CN104622857A - 一种天然小分子化合物在抗炎抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种天然小分子化合物在抗炎抗肿瘤中的应用。该小分子化合物分离自豆科灌木紫穗槐果实，是一种新型的活性单体，命名为Amorfrutin A。经一系列的研究发现，Amorfrutin A阻断p50/p65从细胞质转运入细胞核，抑制NF-κB的活化，导致下调炎症、细胞生存、增殖、入侵和血管生成等基因的表达，上调凋亡基因的表达。本发明提供了一种通过改变转录因子NF-κB的活性，治疗与其异常活化相关疾病的方法。与此同时，Amorfrutin A对CoCl₂诱导的HIF-1α的表达，亦有明显的抑制作用。

Description

一种天然小分子化合物在抗炎抗肿瘤中的应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及紫穗槐果实中提取的一种天然小分子化合物Amorfrutin A在抗炎抗肿瘤中的应用。该化合物尤其可用于治疗涉及NF-κB活化介导的炎性疾病和癌症。

背景技术：

众所周知，NF-κB协调表达多种功能性基因，在急性和慢性炎症反应、免疫调控、细胞生存和增殖中发挥至关重要的作用。NF-κB的异常活化关联着人类多种疾病，包括癌症。因此，以NF-κB为药物靶点的研究策略越来越受到重视。

NF-κB为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚基：Rel(cRel)、p65(RelA)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。它们都具有一个N端Rel同源结构域(RHD)，在RHD的C末端有一个核定位区域(nuclear-localization sequence，NLS)，负责其与DNA结合、二聚化和核易位。另外，p65和cRel在它们的C末端具有有效反式激活结构域。通常所指的NF-κB的组成为p50/p65异源二聚体，其几乎存在于体内所有细胞，且含量常常最高。在静息的细胞中，NF-κB主要与IκB(其抑制蛋白)结合成异源三聚体，以无活性形式存在于细胞质中，IκB通过其C端特定的锚蛋白重复序列与p50/p65结合，有效的阻断了NF-κB蛋白上细胞核定位序列，由此阻止二聚体向细胞核的迁移。当细胞受胞外信号刺激后，IκB激酶(IKK)将IκB磷酸化，随后泛素化降解，释放出p50/p65，使NF-κB暴露核定位位点。游离的NF-κB迅速进入细胞核，p65与DNA特定序列上的启动子基因结合，介导下游基因的表达。各种生长因子、炎性因子、淋巴因子、UV、药物制剂、压力等都能引起NF-κB的异常活化。

NF-κB调控150多种靶基因的表达，这些基因包括免疫和炎症、抗凋亡、细胞增殖、血管生成和NF-κB的负反馈调节信号。NF-κB调控的许多炎性细胞因子包括白细胞介素(IL-6，IL-8，IL-1β)都是NF-κB的强活化剂。因此，NF-κB是炎性细胞因子的主要诱导剂，其抑制剂极有可能起到抗炎作用。

炎症是机体抵御病原体入侵的一种机制，它是一个复杂的生物过程，包括一些细胞因子的合成与释放。当机体某个部位受细菌和病毒的感染时，感染将导致炎症反应，炎症反应将会启动天然免疫应答，天然免疫应答细胞能够释放炎症细胞因子，这些细胞因子的转录依赖于NF-κB的激活，他们包括：TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、活性氧类(ROS)、诱导型-氧化氮合酶(iNOS)、生长因子以及细胞外基质降解酶等。

此外，NF-κB调控的环氧化酶(COX-2)，细胞周期蛋白D1，凋亡抑制蛋白如cIAP1、Bcl2、TRAF2、FLIP，入侵和血管生成所需基因如ICAM1、MMP-9、VEGF，在侵略性癌症的早期和晚期阶段起着重要作用。在人类血液系统肿瘤和实体瘤中，包括各种白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、霍奇金病、甲状腺癌以及黑色素瘤等，NF-κB活性都异常增高。因此，NF-κB抑制剂也可用于抗癌。

NF-κB作为细胞重要转录因子是连接炎症和肿瘤的关键分子。NF-κB的活化参与各种疾病，包括动脉硬化症、骨吸收、心肌肥厚、心脏衰竭、缺血/再灌注、多发性硬化症、肌营养不良、慢性阻塞性肺疾病、全身炎症反应综合症、神经病理学疾病、炎症性肠病疾病、关节炎、哮喘、狼疮、肿瘤发生、病毒感染、糖尿病(I型、II型)、阿尔茨海默氏病、艾滋病、癌症等。NF-κB的活化涉及人类的各种疾病。

鉴于NF-κB活化在多种不同疾病，例如上述那些中起作用，现在需要有效的小分子NF-κB抑制剂。现已发现的多种小分子抑制剂能直接抑制NF-κB组分，p65、RelB和cRel与DNA的结合。这些化合物能阻断经典和非经典的NF-κB途径。

近年来的研究发现，NF-κB和HIF信号途径之间存在广泛的串扰。HIF-1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体的一种转录因子。肿瘤的发生、发展与细胞的增值和凋亡密切相关，肿瘤细胞最主要的特征是无限增值，而增值过程中需要消耗大量的氧气，肿瘤缺氧造成的靶基因的改变主要由缺氧诱导因子-1(HIF-1)调节。

如今我们在紫穗槐(Amorpha fruticosa L)果实中发现了一种新型的取代苯甲酸类小分子活性单体——Amorfrutin A。未见其有抑制NF-κB活性的报道。

发明内容：

本发明涉及在豆科灌木紫穗槐果实中提取出一种新型取代苯甲酸类化合物，该化合物是具有生物活性天然小分子Amorfrutin A，化学名称为2-羟基-4-甲氧基-3-(3-甲基-2-丁烯基)-6-苯乙基苯甲酸，结构如下所示：

本发明的另一目的是提供一种可通过改变转录因子NF-κB的活性，治疗与其活化相关的疾病方法。该方法是对人宫颈癌细胞Hela、小鼠巨噬细胞RAW264.7按浓度梯度处理Amorfrutin A。Amorfrutin A剂量性抑制TNFα，LPS等诱导NF-κB的活化，导致下调炎症、细胞生存、增殖、入侵和血管生成等基因的表达，上调凋亡基因的表达。

许多免疫和炎性介质，包括TNFα(肿瘤坏死因子)、LPS(脂多糖)、IL-1β、PMA(佛波酯)、CD3/CD28(抗原呈递)、CD40L、FasL、病毒感染和氧化应激均可引起NF-κB的活化。本发明提供了治疗NF-κB活化所致疾病的方法，在一些实例中NF-κB是由TNFα和LPS(包括但不限于TNFα和LPS)诱导的。

本发明涉及的Amorfrutin A不仅可以抑制NF-κB的活化，作为一种新型的小分子NF-κB抑制剂，而且对CoCl₂诱导的HIF-1α的表达亦有明显的抑制作用。通过CoCl₂模拟的缺氧条件，诱使HIF-1α大量表达，再按浓度梯度处理Amorfrutin A，对人宫颈癌细胞Hela中HIF-1α的表达呈现显著性地剂量性抑制。

本发明涉及的Amorfrutin A的浓度梯度为1μM、5μM、20μM。

本发明的创新点：新发现从紫穗槐果实中提取的天然小分子化合物Amorfrutin A不但可以抑制NF-κB的活化，下调NF-κB下游靶基因的表达；同时，亦能抑制HIF-1α的表到。使其作为一种新型小分子药物应用在抗炎抗肿瘤领域，并为新药的开发研制提供了一定的理论基础。

附图说明：

附图代表所述发明的具体实施方式，因此，仅用于说明本发明的目的。所以，附图并非要限制本发明的范围。

图1显示用Western blot法证实Amorfrutin A以剂量依赖性方式阻断TNFα诱导Hela细胞p50/p65从细胞质转运入细胞核。

图2显示用Western blot法证实Amorfrutin A以剂量依赖性方式抑制LPS诱导RAW264.7细胞p65的表达。

图3显示用Western blot法证实Amorfrutin A以剂量依赖性方式抑制TNFα诱导Hela细胞p-p65的表达。

图4显示用Western blot法证实Amorfrutin A以剂量依赖性方式抑制TNFα诱导Hela细胞IκB磷酸化和降解。

图5显示用Western blot法证实Amorfrutin A以剂量依赖性方式抑制TNFα诱导Hela细胞NF-κB调控的细胞凋亡抑制蛋白cIAP1的表达。

图6显示用Western blot法证实Amorfrutin A也可以以剂量依赖性方式抑制CoCl₂诱导Hela细胞HIF-1α的表达。

图7显示PCR法证实Amorfrutin A以剂量依赖性方式抑制TNFα诱导Hela细胞NF-κB下游靶基因MCP1、IL8、TNFα等的表达。

图8显示免疫荧光法证实Amorfrutin A阻断TNFα诱导Hela细胞p50/p65从细胞质转运入细胞核。图中“-”代表阴性对照组，“+”代表阳性对照组。

图9显示流式细胞术法证实Amorfrutin A促进TNFα诱导Hela细胞凋亡。

具体实施方式：

实施1：细胞培养技术

细胞进入对数生长期后，用0.25％胰酶消化，按细胞数5×10⁴密度平均分入5个直径为6cm细胞培养皿中，每个培养皿加入3mlDMEM培养基(含已灭活的10％小牛血清、100U/L青霉素)放入恒温培养箱(37℃、5％CO₂、正常氧浓度和饱和湿度)中培养。待细胞完全贴壁后，将细胞分为阴性对照组、阳性对照组、浓度梯度组(1μM、5μM、20μM)，培养4小时后，将阳性对照组和浓度梯度组处理TNFα3μl(终浓度10ng/ml，Hela细胞处理TNFα，RAW264.7细胞处理LPS)，培养15min。

实施2：Westernblot法

(1)蛋白样品的制备，包括总蛋白的提取和核蛋白的提取。

(2)蛋白变性：取样本蛋白15μl分别加入相应的tube中，加入5μl上样缓冲液，煮沸5min。

(3)将煮沸后的蛋白样品放置SDS-PAGE凝胶上电泳。

(4)待电泳停止，将凝胶上的蛋白样品转录至甲醇浸泡的PVDF膜上。

(5)将PVDF膜放入5％脱脂牛奶中室温封闭1h。

(6)一抗杂交，二抗杂交。

(7)ECL发光试剂盒检测。

实施3：PCR法

(1)总RNA提取：

将药物处理后的细胞用PBS反复清洗三次，加入1mlTtiol，用注射器反复吹打，使其全部裂解。加入200μlCCl₄使溶液分层，4℃12000r离心15min。取上层至新的tube中，加入500μl异丙醇，混匀，4℃12000r离心10min。小心弃去上清液，在含RNA的tube中加入1ml75％乙醇，振荡，4℃12000r离心5min。充分弃去上清液，放置超净台通风干燥。待彻底干燥后，加入30μlDEPC-DDW，使之完全溶解。

(2)以RNA为模板逆转录合成cDNA。

表1

RT-PCR反应条件：

(3)PCR反应：由cDNA合成双链DNA。

表2

PCR反应条件：

上述PCR条件94℃30s、58℃30s、72℃30s为30～40循环，具体视反应引物而定。

实施4：免疫荧光法检测p65

(1)细胞在盖玻片上生长融合95％～100％时，从培养箱中取出，用预温PBS洗涤3次，10min/次。

(2)4％的甲醛室温固定30min。PBS洗涤3次，10min/次。

(3)0.2％Triton X-100透化5min。PBS洗涤3次，10min/次。

(4)5％BSA室温封闭30min。加一抗p65(用1％BSA稀释)孵育，4℃过夜。PBS洗涤3次，10min/次。

(5)加二抗Rabbit-488(用1％BSA稀释)孵育30min，避光！PBS洗涤3次，10min/次。

(6)染DAPI(终浓度1μg/ml)30min，避光！

(7)95％甘油封片。

实施5：流式细胞术法检测细胞凋亡

(1)细胞分入六孔板，待长到80％以上，换成Free DMEM，分别处理DMSO、TNFα、Amorfrutin A、Amorfrutin A+TNFα，培养8h。

(2)用0.25％胰酶消化，使细胞分散成单个状态，取1～2mlPBS收集细胞于1.5mltube中，微离心，洗涤两次。

(3)每个tube中加入100ml5％BSA，加入FITC-Annexin5μl，PI2μl，恒温培养箱中染色1h。

(4)用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

Claims (16)

1.一种抑制NF-κB的方法，其特征在于，该方法包括对细胞施用抑制NF-κB活化的新型小分子化合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞，NF-κB被TNFα诱导。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是小鼠巨噬细胞，NF-κB被LPS诱导。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述新型小分子是活性单体，分离自豆科灌木紫穗槐果实中的天然化合物，属于芳香酸类，其结构式：

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述细胞按浓度梯度处理所述化合物，浓度梯度为1μM、5μM、20μM，NF-κB的活化是以剂量依赖性的方式被抑制的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当对所述细胞施以上述药物浓度时，炎症应答被抑制。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述炎症性疾病选自动脉硬化症、骨吸收、心肌肥厚、心脏衰竭、缺血/再灌注、多发性硬化症、肌营养不良、慢性阻塞性肺疾病、全身炎症反应综合症、神经病理学疾病、炎症性肠病疾病、关节炎、哮喘、狼疮、肿瘤发生、病毒感染、糖尿病(I型、II型)、阿尔茨海默氏病、艾滋病等。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当对所述细胞施以上述药物浓度时，癌症被抑制。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、霍奇金病、甲状腺癌以及黑色素瘤等。

10.如权利要求7和9所述的方法，其特征在于，所述疾病是由NF-κB的异常活化导致的。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物抑制p65的核易位，阻断p50/p65从细胞质转运入细胞核。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述药物抑制IκB的磷酸化和降解，抑制IκB激酶(IKK)将IκB磷酸化。

13.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药物亦能抑制HIF-1α的表达。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述药物施予细胞，细胞是肿瘤细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，CoCl₂通过模拟缺氧条件诱导HIF-1α的表达，CoCl₂的终浓度是200μM。所述药物剂量性的抑制CoCl₂诱导HIF-1α的表达。

16.如权利要求5和15所述的方法，其特征在于，所述药物可应用于抗炎抗肿瘤领域。