CN104619343A - 一种检测肺癌患者化疗抗性的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在患有癌症的受试者中确定化疗抗性的可能性并且预测对化疗的响应的方法、测定和方法。在一个实施方案中,受试者患有肺癌。
Description
技术领域
本发明涉及O-糖基化通路的酶在肿瘤细胞对化疗抗性中的作用。特别地,本发明提供了新的分子靶,即GalNAc-T13(还被称为ppGalNAc-T13),作为肺腺癌化学抗性的诊断标志物。
背景技术
非小细胞肺癌(NSCLC)一直是美国和全球癌症相关的死亡率的主要原因。将NSCLC通过组织学分类为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌(Beasley等,2005)。在美国,腺癌已经超过了鳞状细胞组织学成为最常见类型的NSCLC。多数用化疗治疗的癌症患者将遭受严重毒性,因为对使用抗癌药物的单一疗法的反应率比针对其它疾病的疗法的反应率低得多并且此外抗癌药物的有效剂量水平通常接近毒性剂量水平或与之重叠。因此,鉴别可能对抗癌药物治疗有反应的患者是重要的。生物标志物的开发对于预测这些药剂对相关靶的作用所必需的。开发生物标志物的目标是设计预测分子靶向药物的功效(包括反应率、无进展存活率(PFS)和总存活率(OS))的方法。如果生物标志物允许我们选择可能表现出良好治疗反应的患者群体,则这对于患者和医生两者是有利的(Saijo,2012)。
糖缀合物已被证明在癌症生物学中进行了相关功能。已开发了几种基于检测糖基化变化的诊断程序并将其纳入至护理实践中(Adamczyk等,2012)。O-糖基化变化发生在多种癌中,从而导致可组成可在诊断和预后中利用(Reis等,2010),以及用于开发癌症疫苗(Tarp和Clausen,2008)的有用靶的分子表达。O-连接的糖基化的合成于高尔基体中在由UDP-N-乙酰基-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰基氨基半乳糖基转移酶(ppGalNAc-Ts,EC 2.4.2.41)催化的反应中通过α-N乙酰基半乳糖胺残基(GalNAc)与Ser/Thr残基的羟基的共价键合开始。ppGalNAc-Ts是一种复杂的同功酶家族(Ten Hagen等,2003),迄今为止已经表征了其中20个成员(Bennett等,2012)。相较于正常组织,已发现它们在恶性组织中差异表达(Mandel等,1999;Berois等,2006b)。发现GALNT3基因的过表达促进了胰腺癌细胞生长(Taniuchi等,2011)并且使GALNT12(正常结肠细胞中高度表达的基因)的体细胞和生殖系突变失活与结肠癌症进展有关(Guda等,2009)。越来越多的证据表明这些酶可能是有用的肿瘤标志物。例如,已经显示GalNAc-T3表达与胆囊癌患者中不良临床结果相关(Miyahara等,2004);骨髓样品中的GalNAc-T6表达与淋巴结阴性乳腺癌患者中的不良临床结果相关(Freire等,2006)。就肺癌而言,GalNAc-T3的低表达可能是在预测腺癌患者和I期疾病患者的不良预后和早期复发中有用的标志物(Gu等,2004)。本发明人之前已经显示相较于原发性肿瘤,GALNT13(编码GalNAc-T13同功酶的基因)是转移性成神经细胞中的最上调基因,并且发现诊断时GALNT13在骨髓中的表达是神经母细胞瘤患者的不良临床结果的预测指标(Berois等,2006a)。在此本发明人证实GalNAc-T13在人肺癌细胞中表达。
发明概述
结合系统、组合物及方法描述和说明了以下实施方案和其方面,其意为示例性的并不限制范围。
本文描述了方法、测定和方法,其包括获得包含来自希望了解化疗抗性可能性的癌症患者的肿瘤细胞的样品,测定样品以确定GalNac-T13或其变体的水平,及确定受试者具有化疗抗性的可能性增加(如果GalNac-T13或其变体的水平相对于参考样品升高),或确定受试者具有化疗抗性可能性减小(如果GalNac-T13或其变体的水平与参考样品相同或相对于参考样品降低)。
在本文描述的方法、测定和方法的各种实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,受试者已经进行了新辅助疗法。在一些实施方案中,分析GalNAc-T13或其变体在从受试者获得的样品中的水平包括测量编码GalNAc-T13或其变体的核酸水平、GalNAc-T13或其变体的蛋白水平或其组合。在一些实施方案中,来自受试者的样品是在癌症治疗之前、期间或之后获得。在一个实施方案中,受试者患有癌症,例如肺癌。在一个实施方案中,肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个特定实施方案中,NSCLC是腺癌。在各种实施方案中,来自受试者的样品获自组织、血液、血浆或其组合
附图说明
以参考图示说明了示例性实施方案。本文公开的实施方案和附图意欲被认为是说明性的而非限制性的。
根据本发明的实施方案,图1描绘了针对GalNAc-T13具有特异性的单克隆抗体(mAB T13.5)的产生和表征。
根据本发明的实施方案,图2描绘了在人肺癌细胞系中的GalNAc-T13表达。(A)针对GALNT13的RT-PCR:(1)分子量标志物(100bp),(2)阴性对照,(3)NCI-H1703细胞系,(4)NCI-H526细胞系,(5)NCI-H838细胞系,(6)SK-MES-1细胞系,(7)H69AR细胞系,(8)H2O阴性对照,(9)NCI-H1755细胞系,(10)A549细胞系,(11)NCI-H1975细胞系,(12)NCI-H1650细胞系,(13)NL-20细胞系,(14)阳性对照,BM细胞系,(15)分子量标志物(100bp)。(B)在A549肺癌细胞系中用mAb T13.5进行的间接免疫荧光。(C)使用mAb T13.5的蛋白质印迹:(1)分子量标志物,(2)BM细胞系,(3)Hela细胞系,(4)A549细胞系,(5)NCI-H1703细胞系。
根据本发明的实施方案,图3描绘了ppGalNAc-T13的一些剪接变体的示意图。我们发现了通过ppGalNAc-T13的可变剪接产生的8种新型转录物。剪接变体的序列示于SEQ ID NO:1-14中。
根据本发明的实施方案,图4描绘了具有单克隆抗体T13.5的人肺癌原发性肿瘤的免疫组织化学。
根据本发明的实施方案,图5描绘了(A)接受了在原发性肿瘤中表达GalNAc-T13的新辅助疗法的肺腺癌患者中的Kaplan-Meier存活率估值;(B)接受了在原发性肿瘤中表达GalNAc-T13的晚期肺腺癌患者中的Kaplan-Meier存活率估值;(C)接受了在原发性肿瘤中表达GalNAc-T13的早期肺腺癌患者中的Kaplan-Meier存活率估值。
发明详述
本文所引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文,就如同做了充分阐述一样。
除非另外定义,否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。Singleton等,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第3版,J.Wiley&Sons(New York,NY2001);March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第5版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001);及Sambrook和Russel,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(ColdSpring Harbor,NY 2001),给本领域的技术人员提供了对本申请中所用的许多术语的通常指导。
本领域的技术人员将认识与本文描述的那些方法和材料类似或等同的许多方法和材料,其可用于本发明的实践中。的确,本发明不限于所描述的方法和材料。为了本发明的目的,如下定义以下术语。
“有益结果”可包括但不限于减轻或缓解疾病状态的严重性、预防疾病状态恶化、治愈疾病状态、预防疾病状态发展、降低患者发生疾病状态的机会及延长患者寿命或预期寿命。在一些实施方案中,疾病状态是癌症。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后或治疗的任何受试者,特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物、娱乐动物(sport animal)、宠物动物(诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛);灵长类动物,诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩;犬科动物,诸如狗和狼;猫科动物,诸如猫、狮子和虎;马科动物,诸如马、驴和斑马;食用动物,诸如母牛、猪和羊;有蹄类动物,诸如鹿和长颈鹿;啮齿类动物,诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠;等。在某些实施方案中,哺乳动物是人受试者。该术语不表明特定年龄或性别。因此,意在将成人和新生儿受试者以及胎儿(无论男性或女性)包括在该术语的范围内。
如本文所用的“治疗/处理(treatment)”和“治疗/处理(treating)”是指治疗性治疗与防止性或预防措施,其中目标是即使所述治疗最终不成功仍预防或减缓(减轻)所靶向的病理性状况、预防病理性状况、寻求或获得有益结果或降低个体发生所述疾患的机会。需要治疗的那些受试者包括那些已经患有所述疾患的受试者以及那些倾向于患有所述疾患的受试者或那些待预防所述疾患的受试者。癌症治疗的实例包括但不限于主动监测、观察、手术干预、化疗、免疫疗法、放射疗法(诸如外射束放射、立体定位放射手术(γ刀)及分次立体定向放射治疗(FSR))、焦点疗法、全身治疗、疫苗治疗、病毒治疗、分子靶向治疗或其组合。
如本文所用的“肿瘤”是指所有瘤细胞生长和增殖(无论恶性还是良性),以及所有癌变前和癌性细胞及组织。
“癌症”和“癌性”是指或描述了通常特征在于失调的细胞生长的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括但不限于B-细胞淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphomas)和/或非霍奇金氏淋巴瘤)、脑癌、乳腺癌、结肠癌症、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤、头颈癌、脑癌及前列腺癌(包括但不限于雄激素依赖型前列腺癌和雄激素不依赖型前列腺癌)。
如本文所用的“化疗抗性”是指对化疗药物有部分或完全抗性。例如,受试者不响应或仅部分响应化疗药物。本领域技术人员可确定受试者是否展现了对化疗的抗性。
如本文所用的“化疗药物”或“化疗剂”是指用于治疗癌症的药物,包括但不限于白蛋白-结合的紫杉醇(nab-紫杉醇)、放线菌素、阿利维A酸、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝伐单抗、贝沙罗汀(Bexatotene)、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、西妥昔单抗、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖孢苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、埃罗替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、易普利姆玛、伊立替康、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼妥单抗(Panitumab)、培美曲塞、利妥昔单抗、特卢普塞(Tafluposide)、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、维甲酸、戊柔比星、维罗非尼、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他、罗咪酯肽、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨、氯法拉滨、氟尿苷、氟达拉滨、喷司他丁、丝裂霉素、伊沙匹隆、雌莫司汀或其组合。
“患者结果”是指由于治疗,患者存活还是死亡。如本发明提供的对患者更精确的预后增加了患者存活的机会。
“不良预后”意指尽管用于治疗(即手术、放射、化疗)癌症(例如,肺癌)的护理标准,仍不可能存在疾病的存活和恢复的前景。不良预后是一类存活期小于中位存活期的患者。
“良好预后”意指在用于治疗疾病(例如手术、放射、化疗)的护理标准的情况下,可能存在疾病的存活和恢复的前景。良好预后是一类存活期不小于中位存活期的患者。
“复发”意指在初始治疗之后癌症再发。
如本文所用的“变体”是指突变体GalNAc-T13、GalNAc-T13的剪接变体或其组合。GalNAc-T13的突变体可由GalNAc-T13编码基因中的插入、缺失、错义、无义和/或截短突变所产生。
为“非复发性”或“不复发的”意指癌症被缓解;为复发性意指癌症正生长和/或已经转移,并且需要一些手术、治疗性介入和/或癌症治疗来降低致死的可能性。“非复发性受试者”是患有非复发性或不复发的疾病的受试者,并且他们可用作患有复发性疾病的复发性受试者或复发的对照。
O-糖基化变化发生于大部分癌中,导致构成诊断和治疗的有用靶标的分子表达。GalNAc-T13酶催化O-糖基化起始中的关键步骤。其在转移性神经母细胞瘤中过表达并且已与该肿瘤患者的预后相关。在切除的肺癌样本中,没有关于GalNAc-T13表达的信息。
如本文所述,申请人观察到GalNAc-T13表达在NSCLC增加,而在使用新辅助(WNA)化疗的受试者与不使用新辅助(WONA)化疗的受试者之间不存在显著差异。GaINAc-T13在NSCLC中表达,并且与接受了新辅助化疗的腺癌患者(ADCA)中的不良预后相关。申请人的数据表明GaINAc-T13是新的与NSCLC中化学抗性相关的标志物。
因此,本发明至少部分基于这些发现。本发明满足了对预测癌症(诸如肺癌)以确定癌症患者中的化疗抗性和指导癌症患者的治疗选择的分子指标需求。本发明提供了用于确定癌症患者中的化疗抗性可能性的方法、测定和方法以优化需要其的受试者的癌症疗法。
特别地,本发明提供了方法,其包括从希望了解化疗抗性的可能性的癌症患者获得包含癌细胞的样品,分析样品以测定GalNac-T13或其变体的水平,及确定受试者具有化疗抗性的可能性增加(如果GalNac-T13或其变体的水平相对于参考样品升高)或确定受试者具有化疗抗性可能性减小(如果GalNac-T13或其变体的水平与参考样品相同或相对于参考样品降低)。在一个实施方案中,受试者患有肺癌。
在一些实施方案中,所述方法还可包括向受试者开出第一疗法的处方(如果受试者具有化疗抗性的可能性减小)或向受试者开出第二疗法的处方(如果受试者具有化疗抗性的可能性增加)。在一些实施方案中,第一疗法可为手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在一些实施方案中,第二疗法可为不包括化疗的疗法,并且许多可为手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在另外的实施方案中,第二疗法可为手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种,其中化疗包括向受试者施用一种或多种之前未使用的化疗剂以治疗受试者,或者向受试者以比之前施用的剂量更高的剂量施用之前已施用的化疗剂。
在一些实施方案中,基于认识到化疗可能在其癌症具有增加的GalNAc-T13或其变体表达的受试者中无效,第二疗法可包括当在来自受试者的样品中GalNAc-T13或其变体的表达相对于参考样品增加时,选择针对受试者的不包括化疗的癌症疗法。在另外的实施方案中,基于认识到化疗可能在其癌症具有减少的GalNAc-T13或其变体表达的受试者中有效,第二疗法可包括当GAalNAc-T13或其变体在来自受试者的样品中表达与参考样品相同或相较于参考样品降低时,选择包括化疗的癌症疗法。
本发明还提供了测定,其包括从希望了解化疗抗性可能性的癌症患者获得包含癌细胞的样品,分析样品以测定GalNac-T13或其变体的水平,及确定受试者具有化疗抗性的可能性增加(如果GalNac-T13或其变体的水平相对于参考样品升高)或确定受试者具有化疗抗性可能性减小(如果GalNac-T13或其变体的水平与参考样品相同或相对于参考样品降低)。在一个实施方案中,受试者患有肺癌。
本发明还提供了用于确定在需要其的受试者中化疗抗性的可能性的测定。所述测定包括提供来自患有癌症的受试者的生物样品、提供特异性结合至GalNAc-T13或其变体的抗体、使生物样品与抗体接触及检测(例如使用免疫测定)结合至GalNAc-T13或其变体的抗体的水平,其中相对于参考样品在来自受试者的生物样品中结合增加表明受试者中化疗抗性的可能性增加。在一个实施方案中,所述癌症是肺癌。在一个实施方案中,所述抗体是本文描述的结合具有GalNAc-T13或其变体中的LLPALR序列的表位的T13.5抗体。
在一些实施方案中,用于确定受试者中化疗抗性可能性的测定可包括提供来自患有癌症的受试者的生物样品和确定从受试者获得的样品中存在的编码GalNAc-T13或其变体的mRNA的水平。从受试者获得的样品中的mRNA水平相对于参考样品升高表明受试者中化疗抗性的可能性增加。在一个实施方案中,所述癌症是肺癌。
本发明的测定还可包括选择和/或施用疗法以治疗、降低、抑制或降低受试者中癌症的严重性。选择疗法包括向受试者开出第一疗法的处方(如果受试者具有化疗抗性的可能性减小)或向受试者开出第二疗法的处方(如果受试者具有化疗抗性的可能性增加)。在一些实施方案中,第一疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在一些实施方案中,第二疗法可为不包括化疗的疗法,并且可为手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在另外的实施方案中,第二疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种,其中化疗包括向受试者施用一种或多种之前未使用的化疗剂以治疗受试者或者向受试者以比之前施用的剂量更高的剂量施用之前已施用的化疗剂。在一些实施方案中,所述癌症是肺癌。
在一些实施方案中,第二疗法可包括选择不包括化疗的癌症疗法以治疗受试者中的癌症。在一些实施方案中,基于认识到化疗可能在其癌症具有增加的GalNAc-T13或其变体表达的受试者中无效,所述测定还包括当在来自受试者的样品中GalNAc-T13或其变体的表达相对于参考样品增加时,选择不包括化疗的癌症疗法用于受试者。在另外的实施方案中,基于认识到化疗可能在其癌症具有减少的GalNAc-T13或其变体表达的受试者中有效,第二疗法可包括当在来自受试者的样品中GalNAc-T13或其变体的表达与参考样品相同或相对于参考样品减少时,选择包括化疗的癌症疗法。
本发明还提供了方法,其包括从希望了解化疗抗性可能性的癌症患者获得包含癌细胞的样品,分析样品以测定GalNAc-T13或其变体的水平,及确定受试者具有化疗抗性的可能性增加(如果GalNac-T13或其变体的水平相对于参考样品升高)或确定受试者具有化疗抗性可能性减小(如果GalNac-T13或其变体的水平与参考样品相同或相对于参考样品降低)。在一个实施方案中,受试者患有肺癌。
本发明还提供了方法用于为患有癌症的受试者选择治疗和任选地施用治疗/疗法的方法,其包括提供来自患有癌症的受试者的生物样品、提供特异性结合至GalNAc-T13的抗体、使生物样品与抗体接触、检测(例如,使用免疫测定)抗体是否结合GalNAc-T13以及选择疗法。所述方法还包括施用经选择的疗法。在所述方法的一个实施方案中,相对于参考样品,在来自受试者的生物样品中存在结合针对的GalNAc-T13的抗体表明GalNAc-T13表达增加和受试者中化疗抗性的可能性增加。在一个实施方案中,所述癌症是肺癌。在一个实施方案中,所述抗体是本文描述的结合具有GalNAc-T13或其变体中的序列LLPALR的表位的T13.5抗体。
本发明还提供了用于为患有癌症的受试者选择治疗和任选地施用治疗/疗法的方法,其包括提供来自患有癌症的受试者的生物样品和确定从受试者获得的样品中存在的编码GalNAc-T13或其变体的mRNA的水平。从受试者获得的样品中的mRNA水平相对于参考样品升高表明受试者中化疗抗性的可能性增加。在一个实施方案中,所述癌症是肺癌。
在一些实施方案中,选择疗法包括向受试者开出第一疗法的处方(如果受试者具有化疗抗性的可能性减小)或向受试者开出第二疗法(如果受试者具有化疗抗性的可能性增加)。在一些实施方案中,第一疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在一些实施方案中,第二疗法可为不包括化疗的疗法和可为手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在另外的实施方案中,第二疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种,其中化疗包括向受试者施用一种或多种之前未使用的化疗剂以治疗受试者或向受试者以比之前施用的剂量更高的剂量施用之前已施用的化疗剂。
本发明还提供了从人受试者获得的经分离的样品,其包含异常水平的GalNAc-T13。在一些实施方案中,样品是组织、血液、血浆、尿或其组合的任一种或多种。
本发明还提供了从人受试者获得的经分离的样品的组合,其包含异常水平的GalNAc-T13和与GalNAc-T13反应的试剂。在一个实施方案中,所述试剂包括产生表明异常水平的GalNAc-T13在经分离的样品中存在的信号的标记。在一些实施方案中,标记是放射性标记、生色团、荧光团或其组合的任一种或多种。在各种实施方案中,试剂是GalNAc-T13-特异性核酸、ppGalNAc-T13-特异性单克隆抗体、GalNAc-T13-enyme-特异性底物、小分子、脂质或其组合的任一种或多种。
本发明还提供了包括从人受试者获得的经分离的样品的系统,其包含异常水平的GalNAc-T13和与GalNAc-T13反应的试剂。在一个实施方案中,所述试剂包括产生表明异常水平的GalNAc-T13在经分离的样品中存在的信号的标记。在一些实施方案中,标记是放射性标记、生色团、荧光团或其组合的任一种或多种。在各种实施方案中,试剂是GalNAc-T13-特异性核酸、GalNAc-T13-特异性单克隆抗体、GalNAc-T13-enyme-特异性底物、小分子、脂质或其组合的任一种或多种。
在本文描述的方法、测定和方法的各种实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,受试者已经进行了新辅助疗法(例如,使用卡铂、紫杉醇、卡铂、顺铂、多西他赛、吉西他滨、依托泊苷(etoposido)、培美曲塞、西妥昔单抗或其组合的任一种或多种的新辅助疗法)。在一些实施方案中,分析GalNAc-T13或其变体在从受试者获得的样品中的水平包括测量编码GalNAc-T13或其变体的核酸水平、GalNAc-T13或其变体的蛋白水平或其组合。在一些实施方案中,来自受试者的样品是在癌症治疗之前、期间或之后获得的。在一个实施方案中,受试者患有癌症,例如肺癌。在一个实施方案中,所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一个特定实施方案中,NSCLC是腺癌。在各种实施方案中,来自受试者的样品是从组织、血液、血浆或其组合获得的。
GalNAc-T13表达的分析
在本文描述的方法、测定和方法的各种实施方案中,测定GalNAc-T13或其变体包括测量样品中存在的编码GalNAc-T13或其变体的核酸的量、测量样品中存在的GalNAc-T13蛋白或其变体蛋白的量或其组合。
在本文描述的方法、测定和方法的各种实施方案中,分析样品包括用特异性针对GalNAc-T13或其变体的抗体检测GalNAc-T13或其变体的水平。在各种实施方案中,抗体是单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和单链抗体的任一种或多种。在一个实施方案中,抗体是单克隆抗体。可使用的单克隆抗体的实例是结合GalNAc-T13或其变体的序列LLPALR的T13.5单克隆抗体。
在本文描述的方法、测定和方法的一些实施方案中,分析样品包括在严格杂交条件下,用能够与针对GalNAc-T13或其变体具有特异性的mRNA杂交的多核苷酸,测量样品中存在的编码GalNAc-T13或其变体的mRNA的水平。
可用于估计样品中存在的编码ppGalNAc-T13或其变体的核酸的量的技术包括但不限于原位杂交(如,Angerer(1987)Meth.Enzymol 152:649)。基于优选杂交的测定包括但不限于传统“直接探针”法(诸如DNA印迹或原位杂交(如,FISH和FISH+SKY))和“比较探针”法(诸如比较基因组杂交(CGH),如基于cDNA或基于寡核苷酸的CGH)。该方法可以各种形式使用,包括但不限于底物(如膜或玻璃)结合方法或基于阵列的方法。通常,可以用放射性同位素或荧光报告物将用于核酸分析的探针标记。优选的探针足够长,因而能够与一种或多种靶核酸在严格条件下特异性杂交。优选的大小范围是约200个碱基至约1000个碱基。适用于本发明方法的杂交方案描述于例如下述文献中:Albertson(1984)EMBO J.3:1227-1234;Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:9138-9142;EPO Pub.No.430,402;Methods in Molecular Biology,第33卷:In situ Hybridization Protocols,Choo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.(1994),Pinkel,等(1998)Nature Genetics 20:207-211和/或Kallioniemi(1992)Proc.NatlAcad Sci USA 89:5321-5325(1992)。
“定量”扩增的方法为本领域的技术人员所熟知。例如,定量PCR涉及使用相同的引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可用于校正PCR反应的内标。定量PCR的详细方案可参见Innis,等(1990)PCR Protocols,AGuide to Method and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.)。使用定量PCR分析测量在微卫星位点处的DNA拷贝数描述于Ginzonger,等(2000)CancerResearch 60:5405-5409中。所述基因的已知核酸序列足以能够使本领域的技术人员常规选择扩增该基因的任何部分的引物。荧光定量PCR还可用于本发明的方法中。在荧光定量PCR中,定量基于荧光信号如TaqMan和sybr绿的量。
其它适合的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(LCR)(参见Wu和Wallace(1989)Genomics 4:560,Landegren,等(1988)Science 241:1077,及Barringer等(1990)基因89:117)、转录扩增(Kwoh,等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173)、自持续的序列复制(Guatelli,等(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:1874)、斑点PCR(dot PCR)及连接接头PCR(linker adapter PCR)等。
如本文所述,具有不等变异的双尾学生t检验可用于测量患者的GalNAc-T13表达与正常血液样品或患者自身血液(匹配对照)或通过计算机算法汇集许多对照样品产生的参考之间的差异。当p值等于或小于0.05时,可获得显著差异。GalNAc-T13mRNA表达还可用于确定患者的预后和对化疗的响应,其中GalNAc-T13mRNA表达被分为两组:具有高ppGalNAc-T13表达的那些和具有低或检测不到的GalNAc-T13表达的那些。所述组可由中位GalNAc-T13表达分开,并且用卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)随时间作图。
适用于测定GalNAc-T13或其变体的表达水平的方法包括但不限于使用DNA测序、比较基因组杂交(CGH)、阵列CGH(aCGH)、SNP分析、mRNA表达测定、RT-PCR、实时PCR或其组合。在各种实施方案中,检测GalNAc-T13的编码核酸或蛋白水平的测定是RNA印迹分析、DNA印迹分析、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹分析或其组合的任一种或多种。在一些实施方案中,受试者中GalNAc-T13的水平可通过测量酶GalNAc-T13作用于的底物确定,使得底物起到GalNAc-T13的替代标志物的作用。
多克隆和单克隆抗体均可通过技术人员自己使用熟知的方法生产,或者它们可通过专门从事基于已知蛋白序列制备抗体的服务提供商来制造。在本发明中,所述蛋白序列是已知的,因此生产针对它们的抗体是常规的。
例如,可使用传统杂交瘤方法,通过用抗原(其可为选择的经分离蛋白或其片段(例如,GalNAc-T13或其片段或其变体))第一免疫小鼠并制备各自产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,来产生单克隆抗体。然后使用如ELISA或抗原微阵列测定或免疫斑点印迹技术(immuno-dot blot technique),测定由不同克隆分泌的抗体结合抗原的能力。可使用常规方法和使用用于免疫的抗原及其它抗原作为对照,选择对检测目标蛋白最有特异性的抗体。选择最特异性检测目标抗原和蛋白的抗体,并且不选择其它抗原或蛋白用于本文描述的方法、测定和方法。
然后可在适合的细胞培养基中长期培养最佳克隆。还可以将它们注射到小鼠(在腹膜腔中,肠周围)中,其中它们产生富含抗体的腹水,从腹水中可分离和纯化所述抗体。可使用本领域普通技术人员熟知的技术纯化所述抗体。
在本发明的方法和测定中,使用对GalNAc-T13蛋白或其片段或其变体有特异性的抗体和检测各抗体与其相应的同源标志物的免疫特异性结合确定任何GalNAc-T13或其片段的存在。
可使用任何合适的免疫测定方法,包括可商购获得的那些,以确定根据本发明测量的GalNAc-T13或其变体的水平。在此不需要对已知的免疫测定技术进行大量讨论,因为这些为本领域技术人员所知。典型的合适免疫测定技术包括夹心酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争结合测定、均相测定、非均相测定等。各种已知的免疫测定方法综述于如,Methods inEnzymology,70,第30-70页和166-198(1980)中。
在本发明的测定中,可使用“夹心型”测定形式。此类夹心型测定的一些实例描述于授予Grubb等的美国专利第4,168,146号和授予Tom等的美国专利第4,366,241号中。可替换的技术是“竞争型”测定。在竞争测定中,经标记的探针通常与与分析物相同或为分析物类似物的分子缀合。因此,经标记的探针与目标分析物竞争可用的相容性材料。竞争测定通常用于检测分析物诸如半抗原,每种半抗原为单价的,并且仅能够结合一种抗体分子。竞争免疫测定装置的实例描述于授予Deutsch等的美国专利第4,235,601号、授予Liotta的美国专利第4,442,204号及授予Buechler等美国专利第5,208,535号等中。
可对所述抗体进行标记。在一些实施方案中,检测抗体可通过共价连接至酶、具有荧光化合物或金属的标记、具有化学发光化合物的标记来标记。例如,检测抗体可通过用过氧化氢酶来标记,并且转化使用包含碘化钾、过氧化氢和硫代硫酸钠的比色底物组合物;所述酶可为醇脱氢酶,并且转化使用包含醇、pH指示剂和pH缓冲液的比色底物组合物,其中pH指示剂是中性红并且pH缓冲液是甘氨酸-氢氧化钠;所述酶还可为次黄嘌呤氧化酶,并且转化使用包含黄嘌呤、四唑盐及4,5-二羟基-1,3-苯二硫酸的比色底物组合物。在一个实施方案中,检测抗体通过共价连接至酶、具有荧光化合物或金属的标记或具有化学发光化合物的标记来标记。
直接和间接标记可用于免疫测定中。直接标记可被定义为一种实体,在其天然状态下其裸眼可见或借助于滤光器和/或为促进施加的刺激(如紫外光)可见。可使用的有色标记的实例包括金属溶胶粒子、金溶胶粒子、染料溶胶粒子、染色的乳胶粒子或包封于脂质体中的染料。其它直接标记包括放射性核素和荧光或发光部分。还可根据本发明使用间接标记(诸如酶)。已知各种酶可用作标记,诸如例如,碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶及尿素酶。对于免疫测定中酶的详细讨论参见Engvall,Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT,Methods of Enzymology,70,419-439(1980)。
所述抗体可连接至表面。为了检测目标抗原可连接抗体于其上的有用的表面的实例包括硝酸纤维素、PVDF、聚苯乙烯和尼龙。所述表面或载体还可为多孔载体(参见,如,美国专利第7,939,342号)。所述测定可以包括授予PB诊断系统公司(PB Diagnostic Systems,Inc)的美国专利第4,906,439号;第5,051,237号及第5,147,609号中描述的那些的各种测定装置形式进行。
在本文描述的方法、测定和方法的一些实施方案中,检测抗体相对于GalNAc-T13或其变体的水平包括,使来自癌症患者的样品与特异性结合GalNAc-T13或其变体的抗体或其片段接触、在抗体与样品中存在的GalNAc-T13或其变体之间形成抗体-蛋白复合物、洗涤样品以去除未结合的抗体、添加经标记且与结合至样品中的GalNAc-T13或其变体的抗体反应的检测抗体、洗涤以去除未结合的经标记的检测抗体及将标记转化为可检测的信号,其中可检测的信号表明在来自患者的样品中GalNAc-T13或其变体的水平。在一些实施方案中,效应器组件是选自以下的可检测部分:荧光标记、放射性化合物、酶、底物、表位标签、电子致密试剂、生物素、地高辛(digonigenin)、半抗原及其组合。在一些实施方案中,检测抗体通过共价连接至酶标记、用荧光化合物或金属标记、用化学发光化合物标记。可通过测量由抗体-蛋白复合物形成所产生的光散射强度,获得GalNAc-T13的水平,所述抗体-蛋白复合物经由样品中的GalNAc-T13与抗体反应所形成,其中所述光散射强度高对照光散射强度至少10%表明了化疗抗性的可能性。
在本发明的方法、测定和方法的各种实施方案中,化疗抗性的可能性增加可能会导致不良预后,其中所述不良预后包括存活可能性降低、预期寿命缩短或肿瘤干性增强。
在本发明的方法、测定和方法的各种实施方案中,本文描述的方法还包括向受试者开出第一疗法的处方(如果受试者具有良好预后),或者向受试者开出第二疗法或第一疗法与第二疗法的处方(如果受试者具有不良预后)。
参考值
在本文描述的方法、测定和方法的各种实施方案中,参考值基于GalNAc-T13或其变体的表达水平。在一个实施方案中,所述表达水平是在癌细胞中。在另一个实施方案中,所述表达水平是在非癌细胞中。在额外的实施方案中,所述表达水平是在任何细胞中。在一些实施方案中,参考值是在不患有癌症的受试者群体中的GalNAc-T13或其变体的平均或中位表达水平。在其它实施方案中,参考值是在患有癌症且对化疗响应的受试者群体中的GalNAc-T13或其变体的平均或中位表达水平。在一些实施方案中,包括患有癌症且对化疗响应的受试者群体的参考值显示了GalNAc-T13的表达不可检测或显示了GalNAc-T13表达降低。在另外的实施方案中,参考值是在不同(例如,稍早)时间点(诸如诊断期间、治疗前、治疗后或其组合)从受试者获得的样品中的GalNAc-T13或其变体的表达水平。在一些实施方案中,所述癌症是肺癌。
在各种实施方案中,GalNAc-T13或其变体在癌症受试者中的表达水平与参考值相比增加了至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在各种实施方案中,GalNAc-T13或其变体在癌症受试者中的表达水平与参考值相比增加了至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或其组合。
疗法
根据本发明的各种实施方案,可选择、使用和/或施用本文描述的疗法以治疗癌症患者(例如肺癌患者)。在各种实施方案中,第一疗法可为手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。在各种实施方案中,如果GalNAc-T13或其变体存在于受试者中或者GalNAc-T13或其变体的水平在受试者中已经升高(这表明(例如,NSCLC)患者中的化疗抗性),则施用第二疗法。第二疗法包括手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合。在一些实施方案中,可将化疗包括在第二疗法中,施用更高剂量的化疗药物、施用化疗药物的组合或其组合。
在一些实施方案中,化疗剂可选自如下物质中的任一种或多种:细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷酸类似物、植物生物碱和毒素;及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷化剂:苏消安和曲磷胺;植物生物碱:长春花碱、紫杉醇、多西他赛;DNA拓扑异构酶抑制剂:阿霉素、表柔比星、依托泊苷、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、替尼泊苷、克雷斯托和丝裂霉素;叶酸拮抗剂:甲氨蝶呤、霉酚酸和羟基脲;嘧啶类似物:5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷和阿糖胞苷;嘌呤类似物:巯基嘌呤和巯鸟嘌呤;DNA抗代谢物:2’-脱氧-5-氟尿苷、阿非迪霉素甘氨酸和吡唑啉咪唑(pyrazoloimidazole);和抗有丝分裂剂:软海绵素、秋水仙素和根霉素。还可使用包含一种或多种化疗剂的组合物(如,FLAG、CHOP)。FLAG包含氟达拉滨、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和强的松。在另一个实施方案中,使用PARP(如,PARP-1和/或PARP-2)抑制剂,并且此类抑制剂为本领域所熟知的(如,奥拉帕尼(Olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15(N-基因研究实验室(N-GeneResearch Laboratories,Inc.));INO-1001(伊诺泰克制药公司(InotekPharmaceuticals Inc.));PJ34(Soriano等,2001;Pacher等,2002b);3-氨基苯甲酰胺(艾美捷(Trevigen));4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺;(艾美捷(Trevigen));6(5H)-菲啶酮(Trevigen);苯甲酰胺(美国专利Re.36,397);和NU1025(Bowman等)。
在各种实施方案中,第一和/或第二疗法包括使用化疗剂治疗肺癌。此类药剂包括但不限于甲氨蝶呤(Abitrexate)、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)(紫杉醇白蛋白-稳定的纳米颗粒制剂)、阿法替尼、爱宁达(培美曲塞二钠)、阿瓦斯汀(贝伐单抗)、贝伐单抗、卡铂、顺铂、克唑替尼、盐酸埃罗替尼、黄菲林(Folex)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、黄菲林PFS(Folex PFS)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、吉非替尼、阿法替尼(Gilotrif)(阿法替尼(Afatinib))、盐酸吉西他滨、健择(盐酸吉西他滨)、易瑞沙(吉非替尼)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤LPF(Methotrexate LPF)、氨甲喋呤钠(Mexate)、氨甲喋呤钠-AQ(Mexate-AQ)、尼维鲁美(Nivolumab)、尼次杜姆美(Necitumumab)、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、Paraplat(卡铂)、铂尔定(Paraplatin)(卡铂)、培美曲塞二钠、顺式铂(Platinol)(顺铂)、氯氨铂(Platinol-AQ)(顺铂)、特罗凯(Tarceva)(盐酸埃罗替尼)、他克唑(紫杉醇)、赛可瑞(Xalkori)(克唑替尼)或其组合。
在各种实施方案中,疗法包括例如,放射疗法。放射疗法中使用的放射可以是电离放射。放射疗法还可为γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外束放射疗法、放射性同位素(I-125、钯、铱)的间质植入、放射性同位素(诸如锶-89)、胸廓放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或腹部和骨盆的总放射疗法。对于放射疗法的综述,参见Hellman,Chapter 16:Principlesof Cancer Management:Radiation Therapy,第6版,2001,DeVita等编辑,J.B.Lippencott Company,Philadelphia。放射疗法可作为外射束放射或远距疗法来施用,其中放射定向来自远处源。放射治疗还可作为内部疗法或近距离内放射疗法(brachytherapy)来施用,其中放射源置于体内接近癌细胞或肿瘤块。还涵盖了使用光动力疗法,其包括施用光敏剂,诸如血卟啉及其衍生物、维替泊芬(Vertoporfin)(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基-竹红菌素A;和2BA-2-DMHA。
在各种实施方案中,疗法包括,例如免疫疗法。免疫疗法可包括,例如使用癌症疫苗和/或敏化抗原呈递细胞。免疫疗法可涉及用于短期保护宿主的被动免疫,所述被动免疫是通过施用预形成的可抗癌症抗原或疾病抗原的抗体(如,向肿瘤抗原施用任选地连接至化疗剂或毒素的单克隆抗体)实现的。免疫疗法还可集中在使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别的表位。
在各种实施方案中,疗法包括,例如激素疗法。激素治疗性治疗可包括,例如,激素激动剂、激素拮抗剂(如,氟他胺、比卡鲁胺、它莫西芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和处理的抑制剂及类固醇(如,地塞米松、类维生素A、氟尿苷(deltoids)、倍他米松、皮质醇、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌性激素、睾酮、孕酮)、维生素A衍生物(如,全反式维甲酸(ATRA));维生素D3类似物;抗促孕激素(如,米非司酮、奥那司酮)或抗雄激素(如,醋酸环丙孕酮)。
用抗癌症疗法进行的治疗的持续时间和/或剂量可根据具体的抗癌剂或其组合变化。对于具体的癌症治疗剂,适当的治疗时间将由技术人员所理解。本发明涵盖对每种癌症治疗剂的最佳治疗方案的持续评估,其中如通过本发明方法确定的受试者癌症的遗传标志是确定最佳治疗剂量和方案的因素。
在各种实施方案中,被测定抗癌症疗法的预测功效的受试者是哺乳动物(如,小鼠、大鼠、灵长类动物、非人哺乳动物、家养动物(诸如狗、猫、牛、马)),并且优选人。在本发明方法的另一实施方案,受试者没有进行化疗或放射疗法。在替代性实施方案中,受试者已经进行了化疗或放射疗法(如,诸如用顺铂、卡铂和/或紫杉烷)。在相关的实施方案中,受试者尚未暴露于比通常或一般说来该物种的受试者遇到的那些水平高的水平的放射或化学毒剂。在某些实施方案中,受试者己进行了去除癌性或癌症前期组织的手术。在其它实施方案中,尚未去除癌性组织,如癌性组织可位于身体不宜动手术的区域(诸如在生命必需的组织中或在手术程序将导致对患者造成危害的显著风险的区域中),或者如对去除癌性组织之前给予受试者抗癌疗法。
样品
样品,诸如癌细胞、癌性组织、血浆和/或血液,可优选在活检期间收集以诊断癌症。这将允许有最佳时机来设计将对患者最起作用的疗程。例如,如果GalNAc-T13或其变体的表达已经增加,则与另一个患有癌症但GalNAc-T13表达不增加的患者相比,所述患者可能需要更具侵略性的疗程。还可能在癌症治疗(如,手术)之后或癌症治疗(如,放射化疗等)期间,获得癌性组织、血浆和/或血液。这将允许对疗程进行改变或从复发角度决定疗程。在各种实施方案中,所述癌症是肺癌。在一些实施方案中,所述肺癌是非小细胞肺癌。在一个实施方案中,NSCLC是腺癌。
本发明所涉及的步骤包括通过手术活检或手术切除获得患者肺肿瘤的样品和匹配来自患者的血液样品。可选地,样品可通过原发性患者收集的肺肿瘤干细胞、原发性患者肺肿瘤衍生细胞系或者以FFPE(福尔马林固定的,石蜡包埋的)样品形式存档的患者样品或者鲜冻的肺肿瘤样品获得。本发明还使得能够回顾性评估本发明以上提及的部分(即存活的可能性、评估的预期寿命及将来获取该突变的潜力)。
然后使用命名“QIAamp DNA Mini and Blood Mini试剂盒”为标准方案,使用患者的肿瘤样品提取脱氧核糖核酸(DNA),或者对于FFPE样品使用可从商购获得的“QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒”。以上和以下程序需要来自患者的知情同意。
本发明提供了确定癌细胞对化疗的响应性的系统,其中癌细胞获自癌症患者。该系统包括被配置以产生编码获自癌症患者的癌细胞中存在的GalNAc-T13的mRNA的信号的样品分析仪,及被程序化以基于上述mRNA计算该信号是大于还是小于参考值的计算机子系统。
本发明还提供了用于确定癌细胞对化疗的响应性的系统,其中癌细胞获自癌症患者。所述系统包括被配置为当GalNAc-T13-特异性抗体结合获自癌症患者的癌细胞中的GalNAc-T13时产生信号的样品分析仪,及被程序化以基于抗体结合计算信号是大于还是小于参考值的计算机子系统。
在一些实施方案中,计算机子系统被程序化以基于算法,比较mRNA来确定所述癌细胞对化疗的响应的可能性,如果GalNAc-T13表达增加,则所述算法将所述患者归类为可能对包括化疗的疗法响应,和如果GalNAc-T13不增加,则所述算法将所述患者归类为不可能对包括化疗的疗法响应。
本发明还提供了计算机可读介质中包含的计算机程序产品,所述计算机程序产品当在计算机上执行时进行包括在包含获自癌症患者的癌细胞的样品中检测GalNAc-T13表达和比较GalNAc-T13表达与参考值的步骤。用于检测癌症患者对化疗响应的可能性的诊断试剂盒包括不超过10种探针(包括针对GalNAc-T13的可检测的经标记的探针或引物的组合)和本文描述的计算机程序产品。
实施例
提供以下实施例以更好说明要求保护的发明,并且以下实施例并不应该被理解为限制本发明的范围。就提及的特异性材料来说,其仅用于说明的目的,并非意在限制本发明。本领域的技术人员可在不使用创新能力和不背离本方面范围的情况下,开发等效的方式或反应物。
O-糖基化变化发生在大多数癌中,从而导致分子表达,其可组成用于诊断和治疗的有用靶。GalNAc-T13酶催化0-糖基化起始中的关键步骤。其在转移性神经母细胞瘤中过表达,并且已经与患有该肿瘤的患者的预后相关。在切除的肺癌样本中,没有关于GalNAc-T13表达的信息。
如下详述,本申请人使用含有443个NSCLC的肿瘤组织微阵列,其包括249种腺癌(ADCA)和122种鳞状细胞癌(SCC)。使用特异性针对GalNAc-T13的单克隆抗体进行免疫组织化学。使用四值强度评分(0、1+、2+和3+)和每个组织核心中的反应性的程度百分比(0-100%)对所述酶的细胞质表达定量。然后通过将强度乘以反应性扩展值(范围,0-300)来获得最终评分。将患者分为2组:进行新辅助疗法(n=72,WNA)和不进行新辅助(n=371,WONA)化疗。
如下所述,申请人发现GalNAc-T13在NSCLC中频繁表达,而WNA和WONA(p=0.20)组之间无显著差异。ADCA在两个组中表达了比SCC高水平的所述酶(WNA,p=0.02;和WONA,p<0.0001)。在ADCA患者中,在进行或不进行新辅助疗法的情况下,根据组织学分型(WNA:p=0.002和WONA:p=0.044),GalNAc-T13表达是不同的,显示在实体组织学分型的存在下有较高的值而在鳞屑组织学分型的情况下则较低。使用斯皮尔曼相关性检验(Spearman Correlation test),GalNAc-T13与EpCAM(p<0.001)和TTF-1(p<0.01)表达显著相关。在ADCA中,我们发现GalNAc-T13表达与EGFR和KRAS突变状态及EML4-ALK融合基因的存在之间不相关。在ADCA-WNA亚群中,GalNAc-T13的高表达水平与较差的OS(p<0.01,HR=5.2)相关,这在RFS中不显著(p=0.15,HR=1.8)。相反,在GalNAc-T13表达与ADCAWONA亚群患者中的结果之间并未发现相关性。GaINAc-T13在NSCLC中频繁表达并且与接受了新辅助疗法化疗的ADCA患者中的不良预后相关。本文的数据表明GaINAc-T13是一种与NSCLC中的化学抗性相关的新型标志物。
实施例1
实验方法
细胞系
代表不同组织学类型、阶段和疾病情况的人肺癌细胞系(SK-MES-1、A549、NCI-H1703、NCI-H838、NCI-H1755、NCI-H526、NCI-H1650、NCI-H1975、H69AR和NL-20)购自ATCC,并且根据供应商的说明书体外培养。
抗-GalNAc-T13单克隆抗体的产生(T13.5杂交瘤产生方案)
免疫
在GalNAc-Ts家族成员之间展现出极高可变性的区域,选择GalNAc-T13的合成肽(RSLLPALRAVISRNQE,登录号BAC54545)(生物合成)。使用了来自兽医实验室分部(Division of Veterinary Laboratories)(DI.LA.VE.,蒙得维的亚,乌拉圭)的四只8周龄的Balb/c雌性小鼠。
将小鼠以2周的间隔免疫三次(第0天,腹腔内和第14天、第21天,皮下)。免疫混合物含有总体积为100μl的通过于PBS和弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)中的KLH运载的50%v/v 100μg的合成肽(完全用于第一免疫和部分用于以下)。
将小鼠在第一免疫之前放血,并在第24天和第31天收集血清(~100μl)。通过ELISA在第31天取样之后测定血清抗体滴度。该滴度达到1/3000。在融合前三天用类似混合物(于PBS和不完全弗氏佐剂中的100μg KLH-合成肽)皮下加强选择的小鼠。
融合方案
骨髓瘤细胞
将SP2/O骨髓瘤细胞系在融合前10天解冻,并在DMEM 2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10%SBF中在37℃下在5%CO2潮湿气氛中培养。融合前当天,将骨髓瘤细胞分入具有补充有20%SBF的培养基的新鲜瓶中。将所有培养基(补充有2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠、具有和不具有SBF20%的DMEM)和PEG 1,450(西格玛(Sigma))在使用前预热至37℃。将骨髓瘤细胞汇集并计数,然后在脾细胞恢复期间置于培养箱中无SBF的完全DMEM中的50ml管内。
脾细胞
将所述小鼠经由颈椎脱臼法安乐死并置于含有70%乙醇的烧杯中。在层流通风橱中使用无菌技术移除脾,并将其转移至含有3ml无血清的完全DMEM的Potter-Elvehjem型组织研磨器(西格玛)中。将脾均质化,且将脾细胞转移至于无SBF的完全DMEM中的50ml管,并计数。将脾细胞和骨髓瘤细胞在1000rpm下离心5分钟,然后重新悬浮于10ml无SBF的完全培养基中。将骨髓瘤细胞和脾细胞汇以1/2的比例集于新鲜的50ml管中,并在相同的条件下离心。
融合
将上清液从细胞混合物倒掉,并将沉淀通过手指轻弹轻轻地重悬浮于剩余液体中。在1分30秒内通过轻轻旋转管缓慢添加1.5ml 37℃预热的PEG,然后在3分钟内缓慢添加20ml无血清培养基。将细胞1000rpm离心5分钟并涂铺于96孔培养板(200μl/孔)中的HAT培养基20%SBF内,然后置于在5%CO2潮湿气氛下的37℃培养箱中。在第4天和第7天,将培养基的50%替换为新预热的HAT培养基。
克隆测试
在10-14天后,当克隆裸眼可见时,将板通过倒置显微镜筛选以选出待测试的孔。筛选是通过使用涂覆有通过BSA载有的特异性肽的微量滴定板的ELISA进行的。将来自ELISA阳性孔的细胞转移至24孔培养板内、计数并通过有限稀释至含有前一天用Balb/c脾细胞制备的饲养层的96孔培养板内克隆。10-15天后,所有具有单个克隆的孔通过ELISA再测试,并且将阳性克隆在24孔板及之后的25cm2瓶中扩展,并贮藏于液氮中的SBF 10%DMSO内。
通过表面等离子体共振分析单克隆抗体特异性
通过在BIAcore 3000仪器(通用电气医疗集团,瑞典(GE Healthcare,Sweden))上进行表面等离子体共振实验,分析mAb 13.5和合成肽之间的相互作用。经纯化的mAb偶联至活化的羧甲基化葡聚糖CM-5传感器表面(SA传感芯片,通用电气医疗集团,瑞典)。将肽在HBS-EP缓冲液(10mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005%表面活化剂P20,pH 7.4)中稀释,并经传感器芯片传递。所有实验都是一式两份在30μL/min流速、180秒的接触时间及360秒的解离时间的条件下用配备了25℃恒温器的生物传感器仪器进行的。解离后,通过在每个实验末期注射10mM甘氨酸–HCl(pH 2.5)还原传感器芯片。所有数据处理使用由BIAcore提供的BIAevaluation 4.1软件进行。
RT-PCR
根据制造商的说明书,从肺癌细胞系用Tri-试剂(西格玛)提取总RNA。将2μg的总RNA包括以用于通过使用200单位的M-MLV逆转录酶(安玛西亚,皮斯卡塔韦,新泽西州(Amersham,Piscataway,NJ))在2μl 10mM各脱氧核苷三磷酸(dNTP)和200ng随机六聚体(富酶泰斯公司,马里兰州(Fermentas Inc,Maryland))的存在下在20μl总反应体积中合成第一链cDNA。在37℃孵育1小时后,将混合物加热至70℃、快速冷却并贮藏于-20℃。使用以下特异性引物,进行425bp的GALNT13转录物的扩增:5’-ACATCTATCCGGACTCCC-3’和5’-TCATGTGCCCAAGGTCATGTTCC-3’(登录号AJ505991)。PCR混合物(25μl的总反应体积)包括20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、200μM dNTP、300nM各引物及1单位的Taq DNA聚合酶(富酶泰斯公司,马里兰州(Fermentas Inc,Maryland))。在以下条件下进行35个循环的扩增:95℃,45秒;62℃,1分钟;和72℃,1分钟。通过在2%琼脂糖凝胶的电泳,通过溴化乙锭染色后,直接可视化分析PCR产物(15μl)。
免疫荧光显微术
将涂铺在盖玻片上的细胞用PBS洗涤、在甲醇-丙酮50%中固定10分钟并贮藏于-20℃直至使用。然后将盖玻片解冻、于PBS中再水化并在30%山羊血清中封闭20分钟。然后将一级抗体T13.5在室温下孵育1小时,并在三次洗涤后(每次都在PBS中,5分钟)将与Alexa488染料缀合的二级抗体在室温下孵育1小时。将单层用DAPI复染色、固定在PBS-甘油50%中,并通过常规落射荧光显微术或使用Zeiss LSM 510共焦显微镜通过共焦免疫荧光显微术分析。
患者和免疫组织化学分析
在2003年至2005年之间,在德克萨斯大学MD安德森癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center,Houston,Texas),我们从出于根治性目的已经进行了手术切除的患者收集了来自手术切除的原发性肺腺癌的肿瘤组织。在所有病例中,从电子临床记录取回临床病理信息,并且所述临床病理信息包括年龄、性别、吸烟史及状态(当前、之前或从不吸烟)、肿瘤大小、根据国际癌症研究协会(the International Association for the Study of LungCancer,IASLC)[Detterbeck,2009分类系统]的肿瘤阶段、新辅助和辅助治疗和RFS和OS率的后续信息。。
将组织微阵列(TMA)用石蜡包埋的福尔马林固定的来自443名手术切除的NSCLC患者的组织构建。我们在5-uM厚的TMA切片上使用针对ppGalNAc-T13(mAb T13.5)具有特异性的单克隆抗体,进行了免疫组织化学。将组织切片脱蜡和水合,并于去封闭室(decloaking chamber)中在pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复(121℃×30分钟,90℃×10分钟)并用Tris缓冲液洗涤。在室温下用3%于甲醇中的H2O2进行15分钟氧化酶阻断。用Dako无血清蛋白进行蛋白阻断30分钟。将载玻片与一级抗体在室温下孵育90分钟,并用Tris缓冲液洗涤,然后与Envision Dual-Link系统-辣根过氧化物酶(Dako)孵育30分钟。
使用0.5%的3,3'-二氨基联苯胺进行染色5分钟,然后用苏木素复染色、脱水和固定,其中,0.5%的3,3'-二氨基联苯胺是用咪唑HCl缓冲液新鲜配制的,pH 7.5,含过氧化氢和抗微生物剂(Dako)。。
使用四值强度评分(0、1+、2+和3+)和每个核心中的反应性的程度百分比(0-100%)对GalNAc-T13的细胞质免疫染色定量。然后通过将强度乘以反应性扩展值(范围,0-300)来获得最终评分。根据我们群体中的分布,中值被认为是截断值:40。因为他们已经接受或未接受新辅助疗法,所述群体被分为2组:72名患者接受了新辅助疗法(WNA)和371名患者未接受新辅助疗法(WONA),然后我们将腺癌(ADCA)和鳞状(SQM)作为独立的组分析。
实施例2
特异性针对GalNAc-T13的单克隆抗体的产生,所述GalNAc-T13用于石蜡包埋组织的免疫组织化学研究。
考虑到GalNAc-T13与GalNAc-T1相比展现出了84%的同源性,我们用与GalNAc-T1序列不具有任何同源性的KLH-缀合的GalNAc-T13特异性基序(RSLLPALRAVISRNQE)免疫了小鼠(图1A)。通过ELISA进行特异性杂交瘤的选择,从而筛选针对BSA-缀合的GalNAc-T13肽。针对合成肽具有强反应性的mAb、T13.5中的一个用于进一步表征。我们使用在杆状病毒中表达的GalNAc-T1和-T13,评估了蛋白质印迹中的mAb T13.5反应性。我们发现所述抗体与GalNAc-T13反应而不与GalNAc-T1反应(图1B),这确定了该抗体针对GalNAc-T13的特异性并且其结合至变性形式的蛋白。为了确定哪种氨基酸残基对mAb T13.5结合重要,我们使用涵盖序列RSLLPALRAVISRNQE的重叠肽测定表位的位置。使用BIAcore评估结合至固定的抗体的肽(图1C)。获得的结果表明mAb T13.5的表位的位置可被测定至残基LLPLAR。考虑到之前已在神经母细胞瘤中报道了ppGalNAc-T13表达(Berois等,2006a),我们使用MAb T13.5对IMR-32细胞系进行了免疫细胞化学分析(图1D)。如对位于高尔基体中的糖基转移酶所期待的那样,我们发现了在细胞核周围区域中主要检测到的强染色。神经母细胞瘤肿瘤中的免疫组织化学评估(图1E)表明mAb T13.5能够检测到用于病理学常规诊断中的石蜡包埋组织内的GalNAc-T13。
实施例3
GalNAc-T13在人肺癌细胞中表达。
表现出局部晚期疾病的七十二名肺癌患者在手术前接受了新辅助疗法。用如下之一来治疗患者:卡铂与紫杉醇、或卡铂与多西他赛、或卡铂与吉西他滨、或卡铂与培美曲塞、或卡铂与依托泊苷(etoposid)、或顺铂与多西他赛、或顺铂与依托泊苷、或顺铂与吉西他滨、或紫杉醇与西妥昔单抗。
据报道,GalNAc-T13是在神经元组织中特异性表达的糖基转移酶(Zhang等,2003)。在此,通过RT-PCR评估一组人肺癌细胞系,我们发现了在A549、NCI-H1703、NCI-H1755、NCI-H526、NCI-H1650、H69AR和NL-20细胞系中编码GalNAc-T13的mRNA(图2A)。相反,在SK-MES-1、NCI-H838和NCI-H1975细胞系中RT-PCR分析是阴性的。我们使用免疫荧光显微术(图2B)和蛋白质印迹(图2C)在蛋白水平确认了GalNAc-T13在人肺癌细胞中的表达。通过RT-PCR(图2A)和蛋白质印迹(图2C)获得的结果表明GalNAc-T13的剪接变体在人肺癌中表达。
使用基于菌落-PCR和核苷酸测序的策略,我们首次说明了一个大的GalNAc-T13的剪接变体家族(图3)。GalNAc-T13野生型是通过示于SEQ IDNO:1和2中的序列编码的。GalNAc-T13的外显子9缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx9是由示于SEQ ID No:3和4中的序列编码的。GalNAc-T13的外显子9中的39个核苷酸缺失的剪接变体GalNAc-T13Δ39bpEx9是由示于SEQ ID No:5和6中的序列编码的。GalNAc-T13的外显子10B缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx10B是由示于SEQ ID No:7和8中的序列编码的。GalNAc-T13的外显子2-7缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx2-7是由示于SEQID No:9和10的序列编码的。GalNAc-T13的外显子6缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx6是由示于SEQ ID No:11和12中的序列编码的。GalNAc-T13的外显子8缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx8是由示于SEQ ID No:13和14中的序列编码的。GalNAc-T13的外显子6和8缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx6ΔEx8是由示于SEQ ID No:15和16的序列编码的。GalNAc-T13的外显子6、外显子8缺失、GalNAc-T13的外显子9和外显子10B的39个核苷酸缺失的剪接变体GalNAc-T13ΔEx6ΔEx8Δ39bpEx9ΔEx10B是由示于SEQ ID No:17和18中的序列编码的。
实施例4
与NSCLC中的化学抗性相关的作为新型免疫组织化学标志物的GalNAc-T13。
在来自肺癌患者的443种原发性肿瘤中,评估MAb T13.5免疫染色。患者和肿瘤的特征示于表I中。mAb T13.5通常显示出弥散性细胞质染色形式(图4)。我们发现在腺癌中的GalNAc-T13表达显著比在鳞状细胞肿瘤中的高(p<0.001)。在GalNAc-T13表达和EGFR与KRAS突变状况及EML4-ALK融合基因的存在之间未发现关联。在接受新辅助治疗的腺癌患者中,GalNAc-T13的高表达水平与较差的总存活率(p<0.01,HR=5.2)相关(图5A)。在晚期肿瘤患者中(图5B)以及早期腺癌患者(图5C)中观察到类似结果(图5B)。相反,我们没有发现在GalNAc-T13表达和没有进行新辅助治疗的腺癌患者中的结果之间有任何关联。这些数据强烈表明GalNAc-T13是一种与肺腺癌患者中的化学抗性相关的新型标志物。
表1:与肺癌原发性肿瘤中的GalNAcT13表达一致的研究群体的特征
1GalNAcT13高表达
2GalNAcT13低或不表达
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以上描述的各种方法和技术提供了多种实施本申请的方式。当然,应该理解,描述的所有目标或优势不必都可根据本文描述的任何具体实施方案来实现。因此,例如,本领域的技术人员将认识到该方法可以实现或优选如本文所教导的一种优势或一组优势的形式进行而不必实现如本文所教导或表明的其它目标或优势。本文提及了多种替换形式。应该理解,一些优选的实施方案特别包括一种、另一种或数种特征,同时另外的实施方案特别排除一种、另一种或数种特征,同时仍有其它的实施方案通过纳入一种、另一种或数种有利特征而减轻特定特征。
此外,技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地,本领域的普通技术人员可以各种组合的形式采用以上讨论的各种元素、特征和步骤,以及每种此类元素、特征或步骤的其它已知的等价物,以根据本文描述的原则实施方法。在所述各种元素、特征和步骤中,一些将被特别地包括在多种实施方案中,而其它的将被特别地排除出多种实施方案。
尽管在某些实施方案和实施例的上下文中已经公开了本申请,本领域的技术人员仍将认为本申请的实施方案将延伸到特别公开的实施方案之外,到其它可替换的实施方案和/或其用途和修改及等价物。
在一些实施方案中,术语“一个/一种(a,an)”和“所述/该(the)”及上下文所用的描述本申请具体实施方案的类似的引用(特别是在以下权利要求书中的某些的上下文中)可被理解为涵盖了单数和复数。对本文各值的范围的引用仅意在用作分别提及属于范围内的每个单独数值的速记方法。除非在本文中另外说明,否则每个单独的值如其在本文中单独引用那样被并入至说明书中。除非本文另外说明或除非上下文中明显矛盾,否则可以任何合适的顺序进行本文描述的所有方法。除非另外使用任何和所有实施例,或就本文的某些实施方案提供的示例性措辞(例如,“诸如”)仅意在更好地说明本申请,并且不会对以其它方式要求保护的本发明范围构成限制。不应将本说明书中的语言理解为表明任何未要求保护的组分对实施本发明是必要的。
本文描述了本发明优选的实施方案,包括本发明人已知的进行本申请的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读以上描述时,那些优选的实施方案的变更将变得显而易见。可考虑到技术人员可视情况采用此类变更,并且本申请可以不同于本文具体描述的方式实施本申请。因此,本申请的许多实施方案包括如适用法律所许可的所附的权利要求书引用的主题的所有修改和等价物。此外,在其所有可能的变更中,上述元素的任何组合均由本申请涵盖,除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。
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应该理解,本文公开的本发明的实施方案说明了本申请的实施方案的原则。可采用的其它修改可在本申请的范围内。因此,通过举例而不是限制的方式,可以依照本文的内容利用本发明的替代配置。因此,本申请的实施方案不受精确展示和描述的限制。
Claims (61)
1.一种方法,其包括:
(i)从希望了解化疗抗性可能性的癌症患者获得包含肿瘤细胞的样品;
(ii)测定所述样品以确定GalNac-T13或其变体的水平;和
(iii)如果GalNac-T13或其变体的水平相对于参考样品升高则确定所述受试者具有化疗抗性的可能性增加,或者如果GalNac-T13或其变体的水平与所述参考样品相同或相对于所述参考样品降低则确定所述受试者具有化疗抗性的可能性减小。
2.如权利要求1所述的方法,其中测定所述样品包括检测编码GalNac-T13或其变体的核酸的水平,确定GalNac-T13蛋白或其变体的水平,或其组合。
3.如权利要求2所述的方法,其中检测编码GalNAc-T13或其变体的核酸的水平包括确定所述样品中存在的编码GalNac-T13或其变体的mRNA的量。
4.如权利要求2所述的方法,其中检测pGalNAc-T13蛋白或其变体的水平包括用针对ppGalNac-T13或其变体具有特异性的抗体检测GalNac-T13或其变体的水平。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述单克隆抗体结合GalNAc-T13或其变体的表位LLPALR。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述受试者已经进行了新辅助化疗。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述癌症是肺癌。
9.如权利要求8所述的方法,其中肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
10.如权利要求9所述的方法,其中NSCLC是腺癌。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述样品是组织、血液、血浆或其组合。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述样品在癌症治疗之前、期间或之后获得。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述受试者是人。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述参考值是在未患有癌症的受试者的群体中的GalNAc-T13或其变体的平均或中位表达水平。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述参考值是在患有癌症和对化疗响应的受试者的群体中的GalNAc-T13或其变体的平均或中位表达水平。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述参考值是在获自不同时间点的样品中的来自所述受试者的GalNAc-T13或其变体的表达水平。
17.如权利要求1所述的方法,其还包括如果所述受试者具有化疗抗性的可能性减小则向所述受试者开出第一疗法的处方,或者如果所述受试者具有化疗抗性的可能性增加则向所述受试者开出第二疗法的处方。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述第一疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。
19.如权利要求17所述的方法,其中所述第二疗法是手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合的一种或多种。
20.如权利要求17所述的方法,其中所述第二疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种,其中化疗包括向所述受试者施用一种或多种之前未使用的化疗剂以治疗所述受试者,或向所述受试者以比之前施用的剂量更高的剂量施用之前施用的化疗剂。
21.一种用于确定有需要的受试者中的化疗抗性可能性增加的测定,其包括:
(i)提供来自患有癌症的受试者的生物样品;
(ii)提供特异性结合至GalNAc-T13或其变体的抗体;
(iii)使所述生物样品与所述抗体接触;和
(iv)使用免疫测定来检测结合至GalNAc-T13或其变体的抗体的水平,其中相对于参考样品在来自所述受试者的生物样品中存在结合表明所述受试者中化疗抗性的可能性增加。
22.一种用于为患有癌症的受试者选择疗法和任选地施用所述疗法的测定,所述测定包括:
(i)提供来自患有癌症的受试者的生物样品;
(ii)提供特异性结合至GalNAc-T13或其变体的抗体;
(iii)使所述生物样品与所述抗体接触;
(iv)使用免疫测定来检测结合至GalNAc-T13或其变体的抗体的水平,其中相对于参考样品在来自所述受试者的生物样品中结合增加表明在所述受试者中ppGalNAc表达增加和化疗抗性的可能性增加;和
(v)选择疗法,其包括如果所述受试者具有化疗抗性的可能性减小则向所述受试者开出第一疗法的处方,或如果所述受试者具有化疗抗性的可能性增加则向所述受试者开出第二疗法的处方。
23.如权利要求22所述的测定,其中所述第一疗法是任何是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。
24.如权利要求22所述的测定,其中所述第二疗法是手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合的一种或多种。
25.如权利要求22所述的测定,其中所述第二疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种,其中化疗包括向所述受试者施用一种或多种之前未使用的化疗剂以治疗所述受试者,或者向所述受试者以比之前施用的剂量更高的剂量施用之前施用的化疗剂。
26.如权利要求21或22所述的测定,其中检测对GalNAc-T13或其变体具有反应性的抗体的水平,其包括:
(i)使来自所述癌症患者的样品与特异性结合GalNAc-T13或其变体的抗体或其片段接触;
(ii)在所述抗体与所述样品中存在的GalNAc-T13或其变体之间形成抗体-蛋白复合物;
(iii)洗涤所述样品以去除未结合的抗体;
(iv)添加检测抗体,所述检测抗体是被标记的且对与所述样品中的GalNAc-T13或其变体结合的所述抗体具有反应性;
(v)洗涤以去除未结合的经标记的检测抗体;和
(vi)将所述标记转化为可检测的信号,其中所述可检测的信号表明来自所述患者的样品中的GalNAc-T13或其变体的水平。
27.如权利要求21或22所述的测定,其中所述样品是组织、血液、血浆或其组合。
28.如权利要求21或22所述的测定,其中所述抗体是单克隆抗体。
29.如权利要求28所述的测定,其中所述抗体结合GalNAc-T13或其变体的所述表位LLPALR。
30.如权利要求21或22所述的测定,其中所述受试者已经进行了新辅助化疗。
31.如权利要求21或22所述的测定,其中所述癌症是肺癌。
32.如权利要求31所述的测定,其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
33.如权利要求32所述的测定,其中NSCLC是腺癌。
34.如权利要求21或22所述的测定,其中所述样品是在癌症治疗之前、期间或之后获得的。
35.如权利要求21或22所述的测定,其中所述参考值是来自未患有癌症的受试者群体的平均或中值GalNAc-T13表达水平。
36.如权利要求21或22所述的测定,其中所述参考值是来自患有癌症且对化疗响应的受试者群体的平均或中值GalNAc-T13表达水平。
37.如权利要求21或22所述的测定,其中所述抗体还缀合至效应器组件。
38.如权利要求37所述的测定,其中所述效应器组件是选自以下的可检测的部分:荧光标记、放射性化合物、酶、底物、表位标签、电子致密试剂、生物素、地高辛、半抗原及其组合。
39.如权利要求26所述的测定,其中所述检测抗体通过共价连接至酶而被标记、用荧光化合物或金属进行标记、用化学发光化合物进行标记。
40.如权利要求26所述的测定,其中GalNAc-T13的水平通过测量由抗体-蛋白复合物形成所产生的光散射强度来获得,所述抗体-蛋白复合物通过所述样品中的GalNAc-T13与所述抗体反应形成,其中所述光散射强度超过对照光散射强度至少10%表明化疗抗性的可能性。
41.如权利要求21或22所述的测定,其中结合的存在是所述抗体与GalNAc-T13或其变体结合的增加。
42.一种用于治疗患有癌症的受试者和任选地施用所述疗法的方法,其包括:
(i)提供来自患有癌症的受试者的生物样品;
(ii)提供结合至GalNAc-T13或其变体的抗体;
(iii)使所述生物样品与所述抗体接触;
(iv)使用免疫测定来检测所述抗体是否结合GalNAc-T13,其中来自所述受试者的生物样品中的结合相对于参考样品增加表明在所述受试者中GalNAc-T13或其变体表达增加和化疗抗性的可能性增加;和
(v)如果所述受试者具有化疗抗性的可能性减小则向所述受试者开出第一疗法的处方,或者如果所述受试者具有化疗抗性的可能性增加则向所述受试者开出第二疗法的处方。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述第一疗法是任何是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种。
44.如权利要求42所述的方法,其中所述第二疗法是手术、放射、免疫疗法、疫苗或其组合的一种或多种。
45.如权利要求42所述的方法,其中所述第二疗法是手术、放射、化疗、免疫疗法、疫苗或其组合的任一种或多种,其中化疗包括向所述受试者施用一种或多种之前未使用的化疗剂以治疗所述受试者,或者向所述受试者以比之前施用的剂量高的剂量施用之前施用的化疗剂。
46.如权利要求42所述的方法,其中所述受试者已经进行了新辅助化疗。
47.如权利要求42所述的方法,其中所述癌症是非小细胞肺癌。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述NSCL是腺癌。
49.如权利要求42所述的方法,其中所述抗体结合GalNAc-T13或其变体的所述表位LLPALR。
50.如权利要求42中任一项所述的方法,其中化疗抗性是针对任一种或多种化疗剂的抗性。
51.一种抗体,其特异性结合GalNAc-T13或其变体。
52.如权利要求51所述的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
53.如权利要求51所述的抗体,其中所述抗体结合GalNAc-T13或其变体中的表位,其中所述表位包括所述序列LLPALR。
54.如权利要求51所述的抗体,其中所述抗体结合GalNAc-T13或其变体中的LLPALR表位。
55.一种用于确定癌细胞对化疗响应性的系统,其中所述癌细胞获自癌症患者,所述系统包括:
(i)被配置以产生编码从所述癌症患者获得的所述癌细胞中存在的GalNAc-T13的mRNA信号的样品分析仪;和
(ii)被程序化以基于所述mRNA计算所述信号是大于还是小于参考值的计算机子系统。
56.一种用于确定癌细胞对化疗的响应性的系统,其中所述癌细胞获自癌症患者,所述系统包括:
(i)当GalNAc-T13-特异性抗体结合获自癌症患者的所述癌细胞中的GalNAc-T13时被配置以产生信号的样品分析仪;和
(ii)被程序化以基于所述抗体结合计算所述信号是大于还是小于参考值的计算机子系统。
57.如权利要求55或56所述的系统,其中所述计算机子系统被程序化以基于算法比较所述mRNA从而确定所述癌细胞对化疗响应的可能性,如果GalNAc-T13表达增加则所述算法将所述患者归类为可能响应于包括化疗的疗法,和如果所述GalNAc-T13不增加则所述算法将所述患者归类为不可能响应于包括化疗的疗法。
58.如权利要求55或56所述的系统,其中所述参考值是来自未患有癌症的受试者群体的平均或中值GalNAc-T13表达水平,或者其中所述参考值是来自患有癌症且对化疗响应的受试者群体的平均或中值GalNAc-T13表达水平。
59.一种包含在计算机可读介质中的计算机程序产品,当在计算机上运行时,进行包括以下的步骤:
(i)检测样品中的GalNAc-T13表达,所述样品包含获自癌症患者的癌细胞;和
(ii)将所述GalNAc-T13表达与参考值比较。
60.如权利要求60所述的计算机程序,其中所述参考值是来自患有癌症且对化疗响应的受试者群体的平均或中值GalNAc-T13表达水平。
61.一种用于检测癌症患者对化疗响应的可能性的诊断试剂盒,其包括:
(i)不超过10种探针,包括针对GalNAc-T13的可检测的经标记的探针或引物的组合;和
(ii)如权利要求59所述的计算机程序产品。
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