CN104663265B - 应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法,具体为：分别测量未萌发种子和盐胁迫后萌发种子的自发发光强度及其在外界光照射下的发光强度的衰减曲线，求得未萌发种子和萌发种子的延迟发光动力学参数；然后通过二者发光强度衰减曲线的动力学参数的变化来评价种子的耐盐性。本发明在进行作物耐盐性评价时，无需进行田间试验，只需对少量的萌发种子进行盐胁迫，跟踪测量外界光诱导的萌发种子的发光衰减曲线，通过对发光衰减曲线动力学参数的提取和分析实现种子耐盐性强弱的无损、快速评价，具有种子用量少，无损伤测量的特点。此外，本方法是对同批次种子跟踪测量，根据种子自身发光参数的变化程度来进行评价，评价结果更为可靠。

Description

应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法。

背景技术

随着社会经济的高速发展，各种自然因素和人为因素使得土壤盐渍化程度日趋严重。全球20％的耕地出现了不同程度的盐碱化，广泛分布于100多个国家和地区。大量土壤的盐渍化对全球粮食安全带来了极大威胁，成为严重制约农业生产和人类生存的最重要的生态问题之一。在这种形势下，利用各种手段对盐渍化土壤进行控制和改良，开发和培育耐盐作物，提高盐渍化土壤利用率，维持粮食生产，成为当今人类的重大课题。

要开发利用和培育耐盐作物，首先需要建立作物耐盐性评价方法和指标体系，能够对作物耐盐性强弱进行准确判断。然而，至今没有形成简单、准确和能够实现无损测量的评价方法和指标体系，制约了耐盐作物的培育和机理研究，导致优异种质资源的发掘与利用工作进展较慢，阻碍了盐渍化土地综合利用的步伐。

长期以来，评价作物耐盐性的指标主要有形态指标和生理生化指标两种，前者包括基于盐胁迫下种子萌发状况的种子萌芽耐盐指数、种子活力耐盐指数、相对发芽率、贮藏物质转运率、发芽指数和活力指数等等，以及相对生长量(苗长、根长、苗重)、幼苗存活率等等；后者以盐胁迫下作物生理生化反应的变化为依据，涉及叶绿素、光合速率、游离脯氨酸、ABA、可溶性糖、甜菜碱、质膜和液泡膜H⁺-ATPase、MDA、SOD、CAT、POD、质膜透性、气孔导度、K⁺、Na⁺及K⁺/Na⁺值等等。

上述传统评价方法有很多问题。例如，形态指标测定繁杂，工作量大和周期长，不能进行早期诊断；生理生化指标大多是通过试管实验的破坏性测量获取的，而耐盐性是在细胞层面上所呈现的综合性状，单一的生理生化指标无法反映活体的整体耐盐性；样品使用量大，不能进行无损和在位测量，不适合珍稀品种的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，解决了现有作物耐盐性评价方法样品用量大、周期长、不能早期诊断，以及破坏性测量，不适合珍稀品种评价的问题。

本发明所采用的技术方案是，应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，具体按以下步骤实施：

步骤1，在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，对其进行清洗、消毒，杀死表面微生物；

步骤2，测量种子自发发光强度I_SL：

将经步骤1处理过的种子放入微光探测器的暗室中静置10min以上，测得未萌发种子在暗中的自发发光强度I_SL；

步骤3，获取外界光照射下种子的发光强度I的衰减曲线：

将暗室中的种子取出，用非饱和光照射种子一定时间，关闭照射光，用微光探测器立即连续测量种子的发光强度，得到在外界光照射下未萌发种子的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤4，将经步骤3测量过的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入一定浓度的NaCl溶液，然后在恒温下避光培养至萌发；

步骤5，对步骤4中培养至萌发的种子进行步骤2-3的操作，得到其在暗中的自发发光强度I′_SL，及在外界光照射下萌发种子的发光强度I′随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤6，求取种子延迟发光动力学参数；

步骤7，依据发光动力学参数评价种子耐盐性。

本发明的特点还在于，

步骤3中非饱和光光源为激光、日光灯、自然光和LED中任意一种。

步骤3中光照时间大于0.1s，测量时间大于10s。

步骤4中的NaCl溶液浓度为50mmol/L～200mmol/L。

步骤4中的NaCl溶液的加入量以不淹没种子为准。

步骤4中的温度为20℃～30℃。

步骤5中萌发种子在暗中的自发发光强度I′_SL，及在外界光照射下萌发种子的发光强度I′随时间t逐渐减小的衰减曲线的测量条件与未萌发种子的测量条件相同。

步骤6，具体为：

将步骤3和步骤5得到的在外界光照射下未萌发种子的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线和萌发种子的发光强度I′随时间t逐渐减小的衰减曲线分别按照下式拟合：

分别得到未萌发种子在外界光照射后产生的初始发光强度I(0)、相干时间τ和衰减常数β，盐胁迫后萌发种子在外界光照射后产生的初始发光强度I′(0)、相干时间τ′和衰减常数β′；

步骤7评价种子耐盐性，具体为：

定义种子耐盐性评价系数为R：

其中，τ为未萌发种子发光衰减曲线动力学参数相干时间，τ′为盐胁迫后萌发种子发光衰减曲线动力学参数相干时间；

种子耐盐性评价标准为：R值的大小在0～1之间，R值越大，种子耐盐性越强；R值越小，种子耐盐性越弱。

本发明的有益效果是，在进行作物耐盐性评价时，无需进行田间试验，只需对少量的萌发种子进行盐胁迫，跟踪测量外界光诱导的萌发种子的发光衰减曲线，通过对发光衰减曲线动力学参数的提取和分析实现种子耐盐性强弱的无损、快速评价。该方法种子用量少，不需要破坏种子，具有无损伤测量的特点。此外，由于本方法是对同一批次种子发光的跟踪测量，评价方法是根据盐胁迫后种子自身发光参数变化程度的比较，避免了种子的个体差异，培养和测量方法简单，评价效果可靠。

附图说明

图1是万瑞168号玉米品种萌发第零天(未萌发)和第4天的发光衰减曲线；

图2是郑单958玉米品种萌发第零天(未萌发)和第4天的发光衰减曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，具体按以下步骤实施：

步骤1，在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，对其进行清洗、消毒，杀死表面微生物。

步骤2，将经步骤1处理过的种子放入微光探测器的暗室中静置10min以上，测量未萌发种子在暗中的自发发光强度I_SL。

步骤3，将暗室中的种子取出，用非饱和光照射种子，照射时长大于0.1秒，照射光源为激光、日光灯、自然光和LED中任意一种。

本发明中非饱和光是指外界光照射下种子发光的初始发光值达到饱和程度以下时的照射光。

步骤4，关闭照射光，用微光探测器立即连续测量种子的发光强度，测量时长T大于10秒，得到在外界光照射下未萌发种子的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线。

步骤5，求取未萌发种子延迟发光动力学参数：

将未萌发种子发光强度I随时间t变化的衰减曲线按照式(1)拟合，得到I(0)、τ和β：

其中，I_SL为步骤2测得的未萌发种子在暗中的自发发光强度，I(0)、τ和β为拟合常数，分别表示外界光照射后未萌发种子产生的初始发光强度、相干时间和衰减常数。

步骤6，将经步骤4测量过的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入浓度为50mmol/L～200mmol/L的NaCl溶液，加入量以不淹没种子为准，然后恒温下避光培养(温度可在20～30℃选择，培养天数可以根据种子萌发情况适当调整)。

步骤7，将培养后的萌发种子取出，用滤纸吸干种子表面液体，对萌发种子在相同条件下依次进行步骤2-5操作，分别得到萌发种子在暗中的自发发光强度I′_SL，萌发种子发光强度I′随时间t变化的衰减曲线，拟合得到盐胁迫后萌发种子在外界光照射后产生的初始发光强度I′(0)、相干时间τ′和衰减常数β′。

步骤8，依据发光动力学参数评价种子耐盐性：

定义种子耐盐性评价系数为R：

将步骤5得到的未萌发种子发光衰减曲线动力学参数相干时间τ和步骤7得到的盐胁迫后萌发种子发光衰减曲线动力学参数相干时间τ′代入式(2)，根据R值的大小评价种子耐盐性的强弱。评价标准为：R值的大小在0～1之间，R值越大，种子耐盐性越强；R值越小，种子耐盐性越弱。

实施例

选取耐盐性较强的万瑞168号和耐盐性较弱的玉米品种郑单958。

将外观一致的饱满种子用蒸馏水洗涤，加入质量分数为0.2％HgCl₂消毒、清洗后，用滤纸吸干表面水分，将两个品种的种子各7粒分别放置在BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理研究所研制)样品室的样品杯中，暗适应10min后测量种子的自发发光强度I_SL,，测量时间为60s，采集数据的时间间隔设置为1s，工作电压为-1000V。每次测量前都测定本底，并减去本底。I_SL的单位为counts/s。

测量完自发发光强度I_SL后，将同批种子用蓝色LED照射30s，立即测量停止光照后种子的发光，测量时间为60s，采集数据间隔为1s，工作电压为-1000V。每次测量前先测本底，并减去本底。仪器将自动采集到种子在LED照射后产生的发光衰减曲线，将该曲线数据按照式(1)拟合(其中的I_SL为前述测量所得到的数据)，得到拟合参数I(0)、τ和β。

将上述测量过的种子取出，置于放有滤纸的培养皿中，加入浓度为100mmol/L的NaCl溶液，加入量以不淹没种子为准。然后在25℃恒温下避光培养8天，每天跟踪测量这些种子的自发发光强度I′_SL和LED照射后的发光衰减曲线，测量的条件与未萌发种子的测量条件相同，仪器将自动采集种子在NaCl胁迫后每天的发光衰减曲线。图1是万瑞168号玉米品种萌发第零天(未萌发)和第4天测量得到的发光衰减曲线，图2是郑单958玉米品种萌发第零天(未萌发)和第4天测量得到的发光衰减曲线。

将图1和图2中每天的发光曲线分别按照式(1)拟合，得到两个品种的发光动力学拟合参数I′(0)、τ′和β′。采用胁迫前和胁迫后的参数值，按照式(2)计算种子耐盐性评价系数R。在本实例中，利用式(2)计算得到的胁迫第4天时万瑞168号的R值为0.44，郑单958的R值为0.38。由于依据式(2)计算得到的万瑞168种子耐盐性评价系数R大于郑单958，所以，万瑞168种子耐盐性大于郑单958。

由本实施例可见，本发明提出的评价作物种子萌发期抗旱性的方法无需进行田间试验，只需对萌发种子进行盐胁迫，直接测定外界光照射后的种子发光衰减曲线，通过对发光参数的提取和分析就可以实现萌发种子耐盐性强弱的无损、快速评价，简单实用，评价效果可靠。

Claims (4)

1.应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，其特征在于，具体按以下步骤实施：

步骤1，在待检测的作物种子中选择饱满程度和大小一致的种子，对其进行清洗、消毒，杀死表面微生物；

步骤2，测量种子自发发光强度I_SL：

将经步骤1处理过的种子放入微光探测器的暗室中静置10min以上，测得未萌发种子在暗中的自发发光强度I_SL；

步骤3，获取外界光照射下种子的发光强度I的衰减曲线：

将暗室中的种子取出，用非饱和光照射种子，光照时间大于0.1s，测量时间大于10s关闭照射光，用微光探测器立即连续测量种子的发光强度，得到在外界光照射下未萌发种子的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线；

步骤4，将经步骤3测量过的种子置于铺有滤纸的发芽床上，加入浓度为50mmol/L～200mmol/L的NaCl溶液，然后在恒温下避光培养至萌发；

步骤5，对步骤4中培养至萌发的种子进行步骤2-3的操作，得到其在暗中的自发发光强度I′_SL，及在外界光照射下萌发种子的发光强度I′随时间t逐渐减小的衰减曲线；萌发种子在暗中的自发发光强度I′_SL，及在外界光照射下萌发种子的发光强度I′随时间t逐渐减小的衰减曲线的测量条件与未萌发种子的测量条件相同；

步骤6，求取种子延迟发光动力学参数：

将步骤3和步骤5得到的在外界光照射下未萌发种子的发光强度I随时间t逐渐减小的衰减曲线和萌发种子的发光强度I′随时间t逐渐减小的衰减曲线分别按照下式拟合：

$I\left(t\right)=I_{SL}+\frac{I\left(0\right)}{{(1+\frac{t}{\mathrm{\τ}})}^{\mathrm{\β}}}$

分别得到未萌发种子在外界光照射后产生的初始发光强度I(0)、相干时间τ和衰减常数β，盐胁迫后萌发种子在外界光照射后产生的初始发光强度I′(0)、相干时间τ′和衰减常数β′；

步骤7，依据发光动力学参数评价种子耐盐性：

定义种子耐盐性评价系数为R：

$R=1-\frac{\mathrm{\τ}}{{\mathrm{\τ}}^{\′}}$

其中，τ为未萌发种子发光衰减曲线动力学参数相干时间，τ′为盐胁迫后萌发种子发光衰减曲线动力学参数相干时间；

种子耐盐性评价标准为：R值的大小在0～1之间，R值越大，种子耐盐性越强；R值越小，种子耐盐性越弱。

2.根据权利要求1所述的应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤3中非饱和光光源为激光、日光灯、自然光和LED中任意一种。

3.根据权利要求1所述的应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤4中的NaCl溶液的加入量以不淹没种子为准。

4.根据权利要求1所述的应用外界光诱导种子发光评价作物耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤4中的温度为20℃～30℃。