CN104663267A - 一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效提高烟草抗旱能力的方法。具体方法是采用浓度0.2mmol/L-10mmol/L β-氨基丁酸(BABA)对4-5叶期的烟草幼苗进行灌根。通过β-氨基丁酸的预处理可以提高干旱胁迫条件下烟草的成活率及相对分含量和降低烟草体内的丙二醛含量和提高脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白的含量，同时还可以提高超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性，减少过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶活性和增加过氧化氢含量，故β-氨基丁酸通过调节抗氧化系统提高烟草抵御干旱胁迫的能力。β-氨基丁酸又是一种对环境无污染的绿色环保友好的物质且其应用操作简单并易于大规模推广，这将给烟草生产带来巨大的经济效益同时对发展绿色农业具有重大的意义。

Description

一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及提高烟草抗旱能力的一种快速有效方法。

背景技术

干旱胁迫是影响当今世界农业生产与生态环境的重要的逆境因子，对世界农作物生产造成巨大的损失。在人口不断增加、淡水资源不足的严重及极端气温天气不断频繁出现的压力下，一种快速高效且安全的提高农作物抗旱能力的方法对我国乃至世界的农作物生产以及生态安全具有重要的意义。传统方法培育抗旱品种受到育种时间和优良性状选择的限制，新兴的转基因技术提高作物的抗旱能力具有重要的理论与经济意义，但是却存在着位置效应、基因沉默效应，外源基因的位置效应也可以引起基因的失活，而且外源基因在转基因植株中的表达也会受到抑制及基因沉默现象，这些问题都使得转基因植物存在着很大的不确定性，以及转基因存在着不确证却危害巨大的安全隐患，例如基因逃逸使其对生态环境中的其他植物存在着安全隐患以及公众健康（转基因食品）等。因此，急需一种快速有效的技术方法使农作物获得抗旱能力。

β-氨基丁酸（BABA）最早从暴晒的番茄根系中分离出来，后来大量的研究表明，β-氨基丁酸能够通过调节植物体内脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）等信号途径及抗氧化系统来抵御外界的生物或非生物胁迫的损害。因此β-氨基丁酸被认为是一种具广谱和高效的植物诱抗剂，并在许多植物的应用上取得的一定的成果。如：BABA能有效的诱导烟草抵御烟草花叶病毒和葡萄霜霉病等生物胁迫的损害，同时还能提高植物对非生物胁迫像干旱、高盐及热的耐受性及缓解重金属镉（Cd）对植物的损害等。虽然有关BABA增强植物对外界胁迫的耐受性研究很多，但关于其具体作用机制目前还不是很很清楚还需进一步的研究。同时还有研究发现BABA对调节不同植物对外界胁迫能力并不具有物种的广适性作用，因此BABA对调节不同植物的胁迫抵御能力与其实施方法和浓度有关。目前还没有关于BABA提高烟草对干旱胁迫作用的研究。

烟叶的产量和品质经常会受到自然界中的许多生物胁迫和非生物胁迫的影响，其中干旱就是其中一个较大的影响因素。近年来，我国很大一部分烟草生产区经常遭受干旱胁迫的危害，其不仅影响烟苗的生长，也会影响到烟草的品质及产量。因此，一种快速有效的方法对提高烟草幼苗及长成烟叶植株的抗旱抗寒能力具有重要的经济作用及现实意义。

发明内容

本发明旨在提供一种快速有效的提高烟草抵御干旱能力的全新方法。

本发明利用非蛋白质氨基酸β-氨基丁酸 (BABA) 调节烟草体内的抗氧化途径来增强对植物的干旱抵御能力。

具体的技术解决方案如下：

一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法，用浓度0.2-10mmol/L 的β-氨基丁酸水溶液对4-5叶期的植物植株灌根处理，连续灌根处理2～5天。

用浓度5mmol/L 的β-氨基丁酸水溶液对4-5叶期的烟草幼苗进行灌根处理，连续灌根处理3天，每株烟草幼苗的β-氨基丁酸水溶液用量为350～450ml；提高烟草幼苗之后生长的抗旱能力。

本发明通过长期的研究及相关实验筛选出符合快速高效安全这几个标准的化学物质--β-氨基丁酸（BABA），一种安全可靠且无公害的非蛋白质氨基酸作为烟草的抗逆诱抗剂。本发明通过大量的实验，用不同浓度的BABA、不同的胁迫处理时间以及对不同时期的烟草幼苗进行实验，从中筛选出能短时间内同时提高烟草抗旱能力的BABA的最佳浓度，以满足烟草种植区的要求。因此β-氨基丁酸（BABA）的预处理使得烟草在短时间内获得较强的抗旱能力进而为农业生产开辟了一条高效快速安全的新途径。

本发明与现有技术相比具有的优势及优点：

1.本发明能高效快速提高烟草干旱抵御能力：只需2-5天的β-氨基丁酸的灌根处理就能有效的增加烟草在干旱胁迫条件下的存活率和减少烟草叶片的失水率，同时还能调动烟草体内抗氧化剂和抗氧化酶来抵御干旱引起的氧化损伤；

2.本发明方法简单安全可靠：β-氨基丁酸为一种安全无公害的非蛋白质氨基酸，同时在烟草上的应用相比较于转基因的方法安全，受争议少等优点。

附图说明

图1为不同浓度β-氨基丁酸（BABA）调节干旱胁迫处理14天及复水7天后的烟草幼苗生长表型图。

图2为不同浓度β-氨基丁酸（BABA）对干旱处理14天烟草幼苗成活率的影响。

图3为β-氨基丁酸（BABA）对烟草幼苗相对水分含量的影响。

图4为β-氨基丁酸（BABA）对烟草幼苗过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（MDA）含量的影响。

图5为β-氨基丁酸（BABA）对烟草幼苗可溶性蛋白、多酚、可溶性糖及脯氨酸含量的影响。

图6为β-氨基丁酸（BABA）对烟草幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸酶（APX）及过氧化氢酶（CAT）活性的影响。

具体实施方式

干旱不仅能影响着烟草的生长和发育还对烟叶的品质有影响。近年来，我国的几大主要的烟叶产区云南、贵州和四川等经常遭受干旱胁迫的侵袭。因此一种快速有效的方法来缓解烟草对干旱胁迫带来的影响显得尤为重要。本发明以“云烟87”为实验材料，研究了β-氨基丁酸（BABA）对烟草抵抗干旱胁迫的能力。

1. β-氨基丁酸（BABA）诱导烟草幼苗抵御干旱胁迫最佳浓度的筛选

将烟草种子播种于浇灌有营养液的珍珠岩上，待其萌发并生长。在生长一个星期的烟草幼苗中，挑选生长一致的烟草幼苗移栽至12孔的育苗盆。当烟草幼苗生长至4-5叶期时，分别用0.2mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L β-氨基丁酸（BABA）溶液400ml进行灌根，每个处理三次重复，连续处理三天后，将余下的不同浓度的β-氨基丁酸（BABA）溶液全部倒出，进行干旱处理，以灌清水为对照，14天干旱处理的烟草幼苗表型见图1所示，从图1中可以看出，β-氨基丁酸（BABA）浓度为大于5mmol/L，大部分的烟草幼苗叶片依然保持着绿色且萎蔫程度较小而其它BABA浓度的大部分都出现萎蔫且叶片都变黄，而在复水后7天的成活率统计（图2所示）显示，5mmol/L β-氨基丁酸（BABA）的成活率最高，故我们得出提高烟草抵御干旱胁迫的BABA最佳浓度为5mmol/L。

2 .β-氨基丁酸（BABA）对烟草相对水分含量的影响

经0 mmol/L和5mmol/L BABA处理的烟草幼苗，干旱处理14天后，取相同部位的叶片，称鲜重，后在蒸馏水中恢复6小时，再称重，最后至于108℃杀青30分钟再在80℃烘至恒重并记下其质量，根据公式相对水分含量（%）=（初始鲜重-干重）/（饱和鲜重-干重）计算叶片中的相对水分含量，以正常生长的烟草作为对照组，如图3所示，在干旱胁迫条件下，经BABA处理的烟草幼苗的叶片相对水分含量相比未经BABA处理的烟草幼苗叶片的相对水分含量有显著性提高。

3.干旱胁迫下，β-氨基丁酸（BABA）对烟草幼苗体内生理生化指标的影响。

3.1 对丙二醛（MDA）含量的影响

采用硫代巴比妥酸比色法测定烟草叶片中的丙二醛含量。取0.2—0.3 g叶片剪碎加入1 mL 10% TCA和少量石英砂，均浆后再加入1 mL TCA继续研磨，于12000 rpm离心10 min。取上清液2 mL（对照加2 mL10% TCA），加入2 mL 0.6% TBA溶液，混匀后于沸水浴反应15 min，迅速冷却后离心，取上清液分别于523 nm、600 nm和450 nm测吸光光度值，计算结果。结果如图4(a)所示，BABA能够减少干旱胁迫下烟草叶片中的丙二醛含量。结果表明：BABA能缓解干旱胁迫对细胞膜的损害程度进而达到抵御干旱胁迫的作用。

3.2 对过氧化氢（H₂O₂）含量的影响

过氧化氢（H₂O₂）含量根据南京建成生物工程研究所的过氧化氢（H₂O₂）试剂盒测定。其结果如图4(b)所示，BABA能增加干旱胁迫条件下过氧化（H₂O₂）含量。说明过氧化氢（H₂O₂）在BABA调节干旱胁迫的过程中起着信号分子的作用。

3.3 对可溶性糖含量的影响

取约0.2g新鲜的烟草叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，置于10ml试管并加入5ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30分钟（提取两次）提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。取0.5ml提取液和1.5ml蒸馏水于20ml试管，依次加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1分钟，取出冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测定吸光度值。计算结果如图5(a)所示，在干旱胁迫条件下，BABA使得烟草叶片中可溶性糖含量增加了105%。说明BABA能诱导可溶性糖含量增加来提高烟草对干旱胁迫的抵御能力和烟叶的品质。

3.4 对多酚含量的影响

取0.25g烟叶粉末于10ml 80%甲醇溶液，后置于37℃摇床震荡3h，将其在3500rpm下离心10min。提取液置于4℃保存。取0.05ml提取液和0.45ml蒸馏水于10ml试管中，后加入2.5ml 0.2N 福林酚试剂，静置5-8分钟，加入2ml 75g/L Na2CO3溶液，于30℃下孵育1.5-2小时，期间不停摇晃。最后在765nm波长下测量其吸光度值。其计算结果如图5(b)所示，结果表明：在干旱胁迫条件下，经BABA处理和未经BABA处理的烟草叶片中多酚含量没有显著性差异，都相对于正常生长的烟草叶片含量都有提高，说明BABA不是通过改变烟草体内多酚含量来改变其对干旱胁迫的耐性。

3.5 对可溶性蛋白含量的影响

取0.1g烟草叶片置于预冷的研钵并加入1ml pH=7.0 0.05mol/L磷酸缓冲液，充分研磨，12000rpm 离心10分钟，转移提取液置于冰上待测试，取0.1ml提取液于10ml试管后加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置2分钟在595nm下测定其吸光度值，并通过标准曲线计算可溶性蛋白质含量。测定结果如图5(c)所示，干旱胁迫促使烟草叶片中可溶性蛋白有所降低，但经BABA处理的烟草叶片中可溶性蛋白含量显著增加，其比未经BABA处理的烟草叶片增加了37.56%。

3.6 对脯氨酸含量的影响

取0.2g烟草叶片，置于试管中，加入5ml 3% 磺基水杨酸溶液于沸水浴中浸提15分钟。取出试管，过滤，滤液待测。吸取2ml滤液，加入2ml冰乙酸和3ml酸性茚三酮，混匀后加封口薄膜，在沸水中加热30分钟，冷却。向管中加入5ml甲苯以萃取红色物质。避光静置20分钟以上。待分层后，吸取甲苯层，以先前设置空白管作为对照在520nm波长下比色。结果如图5(d) 所示，结果表明：未经BABA处理烟草叶片中脯氨酸含量略有增加，相比对照增加了32.15%，而BABA处理的烟草叶片中脯氨酸的含量大幅增加，相比对照增加了440.88%。

3.7 对抗氧化酶活性的影响

干旱胁迫通常会引起植物体产生氧化胁迫，但植物具有一套完整而复杂的抗氧化体系维持细胞内活性氧物质的动态平衡。超氧化物歧化酶(SOD)生命体内一种重要抗氧化酶，能有效的将植物体内的超氧阴离子(O^2-) 转化成双氧水(H₂O₂)和氧气(O₂)；而植物体内的抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）具有将植物体内过氧化氢分解成对植物没有伤害作用的物质水和氧气。过氧化物酶（POD）同时还有清除细胞内有毒的酚类、胺类毒性物质的作用。故本发明分析了干旱胁迫下，BABA对这些酶活性的影响。具体实验步骤如下：

酶液提取: 称取0.6g烟草叶片，置于预冷研钵中，加入3ml预冷的0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂充分研磨，转移研磨液于2ml离心管，再加入3ml预冷的0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮）冲洗研磨，4℃离心 12000rpm，10min，转移提取液至5ml离心管，放于冰上备用。

超氧化物酶（SOD）活性测定: 在10ml试管中加入1.5ml 0.05mol/L pH=7.8 磷酸缓冲液、0.3ml 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）、0.3ml 750μmol/L 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、0.3ml 100μmol/L EDTA-Na₂、0.5ml蒸馏水、0.3ml 20μmol/L 核黄素和0.1ml粗酶提取液。同时设两个不加酶液管，其中一个避光。将所有试管置于4000lx日光灯下反应20min后，立即置于黑暗条件终止反应。以避光管作为空白参比调零，测定560nm下吸光度值。

过氧化氢酶活性（CAT）测定:CAT酶活性的测定根据南京建成工程研究所试剂盒说明测定。

过氧化物酶（POD）活性测定：在10ml试管中加入反应液：2.9ml0.05mmol/L 磷酸缓冲液、0.5ml 2% 过氧化氢、0.1ml 2%愈创木酚、0.1ml 酶液。以不加酶液的混合液调零，在470nm处测定OD值。以每分钟A₄₇₀变化0.01为1个酶活性单位（U）。抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定：3ml混合液中含0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲液、0.1mmol/L EDTA-Na₂、0.3mmol/L 抗坏血酸（ASA）、0.06mmol/L 过氧化氢和0.1ml酶液。加入过氧化氢后立即在20℃下测定10-30s内的A₂₉₀变化，记录0s和120s的吸光值。以0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲液调零。

上述酶活性测定结果如下：如图6(a)所示，在干旱胁迫条件下，BABA能提高烟草体内超氧化物歧化酶(SOD)活性,进而减少超氧阴离子对烟草细胞的损害。抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶(CAT)活性结果分别如图6(b)和(c)所示，干旱胁迫增加了这两个酶的活性，但BABA处理后这两个酶活性受到了抑制，这将导致烟草体内过氧化氢含量的增加。如图6(d)所示，干旱胁迫下，烟草体内过氧化物酶活性在BABA处理后呈显著性增加，其虽能降解一部分过氧化氢，但同时也能清除干旱胁迫是产生的有毒酚类、胺类物质等。总的来说，还是增加了烟草体内过氧化氢的含量（如图4(b)所示）。由此我们可以推测出BABA通过抗氧化酶系统来清除烟草体内的超氧阴离子和其他一些有害氧化物质等而减少其对细胞的损害，同可以通过控制烟草体内信号分子过氧化氢的量来调节烟草对干旱胁迫的响应，最终到达提高烟草对干旱胁迫耐性的作用。

Claims (2)

1.一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法，其特征在于：用浓度0.2-10mmol/L 的β-氨基丁酸水溶液对4-5叶期的植物植株灌根处理，连续灌根处理2～5天。

2.根据权利要求1所述的一种快速有效提高烟草抗旱能力的方法，其特征在于：用浓度5mmol/L 的β-氨基丁酸水溶液对4-5叶期的烟草幼苗进行灌根处理，连续灌根处理3天，每株烟草幼苗的β-氨基丁酸水溶液用量为350～450ml；提高烟草幼苗之后生长的抗旱能力。