防止金黄色葡萄球菌外毒素中毒。为避免食物外毒素中毒，多一个安全保障。同时也为在食品调制中，使用桃拓酚提供了更广阔的空间。

本发明中天然化合物桃拓酚，分子式为C₂₀H₃₀O，分子量为286.44，其化学结构为；

桃拓酚。

附图说明

图1桃拓酚对桃拓酚对α-溶血素分泌影响的实验结果；

图2桃拓酚对外毒素分泌抑制作用的western blot实验结果；

图3桃拓酚抑制相关基因表达的实验结果。

具体实施方式

实施例1

微量稀释法药物敏感性实验-桃拓酚对金黄色葡萄球菌悬浮菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定：在超净台的无菌条件下，在金黄色葡萄球菌琼脂板菌株中挑取单菌落，接种到Muller-Hinton肉汤（MHB）培养基中。37℃条件下震荡过夜培养，次日用MHB培养基调整菌液浓度，使其OD₆₀₀为0.4（相当于5×10⁸ CFU/ml）。在96孔的培养板中将桃拓酚药物储备液用MH肉汤培养基进行连续的倍比稀释，得到一系列浓度梯度的药液，即在每排中，用100 μl移液器从每排第一孔中移出100 μl液体加入到各自排的第2孔中进行稀释混匀，然后向后依次进行稀释混匀，直到每排的第10孔，每稀释混匀一孔换一次枪头。利用MH肉汤培养基将准备好的OD₆₀₀=0.4的菌液即浓度为5×10⁸ CFU/ml的菌液稀释成1×10⁵ CFU/ml的工作菌液。然后每孔中加入工作菌液100 μl，将不含任何药物的MH肉汤培养基100 μL分别加入到第11、12孔中，再将100 μl的工作菌液加入到第11孔中，作为阴性对照。将100 μl的MH肉汤培养基加入到第12孔中，作为空白对照。恒温培养箱中在37℃条件下进行培养24 h。观察微量培养板上细菌，在视觉上无菌生长的最低的药物浓度就是桃拓酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度。重复三次测定每种药物的最小抑菌浓度，最后将多次实验结果的最小抑菌浓度值进行计算得到平均值。将每孔的细菌吹打均匀后倒入MHA平板，不长菌的最低浓度为MBC值，试验重复3次，取中位数为最终值。桃拓酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（见表1）

 

 实施例2

桃拓酚对金黄色葡萄球菌中α-溶血素分泌的影响：从保存的金黄色葡萄球菌琼脂板菌株中，接种于TSB培养基中，37 ℃震荡培养。调节菌液浓度使其OD₆₀₀达到0.05，再继续于37 ℃震荡培养。当其OD₆₀₀达到0.3时，开始分瓶加药，即将相同体积的菌液分装在四个100 ml的三角瓶中，并加入不同浓度的桃拓酚药物储备液，使其终浓度为1/8MIC~1/2MIC（0.25~1 μg/ml）。继续培养各种不同药物浓度梯度（包括不加药的空白组）的菌液，使之均达到对数生长后期(OD_600nm=2.5)，即空白组以及其他各个加药组中细菌的总数相同，并且在这个时期细菌已经分泌外毒素到上清中。将菌液 4 ℃离心，以 5500 r/min 的转速离心1 min。取出上清后，向其中加入苯甲磺酰基氟化物，其终浓度为0.025mM。然后将加入了苯甲磺酰基氟化物的上清放在冰箱-20 ℃中保存并备用。用溶血素缓冲液彻底洗涤取出的新鲜脱纤维的兔血，然后离心至上清变为澄清，以2500 r/min转速，离心2~5 min为止。将875 μl的溶血素缓冲液加入到100 μl不同药物浓度处理的上清液样品中并轻轻混匀；将25 μl脱纤维兔血加入到100 μl培养基阴性对照中，轻轻混匀。然后将两者都置于放在温箱中在37 ℃下孵育半小时。半小时后，取出，在室温下离心以6000 r/min的转速离心1 min左右，最后在450 nm条件下测定上清液的吸光值即可。从定性结果中可以明显看出，随着药物浓度的增加，各离心管中液体的颜色逐渐降低，说明药物抑制了溶血的发生，即抑制了α-溶血素的分泌。从定量的实验结果来看，当药物浓度增加时，在细菌总数相同的条件下，其吸光度值逐渐降低，说明溶血情况明显减弱，进一步证明了细菌中α-溶血素的分泌受到了药物的抑制（见图1）。

实施例3

蛋白免疫印迹分析（western blot）-桃拓酚对金黄色葡萄球菌中肠毒素SEA， SEB以及α-溶血素分泌的影响：首先进行样品的制备。从保存的金黄色葡萄球菌琼脂板菌株中，接种于TSB培养基中，37 ℃震荡培养。调节菌液浓度使其OD₆₀₀达到0.05，再继续于37 ℃震荡培养。当其OD₆₀₀达到0.3时，开始分瓶加药，即将相同体积的菌液分装在四个100 ml的三角瓶中，并加入不同浓度的桃拓酚药物储备液，使其终浓度为1/8MIC~1/2MIC（0.25~1 μg/ml）。培养各种不同药物浓度梯度（包括不加药的空白组）的菌液，使之均达到对数生长后期(OD_600nm=2.5)，即空白组以及其他各个加药组中细菌的总数相同，并且在这个时期细菌已经分泌外毒素到上清中。收集菌上清后，加入适量三氯乙酸，过夜沉淀。次日以8500 r/min的转速离心30 min，弃上清。再加入适量的冰乙醇洗涤，再次离心，8500 r/min，30 min。弃去冰乙醇，烘干后，用Tris缓冲液将沉淀溶解。与上样缓冲液loading buffer混合后制成样品备用。蛋白免疫印迹具体试验方法：a. SDS-PAGE凝胶的制备：按配方配制分离胶。充分混匀后，将尚未凝固的分离胶灌入事先夹好的玻璃板中，灌至玻璃板的4/5即可，加好分离胶后，再用去离子水液封。待分离胶凝固后，开始配制5%的浓缩胶。按照配方配制浓缩胶。将配好的浓缩胶灌入分离胶上层，至满。插入1.5mm的梳子后，静置约20min后，浓缩胶凝固。b. 电泳：取24 μl样品，向浓缩胶形成的样品孔中加入样品，将电源装置连接好后，开始进行电泳，恒定电压120V。约2h后，完成电泳。c. 转膜：剪切出两块三层厚滤纸、一块PVDF膜，大小需要和分离胶一致。转膜过程：采用半干式转膜仪进行转膜。按照滤纸→PVDF膜→胶→滤纸的顺序将滤纸、胶、PVDF膜放入转膜仪，对齐后充分赶走气泡，盖上转膜仪上盖后，开始转膜。恒定电压15V，转膜40min。d. 封闭：将PVDF膜取出后放于封闭液中，室温封闭2h，在水平摇床上缓慢摇晃。e. 一抗孵育：按照说明书指示用封闭液将抗体进行稀释。按照1:10000比例稀释α-溶血素；按照1:8000比例稀释肠毒素A；按照1:5000比例稀释肠毒素B。4℃过夜。f. 洗膜：次日，用TBST溶液洗膜两次，每次10min；再改用TBS溶液洗膜一次，10min。g. 免疫反应（孵育二抗）：按照1:5000的比例将辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG抗体（即二抗）用封闭液进行稀释。室温孵育1h。h. 洗膜： TBST溶液洗膜两次，每次10min；再改用TBS溶液洗膜一次，10min。i.  ECL发光液进行化学显影。实验结果显示，当药物浓度增加时，在细菌总数相同的情况下，细菌中外毒素的分泌受到抑制，其分泌量逐渐减少。说明桃拓酚对于金黄色葡萄球菌中肠毒素SEA，SEB以及及α-溶血素的分泌有着良好的抑制作用（见图2）。

实施例4

实时荧光定量逆转录多聚酶链反应（real-time RT-PCR实验）-桃拓酚对金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素SEA，SEB以及α-溶血素相关基因表达的影响：从保存的金黄色葡萄球菌琼脂板菌株中，接种于TSB培养基中，37 ℃震荡培养。调节菌液浓度使其OD₆₀₀达到0.05，再继续于37 ℃震荡培养。当其OD₆₀₀达到0.3时，开始分瓶加药，即将相同体积的菌液分装在四个100 ml的三角瓶中，并加入不同浓度的桃拓酚药物储备液，使其终浓度为1/8MIC~1/2MIC（0.25~1 μg/ml）。37 ℃恒温摇床中过夜震荡培养经过不同药物浓度处理的菌液（包括不加药的空白组），直到细菌增至对数生长期，即OD_600nm=2.0，使各组细菌总数相同。离心后收集菌泥，保存备用。向菌泥中加入0.5 ml样品裂解液，充分混合后再加入0.5 ml样品裂解液，涡旋后静置10 min。加入200 μl三氯乙酸，放置15 min后，离心，12000 r/min, 15 min，4 ℃。取上清，加入500 μl异丙醇，轻轻晃动静置后再次离心，12000 r/min, 15 min，4 ℃。向沉淀中加入1 ml 75% 乙醇，离心。最后用60 μl DEPC水来溶解样品后测RNA浓度。 按照说明书配反应体系，制成RNA模板，进行反转即可。反转后按照说明书进行PCR扩增。通过real-time RT-PCR结果显示，随药物处理浓度增加，在细菌总数相同的条件下，桃拓酚能够抑制外毒素相关基因的表达水平（图3）。

Claims (4)

1.桃拓酚抑制金黄色葡萄球菌外毒素分泌的用途。

2.一种食品防腐剂，它包括：桃拓酚和抗金黄色葡萄球菌素。

3.根据权利要求2所述的一种食品防腐剂的使用方法，其特征在于：桃拓酚的添加量为每克食品中添加0.5-8 μg。

4.根据权利要求3所述的一种食品防腐剂的使用方法，其特征在于：桃拓酚的添加量为每克食品中添加1-2μg。