CN104630245A - 5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对 - Google Patents

Abstract

本发明涉及5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对，及生成和使用它们的方法。

Description

5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对

发明领域

本发明涉及5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对，及生成和使用它们的方法。

发明背景

5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）是真菌、细菌、藻类、高等植物及寄生于脊椎动物上的寄生虫顶覆虫体内芳香族氨基酸合成途径（即莽草酸合成途径）中一个关键酶，它催化一分子的莽草酸-3-磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸（EPSP）。莽草酸合成途径产物除参与芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等的合成以外，还参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、吲哚衍生物、酚类物质等的次生代谢，形成的植物组分占植物干重的大约35%甚至更多。

草甘膦，即N-膦酰甲基甘氨酸，是一种广谱、高效的发芽后除草剂。草苷膦一经施用后能被植物迅速吸收，并随其同化产物传导至整个植株，阻断EPSP的合成和运输，它是EPSPS合成底物PEP的竞争性抑制剂，可阻断PEP和S3P这两种底物在EPSPS的催化下向EPSP的转化，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，因此对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡。

环式重排（circular permutation，CP）是一种重要的蛋白质定向进化分析的手段。蛋白质的环式重排是将蛋白质的一级序列进行重排，比如说在将一个特定位点的N端移动到这个特定位点C端的C端，即使得原来该点的C端成为了新的蛋白质变异体的N端，该点的原来的N端成为新蛋白变异体的C端。一般来说新的N端和C端之间要加一个柔韧性较好的接头，促进新蛋白质的折叠。简单来说相当于用一个接头将蛋白质原来的N端和C端相连，然后在蛋白质的内部某一个位点“剪开”，产生新的N端和C端（如图1所示）。

在自然界中已经发现了一些蛋白质环式重排变异体，产生机制一般有两种类型，分别是复制/删除机制以及分裂融合机制。对于前者来说，一个基因发生了水平串联复制，然后在N端和C端发生了任意剪切，造成了环式重排变异体的形成。对于后者来说，一个已有的蛋白的分裂产生了两个蛋白结构域或者蛋白质的片段，它们直接的重新融合产生了新的环式重排变异体。这些新的蛋白质重排变异体大多数依旧可以折叠成与天然蛋白质类似的三维结构，所以依旧拥有与天然蛋白质类似的功能。当然这些变异体一般情况下活力不如原来的母体，个别可能拥有更高的活力，但是这些变异体经常会拥有一些特殊功能，比如说对蛋白酶裂解的敏感性降低、识别更广谱的底物或者配体、更高的热稳定性，所以近年来环式重排作为一种改造蛋白质特性的手段得到了研究人员越来越多的关注。

蛋白质片段互补，1957年Richards发现，用蛋白酶裂解核糖核酸酶A后得到两个只有很少酶活性的肽链－S蛋白和S肽链，将两者混合在一起可以恢复其核糖核酸酶的活性，这被称之为蛋白重建（protein reconstitution）。后来，人们又发现许多蛋白可以由其两个或两个以上的片断成功重建，这些片断既可以由蛋白酶消化产生，也可以通过基因表达的方法生成，例如葡萄球菌的核酸酶、色氨酸抑制子等。这些可以拆分的蛋白无论大小都可能包含一个以上的能成功使蛋白重建的分拆位点，如氨酰tRNA合成酶有939个氨基酸，含有至少八个这样的分拆位点。

用于蛋白重建的片段通常包括整个结构单元或者超二级结构域。蛋白能够重建表明该蛋白至少可以在两个二级结构之间的片段区域中的共价键断开后仍旧保持一定的片段稳定性，而蛋白内的非共价作用则十分特殊，从而使片段有利于向天然的结构靠拢，却不形成其它的异变结构。在生物进化过程中，这类蛋白中使其形成天然结构的非共价作用被极大的优化，从而利于形成天然的结构元件或亚结构域。因此无论是一个完整的肽链还是两条肽链，两个没有共价键相连的亚结构域可以自发的形成天然的蛋白结构。

蛋白质的片段互补已经被用作研究结构域排列的工具，也被用作研究早期折叠中间态的模型。结合定点突变的蛋白重建可以用来评价单个氨基酸侧链对蛋白稳定性的影响，结合噬菌体展示可以确定两个片段之间起主要相互作用的位点。重建的蛋白并非一旦结合就永不分开，其片段在形成复合体和解离成单独的片段之间形成动态平衡，这种平衡的偏移方向取决于片段之间作用力的强弱。

最新的研究表明，大肠杆菌的EPSPS也可以由片段天然互补重建其酶活性。把其基因在218/219氨基酸位点分拆为两段后，编码出的两个片段在aroA缺陷的大肠杆菌菌株体内可以互补其EPSPS活性；将这两个片段分别表达，其单体大多以包含体形式存在，把纯化的包含体共复性，就可以互补重建EPSPS活性。说明大肠杆菌的EPSPS无论在体内还是体外，均能通过片段互补重建其活性。

片段互补可以有效的解决抗草甘膦EPSPS转基因植物扩散的问题，比如将EPSPS的N端编码基因加上叶绿体定位肽编码基因在植物细胞核染色体中表达，而将C端编码基因在叶绿体中表达。单独一个基因表达产生的片段都不具有EPSPS的活性，因此即使扩散到了外界环境，也没有选择优势。而当N端片段表达出后，在定位肽的作用下被运输到叶绿体，和C端片段互补重组EPSPS活性。如果片段互补的EPSPS突变后具有较高的草苷膦耐受性，把其分别转入植物的染色体基因组和叶绿体基因组，植物就可以获得草苷膦耐受性。

但是问题在于，许多结构刚性比较强的蛋白很难找到能够直接发生天然互补的位点，或者说即使可以发生天然互补，效率也比较差。一个潜在的解决方案在于将两个片段分别与可以发生相互作用的两个蛋白质或者可以发生二聚化的结构域融合，通过蛋白质的相互作用或者结构域二聚化使得两个天然无法互补的片段在空间上接近，提高它们相互作用时的浓度，这样就很有可能将帮助两个片段进行互补。但是同样的基于这种方法的位点也不是随机选取的，而且前人的研究成功的实例或多或少都带有一定的经验成分，所以建立一种确定该位点的有效方法很重要。我们实验中建立了将环式重排的位点作为辅助获得蛋白质片段互补的位点的体系。因为环式重排本质上是利用的短的接头，将蛋白质两个片段直接连在一起，使其在空间上靠近，折叠成天然的活性蛋白质。而蛋白质相互作用辅助的片段互补技术是通过蛋白质的相互作用将两个不能天然互补的片段在空间上拉近，使其恢复天然蛋白质的活力，因此两者之间有内在的联系，我们认为环式重排的研究是很好的蛋白质片段互补系统研究的基础。

发明概述

一方面，本发明涉及5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变异体，其从N端到C端以B-L-A表示，其中L代表接头，A代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列N端至第P位的氨基酸区段，B代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸区段。在一个实施方案中，其中所述5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶为大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶。在进一步的实施方案中，所述大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶如序列1所示。在进一步的实施方案中，P选自71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363和364。在进一步的实施方案中，P选自110、145、215、229、300、328和362。在另一个实施方案中，在所述5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶不是序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的情况下，P为与序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶第71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363或364位对应的位置。在进一步的实施方案中，P为与序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶第110、145、215、229、300、328或362位对应的位置。在一个实施方案中，L为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃接头。

另一方面，本发明涉及5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的互补片段对，其中第一片段从N端到C端以E-L1-A表示，第二片段从N端到C端以F-L2-B表示，其中E和F代表相同或不同的二聚化肽，L1和L2代表相同或不同的接头，A代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列N端至第P位的氨基酸区段，B代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸区段，其中当E和F相同时发生同二聚化，或者当E和F不同时发生异二聚化。在一个实施方案中，所述5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶为大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶。在进一步的实施方案中，所述大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶如序列1所示。在进一步的实施方案中，P选自71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363和364。在进一步的实施方案中，P选自110、145、215、229、300、328和362。在另一个实施方案中，在所述5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶不是序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的情况下，P为与序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶第71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363或364位对应的位置。在进一步的实施方案中，P为与序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶第110、145、215、229、300、328或362位对应的位置。在一个实施方案中，L1和L2均为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃接头。在一个实施方案中，E和F均为GCN4蛋白的亮氨酸拉链。

另一方面，本发明涉及多核苷酸，其编码本发明的环式重排变异体或互补片段对。在5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的互补片段对的情况中，所述多核苷酸可以是一体的或分开的。

另一方面，本发明涉及重组载体，其包含本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，所述重组载体是表达载体。在另一个实施方案中，所述重组载体是整合载体。在5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的互补片段对的情况中，在一个实施方案中，编码所述互补片段对的多核苷酸可以存在于同一重组载体中。在另一个实施方案中，编码所述互补片段对的多核苷酸可以存在于分开的重组载体中。在进一步的实施方案中，所述重组载体是整合载体。在进一步的实施方案中，一个重组载体用于整合到细胞基因组中，另一个重组载体用于整合到叶绿体基因组中。

另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或重组载体。在一个实施方案中，所述重组宿主细胞为微生物细胞。在进一步的实施方案中，所述重组宿主细胞为大肠杆菌。在另一个实施方案中，所述重组宿主细胞为植物细胞。在进一步的实施方案中，所述重组宿主细胞为稻、小麦、大麦、玉米、大豆、土豆、烟草、花生、棉细胞。在5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的互补片段对的情况中，在一个实施方案中，编码所述互补片段对的多核苷酸可以存在于同一细胞结构中。在另一个实施方案中，编码所述互补片段对的多核苷酸可以存在于不同细胞结构中。在进一步的实施方案中，编码所述互补片段对的多核苷酸整合在基因组中。在进一步的实施方案中，编码一个片段的多核苷酸整合在细胞基因组中，编码另一个片段的多核苷酸整合在叶绿体基因组中。

另一方面，本发明涉及生成本发明的重组宿主细胞的方法。在一个实施方案中，所述重组宿主细胞为植物细胞。在进一步的实施方案中，所述重组宿主细胞为稻、小麦、大麦、玉米、大豆、土豆、烟草、花生、或棉细胞。可以通过使用本领域常规技术将本发明的多核苷酸引入宿主细胞来生成本发明的重组宿主细胞。在一个实施方案中，使用本领域常规技术将本发明的多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中。在5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的互补片段对的情况中，将编码一个片段的多核苷酸整合到细胞基因组中，将编码另一个片段的多核苷酸整合到叶绿体基因组中。

另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的转基因植物及生成它们的方法。生成转基因植物的方法是本领域公知的。

在本发明的所有方面，5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶包括来自任何物种的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶，而且包括它们的功能性同等型、变体、同源物或片段。

附图简述

图1是蛋白质环式重排的原理的示意图。

图2是显示Cpred在线预测大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排位点的图。

图3是组成型表达环式重排变异体以及野生型EPSPS的大肠杆菌aroA缺陷菌株BD2100在含不同浓度草甘膦的M63培养基中的生长情况的照片。

图4是野生型EPSPS蛋白及其七个环式重排变异体的圆二色光谱图（左，远紫外光谱；右，近紫外光谱）。

图5是表达EPSPS蛋白对照片段组合的aroA缺陷菌株BD2100和融合了亮氨酸拉链的片段组合的aroA缺陷菌株BD2100在M63固体培养基上的生长情况的照片。对于没有融合亮氨酸拉链的组合：(1)N110/C111；(3)N145/C146；(5)N215/C216；(7)N229/C230；(9)N300/C301；(11)N328/C329；(13)N362/C363。对于融合了亮氨酸拉链的组合：(2)N110/C111；(4)N145/C146；(6)N215/C216；(8)N229/C230；(10)N300/C301；(12)N328/C329；(14)N362/C363。EPSP合酶片段根据其对应分拆位点命名，如N110/C111表明N端片段包含1-110氨基酸残基，C端片段为111-427氨基酸残基。

图6是显示表达EPSPS对照片段组合的aroA缺陷菌株BD2100和融合了亮氨酸拉链的片段组合的aroA缺陷菌株BD2100在LB培养基中的粗酶液酶活的图。

图7是大肠杆菌（E.coli）与其它一些物种的EPSP合酶的氨基酸序列对比的图，包括伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas Salmonicida）、烟草（Nicotiana tabacum）、矮牵牛（Petuniahybrida）、玉米（Zea Mays）、拟南芥（Arabidopsis thanliana）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）。

发明详述

为了更好的理解本发明，特作其下具体说明。

鉴定蛋白质的有效环式重排位点的方法

本发明提出了一套寻找并鉴定蛋白质有活力的环式重排位点的一般方法。在生物信息学相关方法出现之前，一般利用重组DNA技术的手段鉴定有效的蛋白质环式重排位点，一般有两种途径。第一种途径是基于环式重排的原理，大规模筛选有活力的蛋白质环式重排变异体。首先用PCR扩增目的基因的开放阅读框（注意在开放阅读框中还应该包括接头的序列），在上下游引物的两端引入相同的粘性末端限制性内切酶的位点，然后将PCR产物用T4DNA连接酶环化，在利用DNase I在Mn²⁺的存在下在环化产物中任意引入缺口，这样环化产物即可在任意的位点被切开成线状，再利用T4 DNA连接酶和T4 DNA聚合酶将带有许多单链缺刻的线状DNA补平，这样就可以得到不同N端和C端的蛋白质环式重排变异体的开放阅读框，将其克隆到表达载体中，并将表达载体导入相应的蛋白质缺陷型菌株中。若能够恢复突变，即可以认为该表达载体表达了有活力的环式重排变异体。但该方法繁琐，效率难以保证，需要大规模的筛选，而且有时筛选出的变异体发生的删除，插入等突变。第二种方法同样是需要大规模的筛选，不过更为直接。首先构建目的蛋白基因编码区的双串联模板，两个开放阅读框之间加入接头，以双串联的目的基因为模板进行PCR扩增，可以得到相应的任意蛋白质重排变异体，同样将其导入相应蛋白缺陷型的宿主，看是否能够回补表型。但是如果没有相关的预测信息，该方法同样需要进行大规模的PCR筛选，而且工作量直接取决于蛋白质本身的大小。

本发明利用了文献（Lo et al.,Nucleic Acids Res,40:W232-7(2012)）上的最新的关于环式重排生物信息学预测的成果，该成果中建立了一个可以在线预测环式重排的网站Cpred，只要目的蛋白在蛋白质结构数据库PDB（Protein Data Bank）中有已经发表的晶体结构，利用Cpred网站就可以预测蛋白质中潜在的环式重排的位点，预测结果会以评分值（0-1）的形式给出蛋白质中每一个氨基酸位点发生环式重排的可能性。

通过Cpred在线预测工具，我们可以得到一些5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶中发生环式重排可能性较高的位点，有针对性的利用上述两种方法中的第二种即以双串联基因为模板克隆表达目的蛋白的环式重排变异体。所以本发明的方法是综合了生物信息学预测和分子克隆的手段，可以有效的节约资源和时间。

研究环式重排和片段互补所用的菌株

本发明提供了可以用于研究5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶环式重排和片段互补的菌株。为了确定环式重排的蛋白质变异体是否有活力或者确定蛋白质片段互补是否有活力时，应该采取将表达有蛋白变异体或者片段重组蛋白导入5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的缺陷型菌株中，看在限制性培养基M63中该缺陷型菌株能否恢复生长。因此我们需要构建缺陷型菌株。现在研究人员普遍利用Datsenko等人（Datsenko et al,Proc Natl Acad SciUSA,97:6640-6645(2001)）建立的λred重组系统对大肠杆菌进行基因敲除，该方法可以非常快捷方便的对大肠杆菌各种菌系进行基因敲除。我们在实验中运用该方法将BL21（DE3）的aroA基因从染色体中敲除，命名为BD2100。

5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的有效环式重排变异体和其中抗草 甘膦以及酶活力较野生型提高的变异体

本发明发现了22个大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶有活力的环式重排变异体，并纯化了部分环式重排变异体蛋白。当我们将这些环式重排变异体克隆到pACYC184质粒上组成型表达四环素抗性基因tet启动子的下游，再将重组载体导入大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶缺陷型菌株BD2100中，可以使其在M63限制性培养基中生长。生长曲线结果表明带有某些重排变异体的菌株可以表现出比带有野生型5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的菌株更快的生长速率。另外，带有部分特定重排变异体的菌株可以在带有5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶抑制剂草甘膦的M63培养基上生长。通过pET28a表达系统，我们纯化了这些特殊的蛋白质变异体，体外动力学测定表明部分变异体催化效率比野生型还要高，另外部分变异体对草甘膦较野生型蛋白有显著提高的抑制常数，说明其对草甘膦的耐受性更强。圆二色光谱（UV-CD）和差热扫描量热仪（DSC）的实验表明，这些环式重排变异体保持了很好的二维和三维结构，并且拥有不亚于野生型蛋白的热稳定性。

5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶拆分的片段与酵母GCN4蛋白亮氨 酸拉链的融合蛋白

本发明建立了一种使得大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶发生片段互补的新方法。之前的结果表明该酶本身在数个位点上分拆成片段时可以天然互补，但是天然互补并不具有普遍适用意义，而且许多情况下存在效率低下的问题。本发明依旧以该酶作为研究对象，确定了新的几个位点，在这几个位点将酶拆分成两个片段后，两个片段无法发生天然互补，但将片段分别与酵母GCN4蛋白的亮氨酸拉链结构域融合，两个融合蛋白片段在亮氨酸拉链二聚化的帮助下可以发生互补恢复全酶的活力，该发明中的融合蛋白N端是亮氨酸拉链结构域，C端是5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的两个片段之一，之间用含有3个重复的（甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸）单位的柔韧性较好的蛋白接头即(GGGGS)₃连接，接头的存在是为了减少亮氨酸拉链结构域对于酶片段的影响，减轻蛋白空间结构上的刚性，最大程度的提高蛋白质片段互补的效率和稳定性。

双融合片段共表达系统

本发明还提出了研究5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶片段互补的双片段共表达系统。由于研究片段互补需要表达两个蛋白片段，所以我们将这两个片段克隆在两个质粒中，将两个质粒同时转入大肠杆菌使其表达这两个片段。由于双质粒表达必须考虑质粒在宿主体内能否共存的问题，在这里我们选用了pACYC184和pBR322这两个质粒作为母版质粒，因为这两个质粒的复制子分别是p15A复制系统和ColE1复制系统，两种复制系统原理不同，所以不存在竞争，可以有效的在大肠杆菌中复制，而且两种质粒的拷贝数接近，所以比较适合我们的共表达系统的要求。在选择表达启动子的问题上，我们使用了pACYC184和pBR322质粒上的四环素抗性基因tet启动子，该启动子可以组成型的表达基因，我们在启动子下游的四环素抗性基因起始密码子ATG处引入了一个NcoI位点的突变，得到pBR322-1质粒和pACYC184-1质粒，利用NcoI位点和下游的四环素抗性基因内部的SalI位点，克隆我们的片段。由于两个质粒的四环素抗性基因启动子和基因序列完全一样，加上两个质粒的拷贝数接近，这样我们可以控制两个融合蛋白片段表达水平接近。综上所述，这是一套良好在大肠杆菌中实现融合片段共表达系统。

构建蛋白质片段互补的一般方法

本发明通过实例提出了寻找蛋白质片段互补位点的一般方法。我们的实验表明蛋白质上有效的环式重排位点很有可能是同样有效的发生片段互补的位点。将5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶在发明中较好7个环式重排位点分别拆分成两个片段后，将两个片段与GCN4亮氨酸拉链融合，亮氨酸拉链的二聚化作用可以使得两个片段互补恢复完整酶的活力。我们认为环式重排位点和亮氨酸拉链辅助的蛋白质片段互补的内在联系在于，环式重排本质上是用一个蛋白质接头将蛋白质的两个片段（即接头的上游部分和下游部分）拉近使其发生功能互补，而亮氨酸拉链通过其自身的二聚化作用同样将两个片段拉近促使其折叠恢复全酶功能。同时，5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶在发明中的6个位点拆开后的两个片段本身完全不能发生天然互补，而融合了亮氨酸拉链后就可以发生良好的互补，说明亮氨酸拉链二聚化辅助的片段互补这种方法的高效性，相信这可以为那些无法发生天然片段互补的蛋白如农杆菌CP4的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶提供很好的解决思路。

实施例

实施例1：大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶aroA缺陷菌株的构建

大肠杆菌aroA缺陷菌株的构建利用Datsenko等人（Kirill A.Datsenko et al,Proc Natl Acad Sci USA,97:6640-6645(2001)）建立的λred重组系统。

首先设计一对长引物，上游引物AroA-删除-F：ACAGCCAGCCTGTGGGGTTTTTATTTCTGTTGTAGAGAGTTGAGTTCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC（SEQ ID NO：17），下游引物AroA-删除-R：GATTTGGCTATTTATTGCCCGTTGTTCATTCAGGCTGCCTGGCTAATCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG（SEQ ID NO：18）。这对引物从5’到3’依次是与大肠杆菌基因组中aroA基因的上下游序列退火的50bp区段、FLP重组酶识别位点FRT、和与卡那霉素抗性基因两端退火的区段。通过PCR扩增卡那霉素抗性基因，扩增条件为94℃预变性5min，然后进行30个循环的94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸1min，之后再72℃后延伸5min，得到1.3kb的PCR产物。利用DNA胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR产物备用。将表达λRed重组酶的质粒pKD46（加州大学圣迭戈分校Terry hwa实验室馈赠）转入大肠杆菌BL21菌株（北京全式金生物技术有限公司），得到BL21-pKD46。质粒pKD46在30℃条件下才能稳定复制，其λRed重组酶的表达受阿拉伯糖诱导。将BL21-pKD46 30℃过夜培养后转接到带有10mM阿拉伯糖的50ml LB培养基中诱导，待菌生长到OD₆₀₀0.4-0.6左右，离心收集菌体，用冰冷的10%的甘油洗3遍，制备电转感受态。将PCR产物电转入BL21-pKD46感受态，筛选具有卡那霉素抗性的转化子。划线42℃培养，将pKD46质粒消去。之后将表达FLP重组酶的质粒pCP20（加州大学圣迭戈分校Terry hwa实验室馈赠）转入BL21菌株。该重组酶识别FRT位点，可以将卡那霉素抗性基因从染色体上消去。之后根据大肠杆菌基因组中aroA基因上下游的序列设计一对引物，上游AroA-鉴定-F：CCTTCATGCACTGAAAGGTC（SEQ ID NO：19），下游AroA-鉴定-R：CTTCATGTGAATCATCCGTTG（SEQID NO：20），进行菌落PCR鉴定，菌落PCR产物显示aroA基因成功的从BL21菌株染色体中被删除，将该菌株命名为BD2100。

实施例2：用于组成型表达EPSPS环式重排变异体以及互补片段的表达载体pACYC184-1以及pBR322-1的构建

本发明表达EPSPS环式重排变异体以及互补片段时选用pACYC184（Invitrogen）和pBR322（Invitrogen）这一对母版质粒，利用上面的四环素抗性基因tet启动子。为了便于克隆，在四环素抗性基因的起始密码子ATG处引入NcoI位点。

对于pBR322质粒来说，因为该质粒内部没有其余的NcoI位点，所以可以直接通过定点突变引入NcoI位点，设计以下的一对引物：Tet-NcoI-F：GCAGTCAGGCACCGTCCATGGAATCTAACAATGCGC（SEQID NO：21）；和Tet-NcoI-R：GCGCATTGTTAGATTCCATGGACGGTGCCTGACTGC（SEQ IDNO：22）。

以pBR322为模板，采用DNA高保真聚合酶EasyPfu（北京全式金生物技术有限公司）环式PCR扩增pBR322质粒。PCR条件94℃预变性5min，然后进行18个循环的94℃变性40sec，51℃退火40sec，72℃延伸5min，之后再72℃后延伸5min。PCR结束后在37℃用DpnI内切酶消化PCR产物2小时，将产物转化入大肠杆菌Trans10菌株（北京全式金生物技术有限公司），再将转化子涂布于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，将阳性克隆提取质粒测序，测序结果显示pBR322质粒tet启动子下游的起始密码子ATG处成功的引入了NcoI位点，命名为pBR322-1质粒。

对于pACYC184质粒来说，由于它内部的氯霉素抗性基因里有一个NcoI位点，所以我们必须先将该位点消去，设计以下一对引物：184-NcoI删除-F：ATAATATTTGCCCAAGGTGAAAACGGGG（SEQ ID NO：23）；和184-NcoI删除-R：CCCCGTTTTCACCTTGGGCAAATATTAT（SEQ ID NO：24）。

以pACYC184为模板，采用DNA高保真聚合酶EasyPfu（北京全式金生物技术有限公司）环式PCR扩增pACYC184质粒，PCR条件为：94℃预变性5min，然后进行18个循环的94℃变性40sec，51℃退火40sec，72℃延伸5min，之后再72℃后延伸5min。PCR结束后在37℃用DpnI内切酶消化PCR产物2小时，然后将产物转化入大肠杆菌Top10菌株，将转化子涂布于含氯霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。将阳性克隆提取质粒测序，测序结果显示pACYC184氯霉素基因内部的NcoI位点已经被突变为CCAAGG，而大肠杆菌转化子依旧可以在添加了氯霉素的LB培养基中生长，说明该突变并没有对氯霉素抗性基因产生负面影响。

之后在此质粒的基础上，采取与上述pBR322质粒突变相同的策略，利用上述的Tet-NcoI-F/Tet-NcoI-R一对引物对质粒进行PCR环式突变，环式PCR条件与上述一样，然后在37℃用DpnI内切酶消化PCR产物2小时，将产物转化入大肠杆菌Top10菌株，将转化子涂布于含氯霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。然后将阳性克隆提取质粒测序，测序结果显示质粒tet启动子下游的起始密码子ATG处成功的引入了NcoI位点，而且该质粒氯霉素抗性基因内部的NcoI位点已经被消去，将构建的质粒命名为pACYC184-1。

实施例3：鉴定大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶有活力的环式重排变异体

本实例结合生物信息预测和DNA重组技术成功的鉴定了二十多个大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶中有活力的环式重排位点。

首先打开Cpred（http://140.113.15.73/～wade/CPred/index.php）环式重排的在线预测网站，将5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶在蛋白质结构数据库（PDB）中的结构文件输入（文件编号2AA9，主链编号A），输入后得到预测结果如图2。在该图中蛋白质每一个位点（X轴）都有其对应的评分值（Y轴），评分值越高（如那些峰值位点），在该点处产生有效环式重排蛋白变异体的可能性越高。网站还以文本文档的格式提供了每个位点具体的评分值，我们实验中选择了评分值较高的26个点进行下一步实验。

我们以双串联基因作为模板进行PCR克隆构建我们所需的环式重排变异体的表达载体。因此我们第一步构建了大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶aroA基因的双串联模板，两个aroA基因之间用一个编码(GGGGS)₃的核苷酸序列连接。首先用第一对引物（上游引物EcoAroA-EcoRI-P1：GCTACGAATTCATGGAATCCCTGACGTTAC（SEQ IDNO：25）和下游引物EcoAroA-BamHI-P2：CTAGTGGATCCGCCGCCACCGGCTGCCTGGCTAATCCG（SEQ ID NO：26）），用Easypfu高保真DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司）PCR扩增大肠杆菌aroA基因的序列，扩增条件为94℃预变性5min，然后进行30个循环的94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，之后再72℃后延伸5min，得到1.3kb的PCR产物。用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物以及pUC19质粒（北京全式金生物技术有限公司），这样将第一个拷贝的大肠杆菌aroA的基因克隆到pUC19中，命名为pUC19-aroA-1。之后利用第二对引物（上游引物EcoAroA-BamHI-P3：GATCTAGGATCCGGCGGTGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGCTCAATGGAA TCCCTGACGTTAC（SEQ ID NO：27）和下游引物EcoAroA-HindIII-P4：CTTAGAAGCTTGGCTGCCTGGCTAATCCG（SEQ ID NO：28）），再次PCR扩增大肠杆菌aroA基因的序列，扩增条件为94℃预变性5min，然后进行30个循环的94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，之后再72℃后延伸5min，得到第二个1.3kb的PCR产物。将PCR克隆到pUC19-aroA-1的BamHI位点和HindIII位点之间。这样我们就得到了带有串联双拷贝aroA基因的模板质粒，两个aroA基因之间还包含一个编码(GGGGS)₃蛋白质的接头核苷酸序列，我们将该质粒命名为pKU8000，将其用于下一步克隆环式变异体的工作中。

之后，我们设计了27对引物，用于克隆野生型aroA基因以及其在26个位点的环式重排变异体，在上游引物中引入NcoI位点，下游引物引入SalI位点，用于将其克隆到pACYC184-1质粒tet启动子的下游表达。

以aroA双拷贝串联质粒pKU8000为模板，用27对引物进行PCR，PCR条件为94℃预变性5min，然后进行30个循环的94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，之后再72℃后延伸5min，得到1.3kb的PCR产物。将PCR产物用NcoI和SalI双酶切，克隆到pACYC814-1中的NcoI位点和SalI位点，这样基因本身受到tet启动子控制表达。再利用菌落PCR，双酶切验证和测序确定27个重组载体的构建成功。

将测序正确的27个重组载体分别转入大肠杆菌aroA缺陷菌株BD2100中，看其是否能够在M63限制性培养(见分子克隆实验指南第三版附录)中生长。结果，通过Cpred网站预测的EPSPS蛋白的26个点中有22个点的环式重排变异体可以使得aroA缺陷菌株BD2100在M63限制性培养基中生长（表1）。为了方便，我们依次将它们命名为CP1至CP22。

实施例4：组成型表达环式重排变异体的aroA缺陷菌株在M63培养基中的生长速率、EPSPS蛋白粗酶活的测定以及菌株对草甘膦的耐受性表型

为了定量评价环式重排变异体的效果，我们测定了在pACYC184-1组成型表达体系下表达野生型EPSPS以及26个环式重排变异体的aroA缺陷菌株BD2100的生长速率和粗酶液酶活。

生长速率即细菌分裂时间的测定：

挑取LB固体培养基中BD2100菌落于LB液体中活化培养6个小时，1:100接种于M63培养基中，过夜培养或者培养更长时间，使细菌浓度长到饱和。之后转接至新的M63培养基中，使得初始OD₆₀₀不超过0.03，待细菌浓度达到OD₆₀₀约为0.1后，根据每个细菌各自生长的情况，隔合适时间测定一次OD₆₀₀，至少测定4个时间点，注意要确保这些点的OD₆₀₀处于0.1-0.5，这时细菌处于指数生长期，细菌翻倍的生长。利用专业分析软件Origin7.5软件计算出细菌的生长速率和分裂时间。

粗酶液酶活的测定：

将菌液在50mL M63液体培养基中摇至饱和，离心收集菌体。重悬于10mL 50mM的Tris-HCl缓冲液中（pH7.5，用前加入终浓度0.2mM的DTT），随后用超声破碎仪裂解细胞，12000rpm、4℃离心5min，收集上清，分步加入硫酸铵沉淀蛋白，收集30%-50%中沉淀的组分溶于50mM Tris-HCl缓冲液中，4℃在50mM Tris-HCl中透析过夜，即得粗酶提取液。

酶活采用孔雀绿定磷法（Lanzetta,P.A.,et al,Anal.Biochem,100:95-97(1979)）测定，由于EPSPS蛋白催化S3P和PEP生成EPSP和无机磷酸根离子，所以通过孔雀绿法测定产生的无机磷酸根就可以得到酶的活力。测定酶活之前，设定一系列浓度梯度的KH₂PO₄标准液（使磷酸离子量从1nmol到10nmol），加入孔雀绿显色液（0.045%的孔雀石绿和4.2%的钼酸铵溶液按体积比3:1混合过滤而成，用前加千分之一体积的Triton-100），测定OD₆₆₀吸光值作无机磷酸根浓度的标准曲线。

EPSPS酶活的测定：首先为每个粗酶液样品配制反应底液，每900μL的反应底液中含有：

2xHEPES缓冲液（100mM HEPES，NaOH调pH至7.5） 500μL

10xPEP储液（10mM PEP溶液）                  100μL

10xS3P储液（10mM S3P溶液）                  100μL

ddH₂O                                       200μL

取90μL底液于28℃预热5min后加10μL粗酶提取液，在28℃水浴锅中反应10min，加800μL孔雀绿显色液，混合1min加入100μL 34%柠檬酸钠溶液终止反应，混合后放置半小时测定OD₆₆₀吸光值。

以nKat作为酶活力单位，nKat对于EPSPS为每秒中反应生成1nmol磷酸根离子所需的酶量。

依照上述方法，我们测定了组成型表达野生型EPSPS和22个环式重排变异体在M63培养基中的粗酶液的比活力和细菌本身的生长速率，结果见表1。表1：组成型表达野生型EPSPS以及环式重排变异体的大肠杆菌aroA缺陷菌株BD2100的生长速率以及粗酶液EPSPS的活力

可以发现，表中数个环式重排变异体（如CP3，CP6，CP9，CP10，P15，CP17，CP19等）的细菌生长状态良好，与表达野生型EPSPS蛋白的细菌相仿，同时生长速率与粗酶液酶活有明显的正相关性。

由于环式重排有时会改变酶对底物的亲和性，我们提出一个新颖的问题：环式重排是否会改变酶对抑制剂的敏感度？为此我们测试了上述相关菌株在M63培养基中对草甘膦的耐受性情况。我们选择了上述生长速率较好的7个位点的环式重排变异体表达菌株以及表达野生型EPSPS蛋白的菌株，将它们划线于不同浓度草甘膦的平板上，观察它们的生长情况，结果如图3。可以看出，表达有其中三个位点环式重排变异体的菌株可以产生一定的草甘膦抗性：表达有CP19的菌株可以抗50mM草甘膦，表达有CP10的菌株可以抗20mM草甘膦，表达有CP3的菌株可以抗10mM草甘膦，而其它变异体（包括野生型）都不具有草甘膦抗性。

实施例5：EPSPS环式重排变异体的酶动力学参数测定

在实施例4中我们发现，有数个环式重排变异体组成型表达后可以使得大肠杆菌aroA缺陷菌株BD2100在M63培养基中生长良好，较表达野生型EPSPS的菌株生长速率相仿，甚至还要更好，粗酶液酶活测定的结果同样如此。但这些可能是酶的表达水平、酶的稳定性以及酶自身催化特性多个因素的综合结果。我们感兴趣的是，这些较好的环式重排变异体对底物的亲和力以及催化效率比起野生型是否更为优异。另外实施例4发现了几个能使得大肠杆菌aroA缺陷菌株BD2100对草甘膦产生一定耐受性的环式重排变异体，这些酶本身是不是对草甘膦的耐受性提高了？还是因为酶的表达量高而造成的草甘膦耐受性？为了阐明这些问题，我们纯化了CP3、CP6、CP9、CP10、CP15、CP17、CP19以及野生型EPSPS共8个蛋白，具体方法如下。

设计8对引物，用于将这8个蛋白的基因克隆到pET28a（北京全式金生物技术有限公司）中，上游引物和下游引物分别引入NcoI位点和XhoI位点。以对应的pACYC184-1重组载体为模板，PCR克隆相应的环式重排变异体基因。PCR条件同实施例3。之后利用XhoI和NcoI双酶切PCR产物并将其克隆到pET28a载体中，转化入Trans10菌株（北京全式金生物技术有限公司）。再通过菌落PCR，双酶切鉴定，测序等方法证明8个重组载体的成功构建。将8个测序正确的重组载体化学转化入BL21（DE3）菌株（北京全式金生物技术有限公司）中，接种于500mL添加有250μg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀至0.6左右，添加终浓度为0.5mM的IPTG，18℃诱导20个小时，将菌体离心，重悬于25mL Tris-HCl缓冲液中，超声破菌后，使用His-trap蛋白亲和纯化柱（GE-healthcare上海分公司）纯化8个蛋白，之后按照利用考马斯亮蓝法测定8个纯化蛋白的浓度。

8个EPSPS蛋白的酶动力学参数测试：

酶动力学参数主要包括催化效率Kcat，底物亲和性Km，抑制剂常数Ki等，对于EPSPS蛋白来说，因为其催化的反应底物有两个（PEP和S3P），所以要分别测定这两个底物的亲和力Km值。测定Km值和Kcat主要根据米氏方程来测定，即所谓的双倒数法：

$\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_m}\·\frac{1}{\left[S\right]}+\frac{1}{V_m}$

测定Km（PEP）时，将S3P的浓度固定在1mM，然后设置一系列的PEP浓度梯度：0.03mM，0.06mM，0.12mM，0.18mM，0.27mM，反应体系同实施例4，将8个蛋白的加入量都控制在20nM左右，28℃反应3min，用孔雀绿定磷法分别测定在各个PEP浓度下的反应速率（即反应产生的无机磷酸根的量除以反应时间），将反应速率的倒数和对应PEP的底物浓度倒数作图，与X轴的交点为-1/Km，与Y轴的交点即为1/Vmax；测定Km（S3P）时，将PEP的浓度固定在1mM，设置一系列的S3P浓度梯度：0.03mM，0.06mM，0.12mM，0.18mM，0.27mM，其余不变。两者得到的Vmax应该相等，Kcat催化效率为反应最大速率Vmax除以酶的浓度。

草甘膦是PEP的竞争性抑制剂，EPSPS对于草甘膦的抑制常数Ki的测定采用Tian等人的方法（Tian et al.,Appl.Environ.Microbiol.,76:6001-6005(2010)），根据加入竞争性抑制剂后改动的米氏方程测定：

$\frac{1}{v}=\frac{K_m}{\mathrm{Vs}}+\frac{1}{V}+\frac{K_m}{\mathrm{Vs}}\frac{i}{K_i}$

S3P的浓度固定在1mM，设置两个PEP底物浓度0.1mM和0.2mM，在这两个浓度下分别设置一系列的草甘膦的浓度梯度：2μM，4μM，8μM，16μM，24μM，32μM，48μM，酶的量和反应时间同上，分别测定不同浓度草甘膦下的反应速率。再将反应速率的倒数与抑制剂的浓度做直线，这样在0.1mMPEP和0.2mM PEP的条件下可以得到两条直线，两条直线的交点的X轴坐标为-Ki，这样测定出Ki值，所得各项参数见表2。

通过以上结果可以看出，这7个环式重排变异体在酶的特性方面表现都较为良好，其中CP9和CP19的催化效率超过了野生型蛋白；CP3、CP6、CP15、CP17这四个蛋白对底物的亲和力明显高于野生型蛋白；而对于综合评定酶效率的指数即Kcat/Km来说，CP3、CP15、CP19比野生型蛋白均有所提高。说明环式重排可以在一定程度上改良酶的催化特性。对于草甘膦的抑制常数来说，CP19比起野生型蛋白明显提高，Ki值以及Ki/Km（PEP）比起野生型蛋白均提高了15倍左右。而CP10和CP3对于草甘膦的抑制常数并没有明显提高，推测可能是蛋白本身表达水平较高，所以也表现出了一定的抗草甘膦特性。

实施例6：EPSPS环式重排变异体二级、三级结构的分析——圆二色光谱

为了进一步研究EPSPS环式重排变异体的结构特性，我们对实施例5中的8个蛋白进行了圆二色光谱（UV-CD）实验，圆二色光谱是根据光的偏振性，通过测定化学物质对左旋光和右旋光吸收的不同来定性检测化学物质的结构，它可以定性地检测蛋白的二级结构和三级结构。远紫外（190nm-250nm）圆二色光谱可以用于检测蛋白质的二级结构，因为不同的二级结构如α螺旋，β折叠，无规则螺旋等结构有不同的圆二色光谱图；近紫外圆二色光谱（250nm-320nm）可以用于检测蛋白质的三级结构。

8个蛋白的圆二色光谱测试：

圆二色光谱仪：MOS-450/AF-CD圆二色光谱仪（法国Bio-Logic公司）。

测定远紫外光谱时，蛋白质样品浓度调整为0.2mg/mL，溶解于20mMKH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液（并将该缓冲液作为空白对照）中，取约0.2mL样品在0.1cm规格的样品杯中，波长范围为190nm-250nm，时间常数为1sec，扫描速率为30nm/min，扫描重复次数3次。测定近紫外光谱时，浓度调整为2mg/mL，取约2mL样品在1cm规格的样品杯中，波长范围为250nm-320nm，其余扫描参数同远紫外光谱，结果如图4，可以看出，8个蛋白的二级结构和三级结构都有一定的差异。其中二级结构的差异很小，但是三级结构则发生了较为明显的变化。综合来看7个环式重排变异体都有很好的折叠结构。

实施例7：EPSPS环式重排变异体热稳定性的证据——差式扫描量热仪

对于酶来说，一个非常重要的指标是它的热稳定性。为了研究环式重排对酶的热稳定性产生的影响，我们通过差式扫描量热仪研究了8个蛋白的热变性特性进而衡量它们的热稳定性。差式扫描量热实验采用CSC型号6300NanoIII（美国犹他州林顿市Calorimetry Sciences Corp公司），蛋白质样品浓度控制在1.5mg/mL，溶解于20mM KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液（并将该缓冲液作为空白对照），每个蛋白取584μL到样品杯中测试。扫描温度范围为30℃至90℃，升温速率为0.5℃/min，测试压力为3个大气压（防止样品产生气泡），用NanoAnalyze软件（美国TA仪器公司）分析结果，得到8个蛋白的热力学参数，见表3。

表3：环式重排变异体的DSC热变性相关参数

从结果中可以看出，CP3和CP6的Tm值与野生型蛋白类似，而其余的5个蛋白的Tm值较野生型蛋白都有一定的下降，其中CP10最低为44.7摄氏度。我们实验中鉴定出的草甘膦抗性较好的CP19的Tm值为52.9度，并没有明显下降，说明该变异体热稳定特性依旧良好。实验中蛋白变性的焓测定值ΔH_cal与范德霍夫焓ΔH_vh的比值都约等于1，而且第二次DSC扫描没有任何信号，说明野生型EPSP合酶和其环式重排变异体的变性过程都是双态非可逆的过程。

实施例8：EPSPS蛋白基于GCN4亮氨酸拉链协助下的蛋白质片段互补

在这个实施例中，我们将EPSPS蛋白在上述较好的7个环式重排位点拆成两个片段（即N端片段和C端片段），并分别在两个片段的N端融合了GCN4的亮氨酸拉链，看两个融合片段在亮氨酸拉链二聚化作用的帮助下能否重建EPSPS蛋白的催化活力。

首先，在pACYC184-1和pBR322-1这两个载体的NcoI位点和BamHI位点之间插入了酵母GCN4蛋白的亮氨酸拉链（bZIP）基因序列，该基因序列的C端还包括编码(GGGGS)₃接头的核苷酸序列，插入的序列如下：CCATGGCTCATATGAAACAGCTGGAAGACAAAGTTGAAGAACTGCTGTCTAAAAACTACCACCTGGAAAACGAAGTTGCTCGTCTGAAAAAACTGGTTGGTGAACGTGGTGGCGGCGGATCCGGCGGTGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGCTCA（SEQ ID NO：29）。之后，在BamHI位点和SalI位点之间，将EPSPS拆分的N端片段克隆到pACYC184-1中亮氨酸拉链下游，将EPSPS拆分的C端片段克隆pBR322-1中亮氨酸拉链下游。使得EPSPS拆分的N端片段和C端片段与亮氨酸拉链融合，受tet启动子的控制。

除了与亮氨酸拉链融合的片段之外，我们还构建了不含有亮氨酸拉链的片段组合作为对照组，研究这些重排位点是否可以发生天然互补。类似的，我们分别将N端片段和C端片段直接克隆到pACYC184-1和pBR322-1的NcoI和SalI位点之间，使它们都受tet启动子控制表达。

将表达与bZIP融合的N端和C端组合以及对照组的N端和C端组合的pACYC184-1和pBR322-1共转化到大肠杆菌aroA缺陷菌株BD2100中，在M63固体培养基中生长，结果如图5，结果非常令人惊讶，7个分拆位点的对照组只有N229/C230组合可以让aroA缺陷菌株BD2100在M63培养基上生长；而融合了亮氨酸拉链后，7个位点的片段组合都可以使aroA缺陷菌株BD2100在M63培养基中较好的生长。对于N229/C230来说，表达融合了亮氨酸拉链的片段组合的aroA缺陷菌株BD2100的生长状态也明显好于对照组。我们进一步测定了它们的生长曲线，方法如实施例3，得到其分裂时间，见表4。

表4：带有7对片段组合的BD2100菌株在M63液体培养基上的生长分裂时间（分）

进一步地，我们测定了对照组和亮氨酸拉链片段组合细菌在LB培养基中生长的粗酶液酶活，酶活测定步骤见实施例3，结果见图6，可以看到对于无法发生天然片段互补的6个位点，基本检测不到EPSP合酶的活力，而对于融合了亮氨酸拉链的片段组合可以明显检测到EPSP合酶的活力，说明亮氨酸拉链二聚化作用可以明显促进片段互补。

实施例9：序列比对预测其它物种EPSP合酶的分拆位点

在本发明中我们鉴定出了7个分拆位点，我们希望还能预测到其它物种的分拆位点，为此我们利用clustalW2将大肠杆菌的EPSP合酶的氨基酸序列与其它亲缘物种的EPSP合酶的序列进行比对，标出了相应的7个分拆位点，得到结果如图7，这些物种的EPSP合酶都有关于对草甘膦具有耐受性的突变体的相关报道，由于它们与大肠杆菌EPSP合酶的较高的序列相似性，所以我们认为我们鉴定出来的7个分拆位点很有可能同样适合于这些EPSP合酶，这样我们同样可以将这些物种的相关EPSP合酶抗草甘膦突变体在我们的7个位点实现片段互补，实现控制转基因生态风险的目的。

Claims (9)

1.多核苷酸，其编码从N端到C端以B-L-A表示的多肽，其中L代表接头，A代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列N端至第P位的氨基酸区段，B代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸区段。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶为序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶。

3.权利要求2的多核苷酸，其中P选自110、145、215、229、300、328和362。

4.权利要求1-3任一项的多核苷酸，其中L为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃接头。

5.多核苷酸，其编码从N端到C端以E-L1-A表示的第一多肽和从N端到C端以F-L2-B表示的第二多肽，其中E和F代表相同或不同的二聚化肽，L1和L2代表相同或不同的接头，A代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列N端至第P位的氨基酸区段，B代表5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶全长氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸区段。

6.权利要求5的多核苷酸，其中所述5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶为序列1所示大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶。

7.权利要求6的多核苷酸，其中P选自110、145、215、229、300、328和362。

8.权利要求5-7任一项的多核苷酸，其中L1和L2均为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃接头。

9.权利要求5-8任一项的多核苷酸，其中E和F均为GCN4蛋白的亮氨酸拉链。