CN104644735A - 新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。本发明的有益效果为：本发明提供的新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用，通过实验对新疆鼠尾草总酚酸提取物的安全性作出客观、科学的评价，为防治DN的实验研究提供了剂量依据，首先通过小鼠的经口急性毒性实验确定其半数致死量（LD₅₀），在此基础上，通过体内动物实验，确定了新疆鼠尾草总酚酸提取物对DN的防治作用及其可能的作用机制，为天然药物防治DN提供实验依据，也为进一步开发和利用新疆鼠尾草提供技术资料。

Description

新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物制备领域，具体涉及新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术

糖尿病肾病(DN)是糖病最常见和最严重的微血管并发症之一，是导致慢性肾功能不全的常见原因，也是糖尿病患者致死、致残的重要原因。DN的防病机制较为复杂，如何有效地治疗DN是目前研究者面临的一个重大的难题。天然药物防治DN的实验研究和临床应用有较多报道，尝试从分子生物学及基因水平对DN的保护也有探索。新疆鼠尾草(Salvia desertaSchang)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia L)植物，拉丁学名含义为荒漠鼠尾草，因分布在新疆戈壁荒原而得名，亦称新疆丹参(Salvia deserta Shang的根或根茎)，在我国新疆北部有广泛的分布。新疆鼠尾草为多年生草本植物，在民间以全草用药，用于清热解毒、止咳祛痰、消肿利尿。在前期的研究中发现，新疆鼠尾草水溶性提取部位具有一定的抗氧化活性，能够降低糖尿病小鼠中MDA的含量，改善糖尿病小鼠的肾脏病变。而酚酸类成分是新疆鼠尾草中的主要水溶性成分，新疆医科大学分离得到了两个比较重要的化合物：丹酚酸K与迷迭香酸，对其药理学初步研究发现它们具有较强的抑制醛糖还原酶的作用，文献调研也发现迷迭香酸及其它的酚酸类成分具有明显的抗氧化活性。但目前关于新疆鼠尾草对DN的防治作用及其作用机制的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，结合DN的防病机制，提供了新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

进一步的，上述的应用，所述新疆鼠尾草提取物为新疆鼠尾草总酚酸提取物。

进一步的，上述的应用，所述新疆鼠尾草总酚酸提取物的制备方法为：将新疆鼠尾草药材加25倍量40％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，回收溶剂后制备得到新疆鼠尾草总酚酸提取物。

进一步的，上述的应用，所述新疆鼠尾草总酚酸提取物的给药剂量为150mg/kg-600mg/kg。

本发明的有益效果为：本发明提供的新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用，通过实验对新疆鼠尾草总酚酸提取物的安全性作出客观、科学的评价，为防治DN的实验研究提供了剂量依据，首先通过小鼠的经口急性毒性实验确定其半数致死量(LD₅₀)，在此基础上，通过体内动物实验，确定了新疆鼠尾草总酚酸提取物对DN的防治作用及其可能的作用机制，为天然药物防治DN提供实验依据，也为进一步开发和利用新疆鼠尾草提供技术资料。

附图说明

图1为对糖尿病大鼠血糖的影响(n＝6)结果。

图2为对糖尿病大鼠各项血脂水平的影响(n＝6)。

图3为对糖尿病大鼠血清肌酐及血尿素(n＝6)。

图4为对糖尿病大鼠血清ALT及AST含量的影响(n＝6)。

图5为对糖尿病大鼠血清SOD及MDA含量的影响(n＝6)。

图6为对糖尿病大鼠血浆中NO含量的影响(n＝6)。

图7为对糖尿病大鼠血清中AGEs含量的影响(n＝6)。

图8为对糖尿病大鼠血清TNF-α含量的影响(n＝6)。

图9为对糖尿病肾脏组织学病变的影响(10×40倍)。

图10为不同组别大鼠肾脏组织TGF-β₁免疫组化结果(10×40倍)。

图11为不同组别大鼠肾脏组织VEGF免疫组化结果(10×40倍)。

图12为免疫组化染色IOD值(n＝125)。

具体实施方式

实施例1：

新疆鼠尾草总酚酸提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用，新疆鼠尾草总酚酸提取物的制备方法为：将新疆鼠尾草药材加25倍量40％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，回收溶剂后制备得到新疆鼠尾草总酚酸提取物。

新疆鼠尾草总酚酸提取物的给药剂量为150mg/kg-600mg/kg。

验证实验内容：

1、研究内容与方法：

1.1小鼠急性毒性实验：

1.1.1材料和动物：

1.1.1.1供试品：

按新疆鼠尾草总酚酸的最佳提取工艺制备得到新疆鼠尾草总酚酸提取物，褐色粉末，应用时以蒸馏水配制成所需浓度。

1.1.1.2实验动物：

健康昆明种小鼠，体重20.0±2.0g，雌雄各半，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(新)2011-0004。

1.1.1.3实验条件：

饲料来源及证号：SPF级实验动物环境设施合格证号：SCXK(新)2011-0004；环境温度：22±2℃；相对湿度40～70％，全部动物自由饮食饮水。

1.1.2实验方法：

1.1.2.1预实验：

取昆明种小鼠20只，体重20.0±2.0g，雌雄各半，平均随机分为两组，每组各10只，雌雄各半。首先称取一定量的新疆鼠尾草总酚酸提取物，将其配成最大浓度的溶液(1.3g·mL^-1)，给第一组动物每只灌胃给药0.4mL/10g。间隔6小时后，按上述条件灌胃第二次，一日总剂量相当于52g·Kg^-1提取物。第二组动物每只灌胃给与新疆鼠尾草总酚酸提取物溶液(0.65g·mL^-1)0.4mL/10g。间隔6小时后，按上述条件灌胃第二次，一日总剂量相当于26g·kg^-1提取物。两组动物给药后连续观察7天，观察动物的反应情况，并记录动物的外观，行为活动，精神状态，食欲，大、小便及其颜色，被毛、肤色、死亡情况。预试实验目的是为了找出引起动物10％和90％死亡的剂量，即LD₁₀和LD₉₀，以便安排正式实验。

1.1.2.2急性毒性实验：

取健康昆明种小鼠50只，雌雄各半。适应性喂养3天后，按体重随机分为5组，每组10只。取受试药物，按预实验结果设计出的实验浓度配制溶液，以0.4mL/10g体重灌胃给药，连续2次，给药间隔6小时，给药后连续观察14天。观察动物出现的死亡情况，记录动物死亡数。

1.1.2.3计算：

(1)i值的计算：

公式如下：求得值后以最低剂量组的对数值加上一个i值即是第二个剂量组的对数剂量，依次推至最高剂量组，查各自反对数及得出各组剂量的真实值。

$i=\frac{\lg {\mathrm{LD}}_{90}-\lg {\mathrm{LD}}_{10}}{n-1}$

i：表示相邻的两个剂量组剂量对数之差；n：设计的剂量组数；

(2)LD₅₀的计算：

公式如下：

m＝X_k-i(Σp-0.5)  

其中：m：1gLD₅₀；Sm：标准差；Σp：各组死亡率总和；p：各组死亡率；q：1-p；i：相邻两组剂量对数值之差；n：每组动物数，X_k：最大剂量的对数值。

1.2新疆鼠尾草总酚酸对糖尿病肾病的防治作用：

1.2.1材料与试剂：

1.2.1.1动物：

雄性SD大鼠110只，体重180±20g，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(新)2011-0004，分笼在清洁级实验室饲养，自由进食水，通风干燥、安静。

1.2.1.2饲料：

所需普通大鼠饲料和高糖高脂饲料均购置新疆医科大学实验动物中心。高糖高脂饲料配方：100千克高糖高脂饲料中含有蔗糖15％，香油0.5％，花生10％，猪油5％，胆固醇2％、胆酸钠0.5％，其余为基础饲料。以上原料充分混匀，压制成型、晾干，备用。

1.2.1.3试剂：

盐酸二甲双胍片：北京京丰制药有限公司；链脲佐菌素(STZ)：Sigma公司，置-20℃放置；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；丙二醛(MDA)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；NO测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；戊巴比妥钠：Sigma公司；大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA kit：CUSABIO；大鼠晚期糖基化终末产物(AGEs)ELISA Kit：CUSABIO；兔抗大鼠TGF-β多克隆抗体：武汉博士德生物有限公司；兔抗大鼠VEGF多克隆抗体：武汉博士德生物有限公司；DAB显色试剂盒：武汉博士德生物有限公司。

1.2.1.4仪器：

离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；酶标仪：Bio-Rad，China xMarkTM；电热恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司；型号：GL-88B)；DMXY生物显微镜：宁波舜宇仪器有限公司；电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司；型号：DNP-9272)；血糖仪：三诺生物传感股份有限公司；微量移液器：大龙医疗设备有限公司。

1.2.2实验方法：

1.2.2.1高糖高脂饮食糖尿病大鼠模型的建立：

SD大鼠适应性喂养1周后，从中随机抽取12只作为正常对照组，其余大鼠作为糖尿病组，正常对照组大鼠喂养普通饲料，而糖尿病组大鼠喂养高糖高脂饲料，自由饮水。喂养4周后，糖尿病组大鼠禁食24h，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg·Kg^-1(用pH4.4的0.1mol·L^-1的枸橼酸酸-枸橼酸钠缓冲溶液配成1％的溶液，置于冰上，现用现配)。一周后断尾取血，用血糖仪测定血糖值，选择空腹血糖大于10mmol·L^-1的大鼠为糖尿病大鼠模型。

1.2.2.2高糖高脂糖尿病大鼠的分组及给药方案：

糖尿病大鼠造模结束后，称重，随机分为5组，每组10只大鼠。分别为糖尿病对照组，糖尿病二甲双胍治疗组(250mg·kg^-1)，新疆鼠尾草总酚酸提取物低剂量组(150mg·kg^-1)，中剂量组(300mg·kg^-1)，高剂量组(600mg·kg^-1)。给予高糖高脂饲料，自由饮水，2只大鼠/笼，每天换1次垫料。每日灌胃给药1次(将药物用蒸馏水溶解，灌胃前现配)。连续给药4周，每周测一次体重，观察毛色、尿量、健康状况及精神状态。

1.2.2.3大鼠各标本的采集：

(1)血标本的采集：

大鼠灌胃给药4周后，禁食24h，腹腔注射1％的戊巴比妥钠麻醉动物，腹主动脉取血，分为两份，一份用EDTA抗凝管保存，另一份离心后取血清，-40℃保存，测定各项指标。

(2)肾脏标本的采集：

切取肾脏，纵剖为两片，取一片于10％甲醛溶液中固定48h，常规制备石蜡切片，进行常规组织形态学检查和免疫组化染色。另一片速冻于液氮中，置于-80℃冰箱中保存备用。1.2.2.4观察指标及检测方法：

(1)一般状态观察：

每日观察动物精神状态、毛色、饮食情况、尿量、活动情况，每周称量各组大鼠体重一次。

(2)血清血糖、血脂等指标的测定：

全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中血糖、血脂各项指标、血肌酐、血尿素、谷丙转氨酶及谷草转氨酶的水平。

(3)血清中SOD、MDA含量的测定：

SOD活力采用黄嘌呤氧化酶法测定。其测定原理是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，在550nm处有最大吸收，用可见分光光度计在此波长条件下测定其吸光度值。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基具有专一的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时，测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD活力。具体操作步骤及计算公式见试剂盒说明书。

MDA的含量测定采用TBA法，其测试原理为：机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化产物MDA，而MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。比色时，测定管的吸光度值高于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中MDA。具体操作步骤及计算公式见试剂盒说明书。

(4)血浆中NO含量的测定：

测定方法：采用化学方法测定，实验原理为：NO遇氧及水生成硝酸盐及亚硝酸盐，后二者遇硝酸盐显色剂可生成淡红色偶氮化合物，通过比色可间接测出NO的浓度。具体操作步骤及计算公式见试剂盒说明书。

(5)血清中TNF-α及AGEs的测定：

①测定方法：

用ELISA法测定，实验原理为：该试剂盒应用双抗体夹心法。固相抗体由微孔板被特异性抗体包被制成，将样品依次加入包被单抗的微孔中后，再与抗体结合，而这个抗体是被辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物四甲基苯胺(Tetramethyl benzidine，TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化最终呈黄色。颜色的深浅和样品中待检测物质呈正相关。

②试剂配制：

取一支标准品于6000-10000rpm离心30秒。用1mL样本稀释液溶解，充分混匀得到标准品S7，放置备用；再取6支Eppendof管，分别吸取一定量的标准品溶液S7按表1所列的标曲梯度的制备方法进行系列倍比稀释后，稀释成125μg·ml^-1，62.5μg·ml^-1，31.25μg·ml^-1，15.6μg·ml^-1，7.8μg·ml^-1，3.9μg·ml^-1的6个浓度的标准品溶液，样品稀释液直接作为标准浓度0μg·ml^-1，临用前30分钟内配制。将洗涤工作液用去离子水按1∶25倍进行稀释。用生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1∶100)配制成生物素化抗体工作液，使用前10min准备。用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释辣根过氧化物酶标记亲和素(1∶100)，配制成辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，使用前10min准备。表1为标曲梯度的制备方法。

表1

编号	浓度(μg·ml-1)	制备方法
			S7	250	原液(A)
S6	125	250μl A+250μl样品稀释液
			S5	62.5	250μl A+250μl样品稀释液
S4	31.25	250μl A+250μl样品稀释液
			S3	15.6	250μl A+250μl样品稀释液
S2	7.8	250μl A+250μl样品稀释液
			S1	3.9	250μl A+250μl样品稀释液
S0	0	样品稀释液

③操作步骤：

将各种试剂移至室温平衡30min，按前述方法配制试剂，备用。设标准孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2h。弃去液体，甩干，不用洗涤。再在每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆盖新的板条，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，200μL/每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆盖新的板条，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2min，200μL/每孔，甩干。再依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色30min。然后依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。在反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度值。

④计算：

以标准品的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线的直线回归方程式，将样品的光密度值代入回归方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

(6)肾脏形态学观察：

肾脏常规进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光镜下观察肾小球大小、结构、系膜细胞数量、系膜基质增生情况等。

(7)免疫组化染色：

采用SP法免疫组化染色，观察TGF-β₁及VEGF在大鼠肾组织的表达情况。主要步骤如下：将制作好的肾脏切片置于恒温箱中30mim至1h；所有切片进行常规二甲苯脱蜡，分别在三缸二甲苯中放15min，以除去组织中的石蜡；再将脱蜡后的组织切片进行梯度酒精水化(100％的酒精中浸泡3min，95％的酒精浸泡1min，80％的酒精浸泡1min，75％的酒精浸泡1min)，然后将石蜡切片浸泡于蒸馏水中2min，除去酒精；将切片放入盛有pH为6.0的枸橼酸修复液的容器中，置于微波炉内加热，中火10min，中高火5min，使容器内液体保持在92～98℃之间条件下抗原修复；将修复的组织切片从修复容器中取出，室温冷却30～40min，再用pH7.6的磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)冲洗3次，每次3min；为了清除内源性过氧化酶，在室温下用3％H₂O₂溶液封闭切片15～20min；滴加30μL一抗(一抗稀释度1∶100)，4℃孵育过夜使抗原抗体结合，次日滴加二抗，37℃恒温孵育1小时，然后用PBS缓冲液漂洗3min×3次；将配置好的显色剂二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)滴加在切片上，在显微镜下控制显色，当显色完成后马上用蒸馏水冲洗终止显色，以免显色过度；将石蜡切片苏木素复染10～50秒，自来水冲洗完后放入60～70℃热水进行返蓝，并用酒精梯度脱水：75％，80％，95％，100％各1min；再在三个二甲苯缸内分别放1min，使之透明；然后中性树胶封片即得。制备完成的切片用光镜观察(呈棕褐色为阳性反应，蓝色为苏木精复染细胞核着色)。每组大鼠取5张染色切片，每张切片在10×40的高倍显微镜下随机选取25个不重复视野，用Image-pro plus 6.0计算机图象分析处理系统进行分析，以每个视野棕黄色着色的积分光密度值(Integral optical density，IOD)总和作为其表达量，IOD值总和越大，其阳性表达越强，以均值计算每组动物标本的IOD值总和。

1.3统计学方法：

所有数据用均数±标准差()表示，显著性差异采用SPSS16.0软件，组间差异用单因素方差分析进行统计学检验，P＜0.05或P＜0.01为具有统计学意义。

2结果：

2.1急性毒性实验：

2.1.1预实验结果：

第一组动物两次灌胃后，动物出现精神萎靡，活动迟缓，反应迟钝，出现稀遍。至第二天已有8只小鼠死亡，至实验结束，还剩1只小鼠。第二组小鼠灌胃后，动物精神萎靡，活动迟缓，反应迟钝，但24h后活动慢慢恢复正常，至实验结束时，仅有1只小鼠死亡。根据这两组动物的死亡情况，确定了小鼠死亡10％和90％的剂量范围，然后根据公式计算出i值为0.075，从而设计出每组的给药剂量。

2.1.2急性毒性实验结果：

各组动物灌胃后，均出现活动下降，反应迟缓，至实验结束，各组动物均陆续出现死亡。具体实验结果见表2。按此结果，根据LD₅₀的公式计算，得出新疆鼠尾草总酚酸40％乙醇提取物小鼠灌胃的半数致死量LD₅₀＝41.45g·kg^-1，LD₅₀的95％可信区间为39.85～43.11g·kg-1。表2显示为新疆鼠尾草提取物小鼠半数致死量(LD₅₀)计算表。

表2

2.2总酚酸提取物防治糖尿病肾病的作用：

2.2.1各组大鼠一般状况及死亡情况：

正常对照组大鼠在整个实验期间饮食、饮水及大小便均正常，精神状态良好，体重增加，毛色光亮，反应灵敏，无死亡。其余大鼠高糖高脂饲料喂养4周，注射STZ造模1周后，大部分大鼠饮水量、摄食量增加，尿量增多，活动减少，体毛干枯无光泽，精神萎靡，反应迟钝，拱背蜷卧。给药期间及实验结束，糖尿病大鼠“三多一少”症状未得到缓解，体重明显降低，体毛松散无光泽，状态差。给药组大鼠整体状况较模型组有所改善，实验过程中，模型组及各给药组均陆续有大鼠发生死亡。

2.2.2新疆鼠尾草总酚酸对糖尿病大鼠血糖的影响：

各组糖尿病大鼠空腹血糖明显高于正常对照组(P＜0.01)。新疆鼠尾草总酚酸提取物处理4周后，糖尿病模型组大鼠血糖仍处于较高水平，与糖尿病模型组相比，新疆鼠尾草提取物处理组大鼠血糖降低，尤其是中剂量组降低较显著(P＜0.05)，对糖尿病大鼠血糖的影响(n＝6)结果见表3和图1，图1中，**P＜0.01vs Normal group；△P＜0.05vs DM group。

表3

组数	血糖(mmol·L-1)
		Normal	7.72±0.32
Model	29.87±1.63**
		阳性对照组	30.64±2.74**
低剂量组	28.64±2.28**
		中剂量组	24.52±5.62**△
高剂量组	27.41±3.24**

2.2.3新疆鼠尾草总酚酸对糖尿病大鼠血脂的影响：

如表4，图2所示，给药4周后糖尿病大鼠模型组各项血脂水平均高于正常组(P＜0.01)。与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物中、高剂量组使血清中甘油三酯及低密度脂蛋白的含量显著性降低，具有统计学差异(P＜0.01，P＜0.05)；新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组能够降低血清中总胆固醇的含量，但与模型组相比，无统计学差异。表4为对糖尿病大鼠各项血脂水平的影响(n＝6)，图2为对糖尿病大鼠各项血脂水平的影响(n＝6)，图2中，**P＜0.01，*P＜0.05vs Normal group；△△P＜0.01，△P＜0.05vs DM group。

表4

组数	TG(mmol·L-1)	TC(mmol·L-1)	LDL(mmol·L-1)	HDL(mmol·L-1)
					Normal	0.44±0.10	1.90±0.36	0.70±0.24	0.92±0.22
Model	9.36±2.30**	18.83±1.66**	23.15±1.42**	1.42±0.25**
					阳性对照组	4.47±1.62**△△	14.57±4.05**	13.34±2.46**△△	1.13±0.19
低剂量组	7.99±2.91**	16.73±1.98**	17.63±2.30*	1.21±0.23
					中剂量组	3.38±0.92△△	15.42±4.12**	12.40±2.26*△	1.14±0.33
高剂量组	3.42±1.11△△	15.39±12.04**	12.04±2.78*△	0.98±0.26△

2.2.4新疆鼠尾草总酚酸提取物对糖尿病大鼠血清中肌酐及血尿素含量的影响：

如表5，图3所示，给药4周后糖尿病大鼠模型组血清中肌酐与血尿素含量均高于正常对照组(P＜0.01)。与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物对血清中肌酐及血尿素水平均有一定的改善作用，其各剂量组均能降低血清中肌酐含量(P＜0.01)，而其低剂量组对血尿素也有一定的降低作用，具有统计学差异(P＜0.05)。表5为对糖尿病大鼠血清肌酐及血尿素的影响(n＝6)，图3为对糖尿病大鼠血清肌酐及血尿素(n＝6)，图3中，**P＜0.01，*P＜0.05vs Normal group；△△P＜0.01，△P＜0.05vs DM group。

表5

组数	Crea(μmol·L-1)	Urea(μmol·L-1)
			Normal	64.32±5.49	6.88±1.13
Model	94.65±12.86**	15.98±4.95**
			阳性对照组	75.87±9.84*△△	15.98±5.25**
低剂量组	72.20±12.34△△	10.89±1.80△
			中剂量组	74.54±6.49△△	17.93±6.84**
高剂量组	75.76±11.58△△	15.65±3.13**

2.2.5新疆鼠尾草总酚酸提取物对糖尿病大鼠血清中转氨酶水平的影响：

给药4周后，大鼠血清中肝功能指标的检测结果表明，与正常组相比，糖尿病大鼠模型组血清中谷丙及谷草转氨酶水平均升高，与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物低剂量组对血清中谷草转氨酶水平具有一定的降低作用，具有统计学差异(P＜0.05)，结果见表6，图4所示。表6为对糖尿病大鼠血清ALT及AST含量的影响(n＝6)，图4为对糖尿病大鼠血清ALT及AST含量的影响(n＝6)，图4中，△P＜0.05vs DM group。

表6

组数	ALT(IU·L-1)	AST(IU·L-1)
			Normal	109.36±20.58	143.14±31.21
Model	109.64±10.78	278.00±57.84
			阳性对照组	110.97±13.51	187.60±19.62
低剂量组	118.29±20.54	155.09±17.09△
			中剂量组	114.75±14.93	170.76±7.13
高剂量组	137.31±17.49	187.00±30.76

2.2.6新疆鼠尾草总酚酸提取物对糖尿病大鼠血清中SOD与MDA含量的影响：

如表7，图5所示，给药4周后，与正常组相比，糖尿病大鼠模型组血清中SOD水平明显降低，MDA水平升高(P＜0.01)。与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组均能显著升高血清中SOD水平，降低血清中MDA含量，结果具有统计学差异(P＜0.01)。表7为对糖尿病大鼠血清SOD及MDA含量的影响(n＝6)，图5为对糖尿病大鼠血清SOD及MDA含量的影响(n＝6)，图5中，**P＜0.01，*P＜0.05vs Normal group；△△P＜0.01，△P＜0.05vs DM group。

表7

组数	SOD(U·mL-1)	MDA(nmol·mL-1)
			Normal	108.88±5.36	7.34±1.65
Model	82.60±4.01**	19.92±1.33**
			阳性对照组	98.32±3.02**△△	13.08±2.20**△△
低剂量组	95.55±2.66**△△	16.92±1.33**△△
			中剂量组	89.20±4.03**△	13.98±1.73**△△
高剂量组	94.37±3.92**△△	14.98±2.37**△△

2.2.7新疆鼠尾草总酚酸提取物对糖尿病大鼠血浆中NO含量的影响：

如表8，图6所示，给药4周后，与正常组相比，糖尿病大鼠模型组血浆中NO水平明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组均能降低血清中NO水平，结果具有统计学差异(P＜0.01)。表8为对糖尿病大鼠血浆中NO含量的影响(n＝6)，图6为对糖尿病大鼠血浆中NO含量的影响(n＝6)，图6中，**P＜0.01vs Normalgroup；△△P＜0.01vs DM group。

表8

组数	浓度(pg·mL-1)
		Normal	7.79±1.58
Model	15.78±0.53**
		阳性对照组	11.53±1.08**△△
低剂量组	13.32±1.07**△△
		中剂量组	12.47±1.28**△△
高剂量组	11.64±1.14**△△

2.2.8新疆鼠尾草总酚酸提取物糖尿病对大鼠血清中AGEs含量的影响：

如表9、图7所示，给药4周后，与正常组相比，糖尿病大鼠模型组血清中AGEs含量明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组均能降低血清中的AGEs水平，结果具有统计学差异(P＜0.01)。表9为对糖尿病大鼠血清中AGEs含量的影响(n＝6)，图7为对糖尿病大鼠血清中AGEs含量的影响(n＝6)，图7中，**P＜0.01vs Normal group；△△P＜0.01vs DM group。

表9

组数	浓度(pg·mL-1)
		Normal	5.51±1.12
Model	196.83±11.19**
		阳性对照组	65.29±11.45**△△
低剂量组	33.87±9.10**△△
		中剂量组	48.64±7.53**△△
高剂量组	57.74±15.49**△△

2.2.9新疆鼠尾草总酚酸提取物对大鼠血清中TNF-α的含量的影响：

如表10、图8所示，给药4周后，与正常组相比，糖尿病大鼠模型组血清中TNF-α含量明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸低剂量组及高剂量组能降低血清中的TNF-α含量，结果具有统计学差异(P＜0.01)。表10为对糖尿病大鼠血清TNF-α含量的影响(n＝6)，图8为对糖尿病大鼠血清TNF-α含量的影响(n＝6)，图8中，**P＜0.01vs Normal group；△△P＜0.01，△P＜0.05vs DM group。

表10

组数	浓度(pg·mL-1)
		Normal	2.37±0.63
Model	3.63±0.63**
		阳性对照组	2.89±0.40
低剂量组	1.89±0.38△△
		中剂量组	3.05±0.36
高剂量组	2.07±0.41△

2.2.10新疆鼠尾草提取物对糖尿病大鼠肾脏组织学病变的影响：

光镜下见正常对照组大鼠，肾小球无明显异常，核仁清晰，无细胞变性、坏死等病理改变(见图9-A)。糖尿病模型组大鼠有不同程度的病理改变，可见肾小球体积增大，细胞混浊肿胀，系膜基质增多，胞浆嗜酸性染色增强，部分毛细血管受压而塌陷，细胞胞核碎裂或消失(见图9-B)。新疆鼠尾草提取物各处理组大鼠肾脏较糖尿病模型组有一定程度改善(见图9-D、9-E、9-F)。图9显示为对糖尿病肾脏组织学病变的影响(10×40倍)。图9中，9-A：正常对照组；9-B：糖尿病模型组；9-C：阳性对照组；9-D：低剂量组；9-E：中剂量组；9-F：高剂量组。

2.2.11免疫组化染色结果：

2.2.11.1新疆鼠尾草总酚酸提取物对大鼠肾组织TGF-β₁表达的影响：

图10为不同组别大鼠肾脏组织TGF-β₁免疫组化结果。可以看出大鼠肾脏TGF-β₁主要存在于系膜细胞胞浆等区域，少量在细胞核内表达。正常对照组未见明显阳性染色区，染色强度为无染色或染色极弱，见图10-A；糖尿病模型组在胞浆内可见大量棕黄色颗粒状阳性物质表达，在细胞核内也有一定量表达，染色浓重，见图10-B；与糖尿病模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组TGF-β₁表达均明显低于糖尿病模型组组。新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组之间无明显差别，染色强度与染色区面积仍比对照组明显。见图10-D、图10-E及图10-F。通过计算机图象分析系统进行测定各组大肾脏阳性染色面积的积分光密度值(IOD)，IOD值总和越大，其阳性表达越强。结果显示，模型组大鼠肾脏组织中IOD值总和远大于正常对照组(P＜0.01)，与糖尿病模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物各剂量组肾脏组织中IOD值总和有明显降低(P＜0.01)，结果见表11，图12。图10为肾脏组织TGF-β1免疫组化结果图(10×40倍)，其中，10-A：正常对照组；10-B：糖尿病模型组；10-C：阳性对照组；10-D：低剂量组；10-E：中剂量组；10-F：高剂量组。表11为免疫组化染色IOD值(n＝125)，图12为免疫组化染色IOD值(n＝125)，图12中，*P＜0.05，**P＜0.01vs Normal group；△△P＜0.01vs DM group。

2.5.11.2新疆鼠尾草总酚酸提取物对大鼠肾组织VEGF表达的影响：

图11为不同组别大鼠肾脏组织VEGF免疫组化结果(10×40倍)，其中，11-A：正常对照组；11-B：糖尿病模型组；11-C：阳性对照组；11-D：低剂量组；11-E：中剂量组；11-F：高剂量组。由图可以看出，阳性表达产物主要位于系膜细胞、毛细血管袢及肾小管上皮细胞。正常对照组未见明显阳性染色区，染色强度为无染色或染色极弱，见图11-A；糖尿病模型组可见肾小球毛细血管袢及肾小管上皮细胞有大量棕黄色颗粒状阳性物质表达，染色浓重，见图11-B；与糖尿病模型组相比，新疆鼠尾草总酚酸提取物处理组VEGF表达均明显低于模型组。新疆鼠尾草提取物各剂量组之间无明显差别，但染色强度与染色区面积仍比对照组明显，见图11-D、图11-E及图11-F。通过计算机图象分析系统进行测定各组大肾脏阳性染色面积的积分光密度值(IOD)。结果显示，模型组大鼠肾脏组织中IOD值总和远大于正常对照组(P＜0.01)，与糖尿病模型组相比，新疆鼠尾草提取物各剂量组肾脏组织中IOD值总和有明显降低(P＜0.01)，结果见表11、图12。

表11

组数	TGF-β1	VEGF
			Normal	9090±1145	7822±1814
Model	69425±17580**	157757±26313**
			阳性对照组	23700±6836**△△	48636±9367**△△
低剂量组	23702±5521**△△	38864±7018**△△
			中剂量组	17368±3340*△△	26207±2047△△
高剂量组	11715±1653△△	26393±4925△△

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.新疆鼠尾草提取物在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新疆鼠尾草提取物为新疆鼠尾草总酚酸提取物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述新疆鼠尾草总酚酸提取物的制备方法为： 将新疆鼠尾草药材加25倍量40%乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，回收溶剂后制备得到新疆鼠尾草总酚酸提取物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述新疆鼠尾草总酚酸提取物的给药剂量为150mg/kg-600mg/kg。