CN104661660A - 金精三羧酸合成的复合物低分子量组分对补体的膜攻击复合物和c3转化酶的选择性抑制作用 - Google Patents

金精三羧酸合成的复合物低分子量组分对补体的膜攻击复合物和c3转化酶的选择性抑制作用 Download PDF

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Abstract

采用分子量小于1千道尔顿的金精三羧酸复合物成分，选择性抑制哺乳动物物种优选人中的补体膜攻击复合物。优选抑制剂是金精三羧酸，金精四羧酸，和金精六羧酸。通过选择性抑制补体膜攻击复合物而治疗的优选的病症是与年龄相关的黄斑变性，阿尔茨海默病，动脉粥样硬化，类风湿关节炎，阵发性夜间血红蛋白血症，疟疾感染，与多发性硬化。

Description

金精三羧酸合成的复合物低分子量组分对补体的膜攻击复合物和C3转化酶的选择性抑制作用
技术领域
金精三羧酸复合物的合成
金精三羧酸复合物的合成是根据公布的标准程序进行(Cushman和kanamathareddy，1990)。
1.合成3,3’-二氯-5,5’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷：
3-氯水杨酸(1克)溶解在甲醇(10毫升)中。加入水(2.5毫升)，在冰盐(NaCl)浴中烧瓶冷却至-5℃。历经20分钟慢慢加入浓硫酸(30毫升)，温度保持在-5℃。反应混合物然后在此温度下搅拌1小时，同时加入37％甲醛溶液(4毫升)。温度保持在0℃1小时，然后混合物在室温放置24小时。反应混合物倒入碎冰(150克)，和过滤沉淀，干燥，得到产物,3,3’-二氯-5,5’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷(产量0.92g，92％)，作为粉末。样品经甲醇重结晶。
2.合成3,3’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷：
3,3’-二氯-5,5’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷(0.92克)溶解在乙醇(18毫升)和三乙胺(10毫升)中。钯碳被添加到该溶液中，在氢气气氛下搅拌混合物48小时。滤去催化剂，蒸发溶剂，和水(100毫升)加入到残留物中。将溶液冷却，和加入浓盐酸(5毫升)。将白色沉淀物过滤和干燥，得到产物，3,3’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷(0.75克，90％)，作为固体。将它从甲醇溶解和再结晶。在剧烈搅拌下粉末状的亚硝酸钠(4克)加入浓硫酸(4毫升)。化合物3,3’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷(0.75克)和水杨酸(0.38克)的混合物被搅拌，直到达到均匀。然后将其倒入硫酸钠硝酸溶液。在室温继续搅拌额外的18小时。混合物倒入碎冰(100克)，同时搅拌。将暗橙色沉淀过滤和干燥，得到粗产物(0.6克，收率60％)。粉末溶于2％氢氧化铵，用于分析。
3.3,3’,3’-三羧基-4,4’,4’-三羟基三苯基甲醇复合物(金精三羧酸复合物):
在剧烈搅拌下粉末状的亚硝酸钠(4克)加入浓硫酸(4毫升)。化合物3,3’-二羧基-4,4’-二羟基二苯基甲烷(0.75克)和水杨酸(0.38克)的混合物被搅拌，直到均匀。然后将其倒入硝酸钠硫酸溶液。在室温继续搅拌额外的18小时。混合物倒入碎冰(100克)，同时搅拌。将暗橙色沉淀过滤和干燥，得到粗产物(0.6克，收率60％)。粉末溶于2％氢氧化铵，用于分析。
ATAC的分离和分析
从合成，或从西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)商业购买的金精三羧酸，或来自GFS化学品公司(GFS Chemicals Inc.)(哥伦布，OH)的铝试剂(Aluminon)得到的粉末被分为高、低分子量组分。在一个典型的实验中，五克物质溶解在0.2％氢氧化铵(45毫升)和在空气压力下(70-75磅，5.3千克/平方厘米，持续6小时)强制通过1kDa过滤器(plac04310，微孔，Ballerica，MA)。通过冷冻干燥使过滤的物质重结晶。滤液(1毫升4.5毫克)然后装上尺寸排阻色谱柱(Sephadex LH-20填料在60％乙醇中，GE医疗，皮斯卡塔韦，新泽西(GE healthcare,Piscataway,NJ))。收集三种不同的洗脱液馏分。在Waters ZQ装置上通过质谱分析三种馏分，以及起始混合物，所述Waters ZQ装置配有ESCI离子源和Waters Alliance四极探测器。所有样品均暴露于正、负模式电喷雾电离，以及大气压化学电离。扫描范围为m/z 0-1100和m/z 500-1500。三种分子被检测为422，572，858MW。这些分子量分别对应于ATA，AQA，和AHA，如图3所示。没有检测到其他小于1.5kDa的衍生物。分离和通过质量光谱学分析成分。来自三个来源的结果几乎是相同的。低分子量成分只占了总的12-16％。它们都含有分子量422，572，和858的三种分子。
低分子量产物作为膜攻击复合物和C3转化酶的选择性抑制剂的评价
为了评价金精三羧酸复合物(即ATA加AQA加AHA)的低分子量的产物阻断经典补体途径的强度，应用标准的CH50测定。通过采用兔抗绵羊红细胞抗体孵育过夜致敏绵羊红细胞。然后含有和不含不同量的低分子量金精三羧酸馏分(ATAC)的稀释的血清与致敏的红细胞在37℃孵育1小时。孵育物以5000rpm离心10min。从被补体攻击破坏的红细胞释放到血清中的血红蛋白，是通过读取在405nm处的光密度(OD)而测定的。作为阳性对照，用水100％溶解红细胞，作为阴性对照，无血清加入到孵育物。
结果如图3所示。这些成分中的每一个几乎以相同程度抑制人类补体介导的红细胞溶血。ATA的IC50值为544nM，AQA的IC50值为576nM，AHA的IC50值为559nM和ATAC的IC50值为580nM。大鼠血清ATAC的IC50为268nM。这些数据证明了低分子量金精三羧酸衍生物抑制补体激活是在纳摩尔范围，包括啮齿类动物以及人类的血清。
为了确定在补体级联的哪个阶段发生阻断，变化CH50测定。不测量溶血，而是运行蛋白质印迹分析，以确定哪个血清补体蛋白被消耗并转化为在敏感膜上的活化的补体产物。补体蛋白质仅仅在阻断阶段被消耗和转换。在阻断之外的阶段，它们在血清中保持不变，但它们的活化的产物出现在细胞膜。结果如图4所示。人血清稀释16倍。然后用ATA，AQA，AHA或ATAC将其处理30分钟。然后加入相同体积的抗体缀合的绵羊红细胞。将所得混合物在37℃孵育1小时。然后用裂解缓冲液处理它们，之后用加载缓冲液处理它们，以用于蛋白质印迹。来自每个样品的等量的蛋白质加载到凝胶上，和用10％的SDS分离。SDS后，将蛋白转移到PVDF膜。然后对膜采用以下进行处理：采用不同的一抗，之后采用标记的二体，使用成熟的技术(李(Lee)等人，2011)。利用的抗体的列表，如表1所示。通过使用增强的化学发光系统和曝光照相胶片而可视化由抗体识别的谱带。对于采用不同的抗体探测相同的膜，采用剥离液处理膜(李等人，2011)，然后与之前一样采用不同的一抗处理。
典型的结果如图4a所示。左泳道仅加载血清，和显示，C1q，C3，C4和C5谱带很容易检测到。相邻泳道说明加入致敏的红细胞的影响，所述致敏的红细胞然后被补体攻击溶血。天然的血清蛋白被消耗，并且被并入红细胞膜。C1q不被代谢，但由于其从C1复合物的解离，谱带加强。不再检测到天然的C3，因为它已裂解，和C3b片段已共价连接到膜。检测到降解产物C3d。C4不再被检测到，因为它同样被裂解，和C4b片段附着于细胞膜，和代谢为降解产物C4d。该片段也被检测到。C5被裂解，检测到C5a产物的谱带。最后，检测到C5b-9膜攻击复合物，其形成在红细胞膜上，引起它的溶血。
接下来膜显示，在ATAC的存在下血清加致敏的红细胞的孵化影响。对于调理步骤的相同的谱带进行检测，但红细胞不溶血，和未检测到膜攻击复合物。
为了确定膜攻击复合物的组装被阻断的阶段，进行额外的分析。除了在被处理以用于蛋白质印迹分析前红细胞从残留血清中分离和洗涤，孵育与之前一样。采用C6，C7，C8和C9的抗体对印迹进行探测。结果是显示在图中，图4b针对ATAC，图4c针对ATA，图4d针对AQA和图4e针对AHA。每个成分结果是相同的。单独的人血清泳道1显示，C6，C7，C8和C9在未经处理的血清中容易检测到。泳道2表明，在被补体攻击溶血的无保护红细胞中，这些抗体仅仅检测C5b-9，完全形成的膜攻击复合物。泳道3，其中的细胞是受ATAC保护，表明膜攻击复合物不完全形成而在C8阶段被停止。C6抗体检测C5b6，C5b67，和C5b678。C7抗体检测C5b67，和C5b678，而C8抗体检测到C5b678。这些数据表明，在C9附着C5b678的阶段ATAC停止形成膜攻击复合物。由于C9(n)被需要用于创建膜破坏孔，这一阻断是高度特异于防止C9附着。
为了确定ATAC对旁路途径的影响，进行了实验，其中采用C1抑制剂(1.8微克/ml)或采用C4b抗体(11000倍稀释)阻断经典途径。在这些实验中，人血清(15倍稀释)与C1抑制剂和ATA(5微米，泳道3)，或ATA与备解素(1microgm/ml，泳道4)或因子D(0.1microgm/ml，泳道5)孵育1h，之后加入调理的酵母聚糖(1microgm/ml)。混合物在37℃孵育1小时，以5000rpm离心10min。采用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗两次颗粒，将其采用样品加载缓冲液处理以用于SDS-PAGE和免疫印迹法。50mM Tris-HCl(pH 6.8)，0.1％SDS，0.1％溴酚蓝和10％甘油构成缓冲液。为了保存形成的分子复合物，之后采用SDS-PAGE温和条件。为了C1q印迹，使用常规样品上载缓冲液(50mM Tris(pH 6.8)，1％SDS，0.1％溴酚蓝、10％甘油和2％β-巯基乙醇)。
图5a显示，当分别采用备解素(1/2000)，C3b(1/2000)，因子B/Bb(1/2000)和因子D(1/2000)的单克隆抗体发展这些红细胞膜的蛋白质印迹时的结果。在每一个印迹的泳道1显示，在未经处理的血清中检测到天然蛋白质。泳道2显示，在已被在C1抑制剂存在下由酵母聚糖介导的补体攻击溶血的红细胞中，通过备解素，C3b和因子B/Bb的抗体检测类似的谱带，在MW上对应于PC3b(～240kDa),PC3bB(～340kDa)，PC3bBb(～300kDa)PC3bBbC3b(>410kDa)。这些数据表明，C3转化酶和C5转化酶存在于细胞膜上。然而没有检测到C3b的独立谱带。这一结果表明，C3b需要结合备解素，并且将其结合导向至红细胞膜。因子D的抗体没有检测因子D的任何谱带，表明因子D没有在膜上形成任何SDS稳定的复合物。泳道3显示在5miroM的ATA存在下获得的结果。没有形成PC3bBb和PC3bBbC3b的谱带。相反，对于与PC3b和PC3bB较早步骤的强谱带出现。这些结果表明，激活的停止发生在PC3bB被因子D裂解而形成C3转化酶的阶段。泳道4和5说明，备解素(1microgm/ml)或因子D(0.1microgm/ml)补充血清的作用。部分地克服了ATA的作用。PC3bBb和PC3bBbC3b的弱谱带再现，虽然PC3bB谱带持续存在。没有观察到谱带因子D。这一结果进一步证明，因子D不形成连接到膜的稳定的键，但仍然残留在血清中。
图5b说明了对残余血清的作用，如采用C5/C5a抗体发展的蛋白质印迹所示的。采用酵母聚糖和C1抑制剂处理导致C5谱带的消失和激活产物C5a的出现(泳道2)。ATA和C1抑制剂的加入(泳道3)防止C5的裂解，其是部分被采用备解素(泳道4)和因子D(泳道5)的处理所拮抗。C5弱谱带的出现以及C5a模糊谱带指示血清C5部分激活。
图5c显示这些处理对红细胞膜的效果，所述效果由MAC成分C5/C5b，C6，C7，C8和C9的抗体发展。泳道1显示，C5，C6，C7，C8和C9的谱带在未经处理的血清容易检测到。用酵母聚糖和C1抑制剂血清处理后膜的泳道2，导致各蛋白谱带的消失和MAC形成成分C5b6，C5b67，C5b678和完全形成的C5b-9的出现。在其中添加ATA的泳道3显示出现完全阻断，而在膜上没有出现激活谱带。泳道4和5，其中血清分别补充了备解素和因子D，表明补体系统部分激活，出现C5b6，C5b67和C5b678的弱谱带，但在C5b-9阶段仍然存在阻断，表明ATA也阻断C9至C5b-8的附着(addition)。
接下来的实验组直接测试ATA至备解素，因子D和补体蛋白的的结合。这些蛋白以1-32ng/ml的浓度范围被固定在微孔板。然后ATA以100microgm/ml的浓度加入，和孵育溶液，如方法中所描述的。根据我们先前公布的荧光法(Lee等人2011)，对至蛋白质的ATA结合进行检测。图6显示结果。没有ATA结合备解素。只观察到背景荧光。这一结果与以下观测一致：备解素与红细胞膜的结合不受ATA影响。但ATA以浓度依赖的方式结合到因子D和C9。这样的结合解释了为什么ATA在因子D裂解PC3B以形成PC3Bb的阶段阻断旁路途径，并且在C9附着至C5b678的阶段阻断经典途径和旁路途径。然而，其他补体蛋白如C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8和因子B(各自32ng/ml)没有结合ATA。
总之，图7为旁路补体途径的图解，显示ATA干扰的步骤。旁路途径的激活首先需要备解素结合到膜上的靶标。然后C3b可以附着到结合的备解素。随后因子B可以被添加。关键阶段是复合物上的因子B的裂解，以形成C3转化酶(PC3bBb)。只有这样，血清中仍然残留的大量C3可以被裂解和连接至C3转化酶以形成C5转化酶(PC3bBbC3b)。因子D进行因子B的这种裂解。因为在红细胞膜蛋白质印迹中没观察到掺入因子D的谱带，在血清中的因子D不可能与膜结合的PC3bB形成稳定结合。它可能简单附着至和裂解结合的因子B，然后仅仅伴随因子Ba解离回到血清。在这一步中ATA进行干扰，可能通过结合在溶液中的因子D，防止它接触结合的PC3bB。如果这一步被克服，使C5转化酶可以形成(PC3bBbC3b)，那么ATA还是阻断C9附着至C5b678，防止MAC的形成。因此，ATA提供旁路途径的二步抑制，和在以下条件下可能是特别有效：存在旁路途径的不需要激活。
ATA甲酯合成和过滤
为了说明ATAC的简单的衍生物也有补体抑制性能，合成和通过人血清CH50测定测试甲基酯。简要地说，ATAC(0.8克)溶解在甲醇(16毫升)中。加入浓硫酸(610微升)。将反应混合物在55℃回流1小时。蒸发溶剂，收集剩余的固体。在CH50测定测试该产物，与非酯化的物质相比，该产物被认为是29％有活性(图8，IC50为0.64miroM和2.52miroM，假设分子量为422)
体内试验
由于本发明需要可以在连续的基础上安全地施用的物质，它需要在动物体内试验。这可以通过将添加到它们的正常饮食而得到的粉末的混合物喂养小鼠或其他物种，从而得以实现。我们的例子是采用小鼠，所述小鼠是针对阿尔茨海默病的突变转基因的(B6SJL-Tg)。通过采用这样的小鼠，不仅针对该产物安全性测试，而且对该产物对阿尔茨海默病的潜在功效进行测试。
对照B6SJL-Tg小鼠饲喂普通饲料，试验B6SJL-Tg小鼠饲喂添加0.5mg/kg ATAC的饲料。基于饲料消费，被计算出的是，试验小鼠接收5mg/kg/天的ATAC。从56-63天的年龄开始喂养，处死前持续另外的30天或48天。经过尸体解剖，在ATAC强化或正常饲料喂养的小鼠的任何器官中没有观察到病理学的证据。这些数据表明，在以5毫克/千克/天剂量持续消耗44天时，ATAC的耐受性良好且是明显安全的。
CH50测定结果如图9所示。不同稀释度血清(1-16倍)与抗体缀合的绵羊红细胞孵育1h。来自喂养的小鼠的血清需要较少的稀释，与膜攻击复合物的抑制作用一致(IC50为1.92倍与6.89倍，其为喂正常饲料的小鼠)。这些数据表明，达到3.59倍的保护。它们证明，ATAC在口服后，被吸收，在测试的剂量，是MAC形成的有效抑制剂。
由于β-淀粉样蛋白沉积的快速堆积，B6SJL-Tg小鼠发展早期记忆障碍。喂正常或ATAC饲料的B6SJL-Tg小鼠的记忆是使用标准的水迷宫试验而测试。它是在1.5米直径的游泳池中进行，所述游泳池具有不透明流体和直径10厘米的隐藏平台。小鼠被放置在池中进行第一天可见训练，其次是四天的培训，其中平台被隐藏。次日在隐藏的平台被移除的情况下，它们被测量，以确定它们如何快速回到隐藏的平台曾被放置的地方，以及它们记住它的位置的情况。由HVS 2020加图像分析仪捕获，动物在该平台曾经被定位的区域的运动跟踪。数据采用双向ANOVA分析。发现ATAC处理的小鼠表现比未经处理的小鼠好2.5倍。数据如图10所示。总之，这些对阿尔茨海默病转基因小鼠体内的数据表明ATAC不仅安全，而且有益于这些动物。它提高了体重增加和记忆保留，这与它的抑制补体膜攻击复合物的形成能力相关。
本发明对人类疾病的治疗的适用性
一般考虑。补体系统通常被解释为仅服务于适应性免疫系统。但它也正是先天免疫系统的一个支柱。它被称为在所有慢性退行性疾病中起作用。如果它被激活的程度达到了形成MAC，有通过旁观者溶胞作用恶化病理的危险。损害也可通过慢性活化旁路补体途径而发生。在一系列人类疾病状态的干预的治疗机会都没有被探究，因为先前没有描述，口服有效的补体抑制剂，其选择性阻断MAC和旁路途径的激活。这里描述的本发明说明疾病的例子，其中在常见的退行性疾病中的效益从利用这里描述的本发明可以被预期。
类风湿性关节炎。有有力的证据表明，补体的经典途径和旁路途径都在类风湿关节炎中在病理上被激活(Okroj等人。2007)。关节炎的关节包含能激活补体的蛋白质，以及表示经典途径和旁路途径均被激活的蛋白质。在类风湿性关节炎的小鼠模型中，阻断可以通过缺失C3，C5，或因子B而实现(Okroj等人。2007)。这些数据表明，ATA，或ATAC应在类风湿性关节炎中有效。
多发性硬化：多发性硬化是一种复发缓解性疾病，其特征是脑白质炎症。检测到特异性抗体，其靶向髓鞘抗原，表明它是一种自身免疫性疾病(Genain等人。1999)。在这个过程中，补体将被激活，指示ATAC疗法的恰当性。
疟疾感染：疟疾在非洲和东南亚是普遍的疾病，估计造成每年650000人死亡。感染源，恶性疟原虫，通过蚊子传播，在人类和易感动物产生了增强的补体活化。IgG和C3bBb复合物已在感染的人类红细胞上被识别，指示通过经典途径和旁路途径的激活引起的损伤(Silver等人。2010)。因此，采用ATAC治疗应该有有益的效果。
阵发性夜间血红蛋白血症：X染色体基因PIGA的红细胞中克隆缺失导致阵发性夜间血红蛋白血症。因此，锚定膜蛋白如CD 55和CD 59必要的糖基(glycosal)磷脂酰肌醇(phosphatidylinosotol)部分是非功能性的。红细胞和血小板缺乏限制旁路途径的细胞表面激活的能力。患者受到致命的血栓和溶血攻击。部分有效的治疗是在每两周一次的间隔施用单克隆抗体依库珠单抗，其阻断C5裂解，防止膜攻击复合物的合成。然而这种治疗是不令人满意的，其是只有在49％的患者中有效(Hillmen等人。2006)。一个可能的原因是，它不会阻断C3转化酶的活性。由于CD 55缺陷C3转化酶不被调节(Parker2010)。因为ATAC是口服有效的并且弥补两种缺陷，ATAC应该是真正明确的用于阵发性夜间血红蛋白血症的治疗。
阿尔茨海默氏病。长久以来被认为的是，β-淀粉样蛋白沉积在脑，这被认为是本病的主要原因，可以通过调理补体成分而鉴定。结果表明，这是由于C1q结合β-淀粉样蛋白(Rogers等人，1992)。这也表明，补体膜攻击复合物装饰沉着物附近的受损的神经突起，说明补体系统的自我损害(McGeer等人，1989)。总之，这些数据表明，补体调理方面需要保护，从而使β-淀粉样蛋白沉积的吞噬作用可以发生，而膜攻击复合物需要被选择性阻断，使得可以消除宿主神经元的自我损害。
年龄相关性黄斑变性。调理补体成分已被确定与玻璃疣相关，这是与疾病相关的细胞外沉积。在退化的视网膜色素上皮细胞附近发现了膜攻击复合物(Anderson等人，2002)。遗传分析表明，因子H，补体因子B和C3的多态性，都显著影响患有年龄相关性黄斑变性的风险(Anderson等人，2010)。这些数据说明，补体的调理方面需要被保护以便吞噬玻璃疣可发生，而膜攻击复合物需要选择地被阻断，使得视网膜色素上皮细胞的自我损害可以被消除。
动脉粥样硬化。动脉粥样硬化一般不被认为是由补体系统加重。然而，C-反应蛋白的mRNA，一个已知的补体激活剂，在动脉粥样硬化斑块的区域中上调超过十倍。显示C-反应蛋白的上调和补体的调理作用成分的斑块也表明膜攻击复合物的存在(Yasojima等人，2001)。这是人类常见的退行性病症的另一个例子，其中膜攻击复合物是存在于无菌的状态，因此只能破坏宿主组织。再次，这里描述的本发明将保持补体的理想的吞噬刺激方面，同时消除膜攻击复合物的自我损害方面。
如本领域技术人员都知晓的，这些疾病仅仅是很多疾病的例子，可以发现在这里描述的本发明将对所述疾病有治疗效果。
背景技术
已经描述了许多药物，其将抑制补体系统。这些包括肝素，舒拉明，ε-氨基己酸，和氨甲环酸。
但是，没有描述口服有效的药物，其将保留经典补体途径功能的必需调理，但是，其将通过阻断旁路途径的C3转化酶活性，和通过两个途径的膜攻击复合物的装配防止自我损害。唯一批准的用于治疗异常补体激活的药物是依库珠单抗，人源化单克隆抗体，其阻断旁路途径的C5转化。它已被批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白血症。它是在49％的病例中有效(Hillmen等。2006)。但是，它不阻断C3转化酶的早期步骤，这可以导致红细胞的溶血(Parker 2012)。此外，作为一种高分子量的免疫球蛋白抗体，它不会穿越血脑屏障，在中枢神经系统疾病中将无法有效。
本发明人已经确定，低于1kDa MW的金精三羧酸合成复合物(ATAC)的组分阻断旁路途径C3转化酶，以及在旁路途径和经典途径的C9附着至C5b8的最后阶段的MAC装配。本发明人还确定，它们是在口服之后安全有效的。
补体是固有免疫和适应性免疫系统的重要组成部分。它执行四个主要功能：识别用于处理的靶标，调理以协助吞噬作用，产生过敏毒素，并通过膜攻击复合物(MAC)插入活细胞表面而直接杀死细胞。虽然补体是活生物体中的一个重要的防御系统，它被广泛认为是一把双刃剑。它的调理成分是有益的，但膜攻击复合物是潜在的自我损害。
现在理解的补体系统是如图1所示。它包括两个主要途径：经典和旁路。途径有不同的调理机制，但它们共有端成分组装以形成膜攻击复合物(C5b-9)。经典途径以C1复合物的C1q成分开始，C1复合物识别需要被吞噬的靶标。后续步骤涉及C1复合物的解离，C2，C4，和C3的裂解，以提供活化的补体成分的扩增以及共价连接至靶标。通过这种方式，靶标是被吞噬细胞处理，吞噬细胞具有用于活化的如此附着的补体成分的受体。
两种途径导致C5被裂解成C5a和C5b。然后释放的C5b片段可以插入到附近的细胞膜。然后C6，C7，C8和C9(n)可以依次附着于膜。C9的附着通过在膜上开孔赋予复合物功能，从而导致细胞的死亡。它的生理的目的是杀死外来病原体，但在无菌的病变的情况下，它可以通过称为旁观者溶胞作用的现象破坏宿主细胞。
因此补体系统在两部分运行。第一部分是调理作用，其制备用于细胞吞噬的靶组织。第二部分是膜攻击复合物的组装，其具有杀伤细胞的目的。前者是必要的，但后者不是必要的。例如，大约0.12％的日本人对于在C9的4号外显子处无义CGA-TGA(精氨酸95终止(stop))突变是纯合的(Kira等人，1999)。这些个体不能生成功能膜攻击复合物。这意味着，尽管存在这种缺陷，有超过150000日本人过着健康的生活。日本人的体验表明，在长期的基础上膜攻击复合物制剂的选择性抑制是一种可行的治疗策略。
在有补体系统的持续的过度活性的所有疾病中，膜攻击复合物恶化病理学。此外，在存在旁路途径C3转化酶过度活性的疾病中，病理可被恶化。这些疾病包括，但不限于，类风湿性关节炎，阵发性夜间血红蛋白血症，多发性硬化，疟疾感染，阿尔茨海默病，与年龄相关的黄斑变性，与动脉粥样硬化。本发明的目的是提供成功治疗这些疾病的方法。对大型库的有机化合物进行了筛选，目的是寻找，任何可能有希望是这些途径的选择性抑制剂。市售的“金精三羧酸”是通过初步筛选试验的唯一物质。申请人发现，该产品仅仅含有少量金精三羧酸。它主要由高分子量物质的复合物组成。申请人分离粗物质和对小于1kDa分子量的成分的性质进行了研究。所需的性能在真实金精三羧酸(ATA，MW422)，金精四羧酸(AQA，MW572)，金精六羧酸(AHA，MW858)，以及它们的组合中被发现，申请人将所述组合在此处称为低分子量金精三羧酸复合物(ATAC)。
相关公开出版物
专利文件
McGeer等人美国 专利申请13/195,216,2011年八月一日提交的。
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发明的披露
技术问题：多年来，一直被已知的是，超过内源性控制因素的限制的补体激活，可导致有生活力的宿主组织自损伤。损伤的器官和细胞可能是脑和脊髓的细胞，尤其是神经元和少突胶质细胞；视网膜细胞，尤其是色素上皮细胞；心脏和动脉肌细胞；关节细胞(joint cell)和肾细胞。迄今尚无令人满意的治疗各种疾病的方法，所述疾病在这些器官和组织中产生这种不期望的补体活化。
解决问题的方案
技术方案：
这个总的问题的解决方案是施用单独或组合的ATA，AQA，AHA和它们的衍生物，施用它们的剂量足以选择性阻断在这些组织中C3转化酶和补体膜攻击复合物的形成。可以将活性成分口服给药，静脉内给药，皮下给药，或通过直接注射到受影响的区域，如发炎的关节或肌肉。
发明的有利的效果
有利的效果。所述效果将防止不期望的补体活化导致的进一步的自我损害，伴有病理改善。
附图说明
图1.表明在阿尔茨海默病中激活的补体经典途径，和在年龄相关性黄斑变性中激活的补体旁路途径的标准的图示。注意，膜攻击复合物的组装在经典途径和旁路途径中都是常见的。
图2.显示了小于1kDa的金精三羧酸合成复合物(ATAC)的三个组成的推定结构和质量，具有分离的组分的相应的质谱分析。(a)ATA，MW422(5,5’-((3-羧基-4-氧代环己-2,5-二烯-1-亚基)亚甲基)双(2-羟基苯甲酸)(b)AQA，MW572(推定结构5,5-((3-羧基-5((3羧基-4-氧代环己-2,5-二烯-1-亚基)甲基)-4-羟基苯基)亚甲基)双(2羟基苯甲酸))(c)AHA，MW858(推定结构，5.5’-((3-羧基-5((3-羧基-4-氧代环己-2,5-二烯-1-亚基)甲基)-4-羟基苄基)-4-羟基苯基)亚甲基)双(2-羟基苯甲酸))。ES是指负的扫描模式，为真实质量给出-1的值。ES+表示阳性扫描模式，为真实质量给予+1的值。
图3.展示了人类和大鼠血清CH50分析。注意各成分具有几乎相同的IC50值。它们为(nM)，对于ATA为544，对于AQA为576，对于AHA为559，和对于ATAC为580。在大鼠血清ATAC的IC50为268nM。
图4.显示，蛋白质印迹分析表明，ATA，AQA，AHA，和ATAC通过阻断C9附着至C5b678选择性作用，因此防止膜攻击复合物的形成。采用等分ATA，AQA，AHA和ATAC水溶液对正常人血清进行预先处理，之后添加致敏的绵羊红细胞至人类补体。反应混合物在37℃孵育1小时。等分被装载至10％聚丙烯酰胺凝胶上，并且进行SDS-PAGE。蛋白质转移到膜，和采用适当的补体蛋白一抗发展(表1)：(a)采用C1q，C3，C4和C5的抗体发展膜的蛋白质印迹。泳道1，未经处理的血清；泳道2，加入红细胞的血清；泳道3，含红细胞的血清，其采用ATAC保护。注意，在未经处理的血清中，C1q，C3，C4和C5的谱带容易检测到。在泳道2和3，激活产物C3d，C4d，和C5a被检测到，指示发生调理作用。在泳道2，检测到MAC，但不是在泳道3，表明ATAC阻断MAC的形成。为了分析MAC形成中的哪些步骤被涉及，对于(b)ATAC，(c)ATA，(d)AQA和(e)AHA，蛋白质印迹膜被用C6，C7，C8和C9的抗体处理。结果是相同的。在每一个实验组中，泳道1是血清，泳道2是不受保护的红血细胞，泳道3是采用ATA，AQA，AHA，或ATAC保护的红血细胞，和泳道4与泳道3是一样的，但采用C9蛋白质补充。结果表明，C6，C7，C8和C9在未经处理的血清中容易检测到。泳道2显示，在无保护的被补体攻击溶血的红细胞中，只有C5b-9，完全形成的膜攻击复合物，被检测。泳道3，其中的细胞得到ATA，AQA，AHA或ATAC的保护，膜攻击复合物不完全形成，而在C8阶段被停止。C6抗体检测C5b6，C5b67和C5b678。C7抗体检测C5b67和C5b678，而C8抗体检测C5b678。泳道4确认了，阻断仅发生在C9阶段。可以看出，现在通过采用C6，C7，C8和C9探查而检测C5b-9，从确定了，ATAC阻断在C9阶段。一个非常微弱的C9谱带在印迹中仍然是可见的，表明不是所有添加的C9在过程中被消耗。
图5.展示采用备解素，C3/C3b，因子B/Bb和因子D的抗体发展的膜的印迹，证明C1抑制剂或C4b抗体抑制经典途径激活的效果，并显示ATA抑制C3转化酶。(a)正常血清显示可检测的备解素，C3，因子B和因子D的谱带(泳道1)。在C1抑制剂存在下激活酵母聚糖后，对应PC3b，PC3bBb和PC3bBbC3b的谱带出现在采用备解素和C3b抗体发展的印迹，并且PC3bBb和PC3bBb和PC3bBbC3b的谱带出现在采用因子Bb抗体发展的印迹(泳道2)。这些数据表明，备解素是C3b结合所需的，以启动旁路途径，C3和C5转化酶被激活。ATA的加入导致谱带，其只针对PC3b和PC3bB而出现，指示在结合的因子B的因子D裂解阶段的阻断(泳道3)。泳道4，其中备解素被加入，和泳道5，其中因子D被加入，都会显示为PC3bBb和PC3bBbC3b弱谱带再现，指示旁路途径激活的部分恢复。在红细胞膜上没有检测到因子D的谱带，表明该蛋白酶没有被结合，而仍在溶液中。进行三个独立的实验，这些都是代表性的。(b)残留血清蛋白质印迹采用C5/C5a抗体发展。正常血清中容易检测到C5谱带(泳道1)。酵母聚糖和C1抑制剂的处理导致C5谱带的消失和激活产物C5a的出现(泳道2)。ATA和C1抑制剂的加入(泳道3)防止C5的裂解，这是被采用备解素的处理部分拮抗(1microgm/ml，泳道4)和因子D(0.1microgm/ml，泳道5)。(c)采用C5/C5b，C6，C7，C8和C9的抗体处理残留的膜。正常血清泳道1显示，正常血清中检测到每个补体蛋白。用酵母聚糖和C1抑制剂血清处理后膜的泳道2导致的各个蛋白谱带消失和MAC形成成分C5b6，C5b67，C5b678，和完全形成的C5b-9的出现。在其中添加ATA的泳道3显示，完全阻断出现，没有激活谱带出现在膜上。泳道4和5，其中血清补充了备解素和因子D，表明补体系统的部分激活，伴有C5b6，C5b67，和C5b678的较弱谱带出现，但在C5b-9阶段仍然存在阻断，表明ATA也阻断C9附着至C5b-8。
图6.是ATA结合至因子D和C9的图，但ATA不被结合至备解素，因子B，C2，C3，C4，C5，C6，C7，或C8。这些蛋白以1-32ng/ml的浓度被应用于微孔板，随后以100微克/ml加入ATA。
图7.是旁路补体途径示意图，说明在C3转化酶和ATA在C9附着至C5b-8阶段的阻断。
图8.显示在ATAC和ATAC甲基衍生物的人血清中CH50结果的比较。甲基衍生物具有比ATA低的有效性，伴有估计的2.52miroM的IC50。
图9.表明口服ATAC对小鼠血清补体活化的效果。六只喂正常饲料的B6SJL-Tg小鼠血清被合并，与六只喂ATAC补充饲料的B6SJL-Tg小鼠的血清相比较。血清进行1-16倍稀释。溶液(25微升)与100微升的抗体缀合的绵羊红细胞(5×106细胞)孵育1h。对混合物进行离心，相对量的血红蛋白释放到100微升上清，其被在405纳米的吸光度记录。来自正常饮食喂养的小鼠的血清需要比ATAC喂养的小鼠更多的稀释，为了溶血的发生。IC50分别为6.89和1.92倍，分别对应于3.59倍的保护。
图10.显示ATAC喂养的B6SJL-Tg小鼠的记忆保留，与正常饲料喂养的B6SJL-Tg小鼠相比较，如通过在测试第6天去除隐藏的平台后在隐藏的平台附近搜索率所评估的。与饲喂正常饲料的小鼠相比，ATAC喂养的小鼠表现出在缺失平台的正确的区域显着更大的搜索时间，这表明更好的记忆保留。
表1.列出被用于在蛋白质印迹中检测补体的抗体。
实施本发明的最佳模式
最佳模式对有需要的人或动物递送ATA，AQA，AHA，其铵盐或其他盐，其甲基或其他衍生物，或它们的混合物的优选模式是通过口服途径。胶囊或丸剂与上述活性成分的任何组合可以采用可接受的常规药物载体配制，以延长活性成分的释放，提高活性成分的效率，减少活性成分的代谢。这些可能包括，但不限于，乳糖，硬脂酸，丙二醇，纤维素或其他成分，这是本领域技术人员众所周知的。活性成分的剂量可以从50毫克到10克/天进行变化，取决于每个特定主体的需要。
发明的模式
发明的模式：除了优选模式，递送的替代模式，包括静脉内，皮下，并直接注入关节或肌肉。这些模式会在以下情况下成为理想的：口服给药是不可能，或在一些局部的部位高浓度是必要的或期望的。
工业适用性
本发明应为脑和外周器官多种慢性退行性疾病开发了主要新治疗领域，对于所述疾病目前尚无满意的治疗。这些疾病包括，但不限于，阵发性夜间血红蛋白血症，类风湿关节炎，多发性硬化症，疟疾感染，阿尔茨海默病，老年性黄斑变性，与动脉粥样硬化。
不含序列列表的文本
序列列表的文本

Claims (18)

1.医疗方法，所述方法在有需要的人或其它哺乳动物物种中选择性抑制补体膜攻击复合物，所述方法通过口服或肠胃外施用有效量的分子量小于1千道尔顿的金精三羧酸复合物的成分。
2.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制是剂金精三羧酸。
3.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制剂是金精四羧酸。
4.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制剂是金精六羧酸。
5.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制剂是分子量小于1千道尔顿的金精三羧酸复合物的酯。
6.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制剂是需要的病症是年龄相关性黄斑变性。
7.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制剂是需要的病症是阿尔茨海默病。
8.权利要求1中所述的方法，其中膜攻击复合物的选择性抑制剂是需要的病症是动脉粥样硬化。
9.权利要求1中所述的方法，其中在所有疾病中，可以明确地确定的是，在所述疾病中，补体膜攻击复合物在宿主细胞组装，导致自我损害。
10.医疗方法，所述方法在有需要的人或其它哺乳动物物种中选择性抑制补体旁路途径的C3转化酶步骤，所述方法通过口服或肠胃外施用有效量的分子量小于1千道尔顿的金精三羧酸复合物的成分。
11.权利要求10中所述的方法，其中在C3转化酶的选择性抑制剂是金精三羧酸。
12.权利要求10中所述的方法，其中在C3转化酶的选择性抑制剂是金精四羧酸。
13.权利要求10中所述的方法，其中C3转化酶的选择性抑制剂是金精六羧酸。
14.权利要求10中所述的方法，其中C3转化酶的选择性抑制剂是需要的病症是类风湿性关节炎。
15.权利要求10中所述的方法，其中C3转化酶的选择性抑制剂是需要的病症是阵发性夜间血红蛋白血症。
16.权利要求10中所述的方法，其中C3转化酶的选择性抑制剂是需要的病症是疟疾感染。
17.权利要求10中所述的方法，其中C3转化酶的选择性抑制剂是需要的病症是多发性硬化症。
18.权利要求10中所述的方法，其中在所有疾病中，能明确地确定的是，在所述疾病中，C3转化酶在宿主细胞组装，导致自我损害。
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