CN104583775B - 分析标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分析标记，所述分析标记包含无定形碳粒子、附接到所述碳粒子的所述表面的官能化葡聚糖聚合物和共价结合到所述官能化葡聚糖聚合物的互补结合对的第一构件。本发明还提供了包括所述分析标记的装置，所述装置还包括辐射源，其能够产生在一定波长下的电磁辐射的一系列脉冲，使得所述标记吸收所述辐射，从而通过非辐射衰减产生能量；样品室，其包括具有热电元件或压电元件的换能器和能够将非辐射衰减产生的能量转换为电信号的电极；以及检测器，其能够检测所述换能器产生的所述电信号。

Description

分析标记
本发明涉及分析标记，具体地讲，涉及基于免疫分析法中所用的碳粒子的分析标记。
多个分析系统使用碳粒子作为检测缀合物(或标记)。一个这样的例子是使用眼睛可见的碳粒子的侧向流动条。另一个例子是在WO 2004/090512中所述的分析系统，该系统使用具有热电/压电换能器的装置以用于检测在分析过程中通过照明标记所产生的热。碳粒子非常适合该系统，因为在一定的波长范围内，包括光谱的紫外、可见和红外部分，碳粒子是电磁辐射的强吸收剂。另外，碳粒子不是特别质量致密的，所以它们能够很好地悬浮在样品中并且不会过度沉淀，过度沉淀会在使用热电/压电换能器的分析系统中引起干涉作用。
通常认为粒子碳具有可吸收疏水性材料的“活性”表面。例如，活性炭用于抽油烟机中的过滤器中，并且碳粒子用于纯化化学反应混合物。在后一种情况中，通常通过添加吸收杂质的活性炭来从反应容器中移除聚合物杂质和/或疏水性杂质。然后通过过滤移除炭。
因此，碳粒子已在分析中使用了一段时间，不是作为标记，而是作为移除过量的不需要的试剂的方法。具体地讲，碳粒子已用于从竞争免疫分析中移除过量的放射性标记的试剂(例如，胰岛素、叶酸、游离的T3、游离的T4)。碳粒子的这种用途在US 3,442,819、US 4,028,465以及N.Poznanski和W.J.Poznanski，Clin.Chem.(《临床化学》)，1969年，第15卷，第908-918页中有所描述。在该技术应用中，竞争反应在溶液中在放射性标记的小分子和内源性小分子之间进行，在该反应中这些分子竞争结合到固定数量的抗体。然后通过添加已预先用葡聚糖(或其他高分子)处理过的碳粒子来移除未接合到抗体的小分子部分。葡聚糖允许小分子而不是大分子穿过并结合到碳，所以碳-葡聚糖移除未结合的小分子，而不是结合到抗体的小分子部分。然后过滤碳-葡聚糖，并且通过测量剩余溶液的放射性来对结合试剂进行定量。
这些文献向读者提出了碳粒子对疏水性小分子具有比其对葡聚糖更大的亲和力。用于将小分子附接到胶态标记的常用方法是，首先将小分子共价附接到较大的载体(诸如大分子)，然后将缀合物附接到标记，即通过被动吸附。然而，如果制备了具有疏水性小分子的葡聚糖的共价缀合物，则可期待通过将小分子附接到碳而将缀合物结合到碳。因此，这似乎不是制备小分子的碳缀合物的好方法，因为小分子可能是不可获得的。
在文献中存在描述使用抗体涂覆的碳粒子作为分析标记的例子。例如，US 4,760,030描述了将抗体被动吸附到碳粒子上。然而，在US 4,760,030中粒子需要用氨基酸稳定，以将抗体涂覆到粒子上。还有一些参考了印度墨汁(India-ink)分析(也称为Geek分析)，其为碳粒子和抗体同时混合的凝集分析，并且在存在分析物的情况下发生凝集。另外，需要稳定剂以形成碳胶体。
US 5,252,496、US 5,559,041和US 6,506,612也描述了结合到碳粒子的抗体。这些专利使用Vulcan XC72碳粒子，其必须是稳定的以在水中形成胶体。这些专利描述了使用2％葡聚糖9,400作为稳定剂。US 5,252,496的栏13中的实例7描述了将单克隆抗体固定至碳。概括地说，碳粒子在具有2％葡聚糖的缓冲液中均匀分布，葡聚糖被描述为“悬浮助剂”。2小时后加入荧光素异硫氰酸酯(FITC)并且将该悬浮液温育12小时，然后在加入抗体之前洗涤若干次，然后进一步洗涤，并且将胶体储存在适当的储存缓冲液中。
抗体附接至粒子的机理尚不完全清楚。首先，FITC仅具有一个化学反应官能团，并因此不是交联剂，所以不存在FITC可将抗体共价连接到葡聚糖的预期机理。其次，异硫氰酸酯通常用于与胺类反应(以产生硫脲)，但也可与醇类反应(以产生硫代氨基甲酸酯)或被水解为胺。给定12小时的温育时间，FITC将与葡聚糖上的羟基反应或被水解。看起来所提出的结合机理是FITC以某种方式结合到葡聚糖碳的表面。不期望荧光素结合到葡聚糖，所以这意味着FITC结合(被动吸附)至碳自身的表面上。然后异硫氰酸酯基团不可用于结合至抗体上的赖氨酸基团(胺)。
US 6,506,612还描述了粘合剂通过交联剂共价结合至碳粒子表面上的初级被动吸附层的方法。第8栏第35-60行描述了此类共价连接，其中被动吸附层总是蛋白质。因此，US6,506,612提出，葡聚糖可首先用于稳定碳胶体，但其最终将会被小分子(诸如FITC)或蛋白质分子(诸如BSA、抗生物素蛋白或抗体)替代，小分子或蛋白质分子将比葡聚糖更强力地结合到碳。US 6,506,612还描述了在将抗体涂覆到碳上之前用FITC预处理抗体的方法，其作用可能是添加FITC基团到抗体使得抗体更疏水，并因此更强力地结合到碳。
US 5,529,901和US 5,641,689描述了选择碳粒子的类型(得自德固赛公司(Degussa)的SB4)的方法，所述碳粒子将在不添加稳定剂(诸如葡聚糖、PEG、甘氨酸等)的情况下在水中形成胶体。它们还描述了选择SB4(和类似粒子)以用于结合至分析物的结合组分(例如抗体)的直接共轭结合。因此这些专利提出了不使用葡聚糖作为稳定剂。事实上，它们将使用葡聚糖以稳定粒子描述为不必要的步骤，其可通过具体使用这些粒子而移除。
使用被动吸附方法来共轭结合通常用于分析中的碳粒子，参见US 5,529,901和US 5,641,689。该方法对于某些类型的碳具有特异性，特别是来自德固赛赢创公司(Degussa/Evonik)的Spezial Schwartz 4(SB4)(平均尺寸为100-200nm的无定形碳粒子)，其在不存在任何稳定剂的情况下在水中形成稳定的胶体。作为另外一种选择，大多数其他碳粒子需要稳定剂，诸如洗涤剂或大分子(例如葡聚糖、PEG、甘氨酸等)。被动吸附方法适用于大多数基于抗体的分析，但应当指出的是，大部分抗体在被动吸附期间失去活性，因为抗体在结合到表面时会变性(这与抗体被动吸附至微量滴定板的表面时发生的情况类似)。可用的经验方法是大约10％的被动吸附抗体将是活性的，剩余的90％为非活性的，这主要是因为抗体的变性。
对于需要非常高的灵敏度的分析而言，在碳粒子上具有较高的抗体负载是有益的，其可能需要另选的途径来被动吸附。较高的抗体负载驱动抗体-抗原交互作用的热力学平衡。每个粒子较高的抗体负载是优选的，而不是简单地添加更多的粒子，使得系统不会负载过多的粒子(从而导致非特异性结合)。另外，被动吸附抗体靠近碳的表面，这可使抗体完全空间受阻。就减少空间位阻而言，使抗体远离碳的表面可能是有益的。最后，使抗体被动吸附到碳上导致抗体的变性，这可潜在地促进非特异性结合。
在免疫性(也称为夹心或试剂-过量)免疫分析中，如在WO 2004/090512中所述，抗体(或类似试剂)位于传感器上，而另一种抗体在碳粒子上。然后，在存在待测分析物的情况下，碳粒子结合到传感器。两种抗体均以大量过量的方式存在。
在竞争分析中，存在(a)抗体在碳粒子上而分析物的类似物(即小分子)在传感器上，或(b)类似物(即小分子)在碳粒子上而抗体在传感器上。结合在不存在分析物的情况下发生，并且在存在分析物的情况下受到干扰(减少)。
术语“小分子”为免疫分析领域中的技术术语，它用于区分可在夹心分析中被测量的分子和那些不能被测量的分子。为了在夹心分析中进行测量，分子必须足够大以具有两个或更多个可分辨的表位(抗体结合位点)，使得两个抗体可同时结合至分子，使得分子可夹在捕获抗体和报告(或标记)抗体之间。如果分子不能形成夹心，则其就落入“小”分子的类别。分子量截留值为约2,000-5,000。
在实施竞争分析时，另外的要求是对系统中各种组分的水平具有更大的控制。对结合至碳的抗体，当使用被动吸附时更难以控制活性抗体的量。在竞争分析的替代形式中，其是必须结合到碳粒子的表面的小分子类似物。对于小分子来说这通常是不可能的；因为小分子太小，它们将不能吸附到表面，或者如果小分子吸附到表面，它们不能被抗体识别。因此，小分子通常共轭结合至较大的载体(诸如蛋白质)，然后载体结合到所关注的例如碳粒子的表面。
然而，现已发现，难以通过传统途径制备小分子-碳缀合物，传统途径将其共价附接至蛋白质分子(例如2-巨球蛋白、脱铁铁蛋白、β-半乳糖苷酶、β-淀粉酶、胶原(绵羊的)、伴刀豆球蛋白A、钥孔虫戚血兰素、肌球蛋白、脲酶、人甲状腺球蛋白、猪甲状腺球蛋白和牛甲状腺球蛋白)并随后将这些蛋白质结合至碳粒子的表面。这可能是因为小分子是特别疏水的(例如，类固醇、荧光素、免疫抑制剂)。这可使得蛋白质-小分子缀合物对于涂覆在碳粒子上而言太过疏水。材料随时间推移在溶液中为“粘的”(它们赋予过多的非特异性结合)或不稳定的。
因此，需要改善的方法来将抗体和小分子以及其他可能的结合剂(例如核酸)共轭结合到碳粒子的表面，以增加负载、控制负载、减少空间位阻并提高稳定性，从而通过降低分析灵敏度和提高精确度来改善分析性能。
因此，本发明提供了一种分析标记，其包括无定形碳粒子，附接到碳粒子的表面的官能化葡聚糖聚合物和共价结合到官能化葡聚糖聚合物的互补结合对的第一构件。
因此，本发明提供了一种共轭的碳粒子，使用葡聚糖将所关注的分子附接到碳粒子。
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1示出了用于本发明的WO 2004/090512的化学感测装置的示意图；
图2示出了根据本发明的盒；
图3示出了使用碳缀合物1和2的碳结合能力分析的图；
图4示出了使用碳缀合物1和2的肌钙蛋白I分析的图；
图5示出了29天内的BSA-dig(en)-FITC碳分析的图；
图6示出了室3中BSA-dig(en)-FITC碳缀合物的结合的减少的图；
图7示出了在BSA-dig(en)-FITC碳缀合物的洗涤之后室3结合的图；
图8示出了29天内的葡聚糖-FITC-地高辛分析的图；以及
图9示出了29天内的葡聚糖-dig(en)-FITC缀合物的室3结合的图。
本发明的分析标记基于无定形碳粒子。此类粒子在本领域中是熟知的，并且还被称为碳黑、灯黑、炉黑或热炭黑)。它们是由气态或液态烃类的不完全燃烧产生的无定形粒子。炭黑的CAS号为1333-86-4。
碳粒子的尺寸将取决于分析的性质，但它们的粒度通常为25-250nm。本发明的碳粒子的粒度表示粒子在其最宽点处的直径并且可由动态光散射测量。
无定形碳粒子通常具有多孔结构。优选地，本发明中使用的碳粒子的密度为0.8至3g/mL。
本发明的碳粒子在含水介质中的悬浮液上形成稳定胶体。根椐碳粒子的疏水性(一些比其他具有更多的表面羟基)，一些碳粒子将在水中形成稳定的胶体而其他碳粒子则需要稳定剂的存在。本发明优选地使用在不存在稳定剂的情况下(实际上，不存在任何其他物质)在水中形成稳定的胶体的碳粒子。可应用一种简单的测试来确定是否形成了稳定的胶体：将1％w/v无定形碳粒子悬浮在1mL去离子水中并超声处理30秒以形成胶体；使用可见光谱仪测量胶体的光密度；稳定胶体在1小时内将不会显示光密度变化(±1％)。
分析标记还包含附接到碳粒子的表面的官能化葡聚糖聚合物。
葡聚糖是葡萄糖聚合物，并且包括α-D-葡萄糖-连接的葡聚糖(通常95％)和作为支链的1,3-葡萄糖残基(通常5％)的重复单元。与大多数其他多糖不同，葡聚糖不被酶降解。
本发明中使用的聚合物为官能化葡聚糖，这意味着除了葡聚糖中存在的可用于形成共价键的那些基团，其包含另外的官能团。官能团的例子包括氨基、硫酸基团、酮、醛、羧酸、磺酸、活化的羧基/磺酸(诸如氯化酰基或活化的酯)和硫醇基团。可商购获得的官能化葡聚糖的一些具体例子为氨基葡聚糖、葡聚糖硫酸酯、二乙基氨基乙基葡聚糖和羧甲基葡聚糖。氨基葡聚糖的合成在US 5,776,706中更详细地描述。官能化葡聚糖优选地为氨基葡聚糖。
本发明的官能化葡聚糖聚合物的数均分子量通常为3-2,000KDa，优选地为5-100KDa并且最优选地为7-15KDa。该分子量可通过凝胶渗透色谱法，使用可商购获得的已知分子量的葡聚糖标准品(例如得自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))进行测量。
官能化葡聚糖通过非共价相互作用附接到碳粒子。优选地，官能化葡聚糖被动吸附到碳粒子的表面上。不希望受到理论的束缚，据信葡聚糖被吸附到存在于碳粒子的表面上的孔中，从而置换孔内的水分子。由于释放了结合的水分子，所以该反应的驱动力是可能的熵值。
分析标记还包括共价结合到官能化葡聚糖的互补结合对的第一构件。
为在分析中起作用，该标记必须包含互补结合对的一部分。如前面所解释的，在免疫性(也称为夹心或试剂-过量)免疫分析中，产生的分析物的一种抗体位于传感器上，而分析物的另一种抗体位于碳粒子上。然后，在存在待测分析物的情况下，碳粒子结合到传感器。对于其他大分子，诸如蛋白质或核酸，类似的分析是可能的。在这种情况下，互补结合对的第一构件是选自抗体、蛋白质或核酸的大分子，并且互补结合对的第二构件是分析物。
在竞争分析中，存在(a)抗体在碳粒子上而分析物的类似物(即小分子)在传感器上，或(b)类似物(即小分子)在碳粒子上而抗体在传感器上。结合在不存在分析物的情况下发生，并且在存在分析物的情况下受到干扰(减少)。在这种情况下，互补结合对的第一构件可为小分子而互补结合对的第二构件为产生的小分子的抗体。小分子的例子为治疗性药物(例如卡马西平、环孢霉素、地高辛、茶碱和庆大霉素)、滥用的药物(例如麻醉剂、可卡因和苯丙胺)、维生素(例如维生素D、维生素B12和叶酸)和激素(T3、T4、皮质醇、孕酮、雌二醇和睾酮)。
本发明的分析标记可通过预处理葡聚糖聚合物以形成葡聚糖-小分子缀合物来制备。然后，该缀合物可附接至碳粒子以形成稳定的缀合物。不止一个小分子可附接至葡聚糖，使得粒子可用于具有对照的分析或用于多重分析。
本发明的分析标记还可通过以下来制备：将葡聚糖聚合物附接至碳粒子，并且用试剂单独地预处理抗体、蛋白质或核酸，该试剂将共价结合到葡聚糖涂覆的粒子上的官能团。一个例子为使用氨基葡聚糖，其发生反应以将马来酰亚胺基团添加到葡聚糖的表面上。然后，马来酰亚胺葡聚糖涂覆到碳粒子上。抗体通过掩蔽的硫醇引入，该硫醇可去掩蔽以与葡聚糖上的马来酰亚胺基团反应。掩蔽的硫醇可通过与S-乙酰基巯基乙酸N-琥珀酰亚胺(SATA)反应被引入。在优选的实施例中，分析标记还包括官能化葡聚糖和互补结合配偶体之间的连接基。例如，马来酰亚胺基团可通过添加双异官能团试剂，诸如琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)引入到葡聚糖上，或通过SMCC的类似物引入，其中环己烷隔离物由另选的长度更长的隔离物诸如聚烷撑二醇隔离物置换。在SATA-活化的抗体偶联到马来酰亚胺葡聚糖碳后，引入淬灭步骤以使未反应的马来酰亚胺和硫醇基团失活是有利的，通常通过首先添加马来酰亚胺淬灭剂(例如巯基乙醇)，然后添加硫醇淬灭剂(例如N-乙基马来酰亚胺或聚亚烷基马来酰亚胺)。然后，可通过对碳胶体进行离心和洗涤来移除这些淬灭剂。
用于互补结合对的第一构件的尺寸的有用指导为：小分子优选地具有5,000或更小的分子量，并且大分子(例如抗体、蛋白质或核酸)具有高于5,0000的分子量，例如从5,001-1,000,000。
提供连接基的优点是，其通过防止与碳粒子进行空间交互作用以及使抗体、蛋白质或核酸完全溶剂化来允许大分子，例如抗体、蛋白质或核酸形成恰当的三级结构。已经发现，这通过减少分析中的非特异性结合提高了信噪比。优选的连接基为聚乙二醇，例如PEG12。
因此，本发明还提供制备分析标记的方法，包括以下步骤：
(i)提供无定形碳粒子、官能化葡聚糖聚合物和互补结合对的第一构件；
(ii)将官能化葡聚糖聚合物附接至无定形碳粒子；
(iii)使官能化葡聚糖聚合物与互补结合对的第一构件反应，以在官能化葡聚糖聚合物上的官能团和互补结合对的第一构件之间形成共价键，其中步骤(ii)和(iii)可以任一顺序执行，但均沿循步骤(i)。
优选地，该方法还包括使官能化葡聚糖聚合物在与互补结合对的第一构件反应之前与双官能分子反应，以在官能化葡聚糖和互补结合对的第一构件之间形成连接基。本文所述分析标记的其他优选的特征同等地应用于本方法。
本发明的分析标记普遍适用于分析领域。然而，该标记优选地用于参考WO 2004/090512描述的装置中。因此，本发明还提供了用于进行分析的装置，包括：
如本文所述的分析标记；
辐射源，其能够产生在一定波长下的电磁辐射的一系列脉冲，使得标记吸收所述辐射，从而通过非辐射衰减产生能量；
样品室，其包含具有热电元件或压电元件的换能器以及能够将非辐射衰减产生的能量转换为电信号的电极；以及检测器，其能够检测由换能器产生的电信号。
图1示出了根据本发明使用的装置1，其依赖在用电磁辐射照射粒子2(粒子在换能器表面上示出)时在粒子2(本文为分析标记的碳粒子)中的产生热。为简单起见，图1中仅示出了粒子(装置的剩余组件将在下文中进一步详细描述)。图1示出了粒子2存在时的装置1。装置1包括具有电极涂层4,5的热电或压电换能器3。换能器3优选地为极化聚偏二氟乙烯膜或VDF-三氟乙烯共聚物膜。电极涂层4,5优选地为透明的并且最优选地由氧化铟锡形成，但任何透明的或半透明的电极材料都满足要求，例如PEDOT(聚(3,4-亚乙二氧基噻吩))。电极优选地具有约35nm的厚度，但从1nm下限到100nm上限的几乎任何厚度都是可行的，低于1nm则电导率太低，而高于100nm则光透过率太低(不应低于80％T)。在特别优选的实施例中，换能器为氧化铟锡涂覆的聚偏二氟乙烯膜。可在换能器3上施加附加层，诸如聚对二甲苯聚合物层，以用于将试剂被动吸附至传感器。优选的实施例是聚对二甲苯层随后涂覆在聚合链霉亲和素层中。
粒子2示出邻近换能器3。本发明中使用的碳粒子的固有特征是，当粒子2受到电磁辐射源(通常称为“光”，优选可见光)6照射时产生热。光源可为例如LED。光源6用合适波长的光照射粒子2。虽然不希望受到理论束缚，据信粒子2吸收光以产生激发态，然后发生非辐射衰减从而产生能量，如图1中的曲线所示。该能量主要为热形式(即环境中的热运动)，但也可产生其他形式的能量(主要为冲击波)。然而，该能量由换能器检测并转换成电信号。该装置针对特定的待测粒子进行校准，因此不需要确定由非辐射衰减产生的能量的精确形式。除非另外指明，否则本文中使用的术语“热”为由非辐射衰减产生的能量。将光源6定位以照射粒子2。优选地，光源6与换能器3和电极4,5位置相对，并且通过换能器3和电极4,5照射粒子2。光源可为在换能器内的内部光源，其中该光源为导波系统。波导可为换能器本身或波导可为附着在换能器上的附加层。照射波长取决于所用粒子的精确性质。
粒子2产生的能量由换能器3检测并转换成电信号。电信号由检测器7检测。光源6和检测器7均由控制器8控制。光源6产生一系列光脉冲，其被称为“断续光”。原则上，光闪一下，即一个电磁辐射脉冲，就足以从换能器3产生信号。然而，为了获得可再现的信号，使用光的频闪，这在实施过程中需要断续光。所施加的电磁辐射脉冲的频率可变化。在下限处，脉冲之间的时间延迟对于各脉冲和待检测的电信号的产生之间的时间延迟必须是足够的。在上限处，各脉冲之间的时间延迟不能太大，使得用于记录数据的时间段变得被不合理地延长。优选地，脉冲的频率为1-50Hz，更优选地为1-10Hz并且最优选地为2Hz。这分别对应于20-1,000ms、100-1,000ms和500ms的脉冲之间的时间延迟。此外，所谓“脉冲间隔(mark-space)”比率，即开信号与关信号的比率优选地为1，但也可使用其他比率而无不利影响。为了在下一脉冲扰动系统前使系统达到热平衡，使用较短的开脉冲以及较长的关信号有一些好处。产生具有不同断续频率的断续光或不同脉冲间隔比率的电磁辐射源在本领域中是已知的。检测器7确定来自光源6的各光脉冲和由检测器7检测到的来自换能器3的相应电信号之间的时间延迟。时间延迟是距离d的函数。当粒子直接结合在表面上时，优选地测量2-7ms的信号。为了通过室的深度测量粒子，使用更长的时间延迟，例如10-50ms。系统还可被配置成测量信号中的最大峰值，其时间延迟可在整个测量过程中变化。
可使用提供可再现结果的确定各光脉冲和相应的电信号之间的时间延迟的任何方法。
应当指出的是，粒子2可与换能器表面分开并且仍能检测到信号。此外，不仅可检测通过中间介质的信号，而且可区分不同距离d(这已被称为“深度剖析”)并且接收到的信号的强度与距换能器3表面特定距离d的粒子2的浓度成比例。此外，据发现介质本身的性质影响时间延迟和给定时间延迟下的信号量级。
粒子的目的是吸收由辐射源产生的电磁辐射从而通过非辐射衰减产生能量。然后，通过换能器将辐射衰减转换为电信号。电磁辐射的波长为使得粒子吸收所述辐射，从而通过非辐射衰减产生能量。辐射的波长优选地为300-1,000nm。
红细胞存在于血液样品中，即(未分离的)全血。随时间推移这些细胞在诸如试管或容器的静态系统中趋于沉淀，因为其密度大于它们所分散的周围血浆。通常建立在WO 2004/090512中所述的系统，以通过使用使来自红细胞的信号最小化的光波长(大约690nm)，并且还通过在光脉冲之后几毫秒测量信号来使来自红细胞的信号最小化，从而将输出限定为靠近换能器产生的热。
样品将通常为大约几微升(例如1-100μL，优选的1-30μL)。为了保持流体样品，换能器优选地位于样品室中，样品室具有一个或多个侧壁、上表面和下表面。因此，换能器优选地位于样品室内以保持样品与换能器接触。优选地，换能器与样品室为一体的，即换能器形成限定样品室的侧壁、或上表面或下表面中的一者。在优选的实施例中，样品室具有上表面和下表面并且换能器形成上表面。样品可仅由表面张力来保持，例如在毛细管通道内。样品室的深度通常为50μm至1cm，优选地150-250μm。
本发明的装置可包括优选地流体连通的多个样品室。该装置优选地还包括细长的样品采集通道，该通道具有与装置外部接触的样品采集端和与一个或多个样品室流体连通的样品递送端，如图2中的芯21所示。参见WO 2011/027147获取更多细节。
在优选的实施例中，该装置还包括细长的样品采集通道，该通道具有开口端并且被布置用于通过毛细管作用将流体引入通道中，其中该通道具有采集端和递送端并且递送端与样品室流体连通。该通道可沿着其长度的第一部分设置涂覆有抗凝剂的区域。这种布置方式允许样品与抗凝剂接触从而防止在采集通道中凝血。
该装置可采用独立的读取器和盒的形式，或为一体式装置。在前一种情况中，该装置由读取器和盒形成，其中盒可释放地与读取器接合，并且其中读取器包括辐射源和检测器，并且盒包括换能器和样品室。读取器优选地为便携式读取器。盒优选地为一次性盒。
本发明现将结合下列实例进行描述，所述实例并非旨在限制。
实例
实例1
PVDF膜传感器
在氧化铟锡中涂布的极化压电/热电聚偏二氟乙烯(PVDF)双压电晶片膜在以下实例中用作感测装置。氧化锡铟表面通过气相气体沉积工艺涂覆有聚对二甲苯层(大约厚度1微米)。该方法涉及二聚对二甲苯前体的升华和后续的热解，然后在表面上进行自由基聚合反应。参见WO 2009/141637获取更多细节。然后，所得的膜通过在室温下温育过夜在聚链霉亲和素溶液(PBS中200μg/mL，其中PBS是包含2.7mmol/L KCl、137mmol/LNaCl和0.05％吐温的10mmol/L磷酸盐缓冲液)中涂布。聚链霉亲和素如Tischer等人(US 5,061,640)所述进行制备。聚链霉亲和素提供了通用结合传感器，其他分子可通过高亲和力生物素-链霉亲和素反应附接到该传感器。
实例2
盒的制备
如图2所示，制造盒14以进行测量。盒14由增强板16上支承的压电/热电膜15制成。将用于冲切形成3个样品室18的压敏粘结剂涂覆的聚酯膜17施加至表面。进行准备以允许电连接至压电/热电膜15的顶部表面和底部表面，从而检测产生的电荷。然后，通过将上述组件夹在顶盖19(标记20施加至其)和芯21、密封件22和底盖23之间而形成盒14。
通过将样品装入样品室进行测量。通过顶盖19中的孔用断续的LED光依次用LED照射压电/热电膜15。对每个LED脉冲而言，使用放大器和模拟数字(ADC)转化器测量压电/热电膜15两端的电压。随时间推移，绘制时间分辨的ADC信号。
实例3-13
在以下实例中，使用阳性和阴性对照进行分析以提高测量的准确性和精确性。两个对照中，一个限定在扩散控制下期望的最大结合率，另一个限定在不存在信号的情况下期望的最小信号(一般由于粒子沉淀而呈弱阴性)。信号输出由这两个对照按比例限定。
实例3
通过被动吸附制备碳抗-cTnl胶体(碳缀合物1)
在2mL 10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中制备400μg抗心肌肌钙蛋白I小鼠单克隆抗体克隆
560(芬兰Hytest公司(Hytest,Finland))。向其中加入1mL 0.2％w/v的SB4碳粒子(德固赛公司(Degussa))在水中的悬浮液。混合物在室温下搅拌2小时，然后通过添加6mL 10mM磷酸钾缓冲液来稀释，缓冲液包含4.5％蔗糖、0.15％BSA和0.075％PEG 20k(洗涤和储存缓冲液)。然后，在储存缓冲液中，通过三次离心、粒化、洗涤、超声处理和再悬浮循环纯化该溶液。最后，加入4.5μL Proclin 950防腐剂并在4℃下保存该溶液。
实例4
通过与葡聚糖试剂进行初级反应，然后共价结合抗-cTnl抗体来制备碳葡聚糖抗-cTnl胶体(碳缀合物2)
将10KDa氨基葡聚糖(英杰公司(Invitrogen))以5mg/mL溶解在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，并且将11.6mL该溶液与3300μL 30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺-PEG12-马来酰亚胺(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))溶液(在DMSO中)(相当于对氨基葡聚糖20:1摩尔过量)在20℃下温育60分钟。60分钟后，用甘氨酸(86.73mg)淬灭该反应，然后在Sephadex G50柱上纯化，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗脱。用苯酚硫酸分析法分析产品峰值以确定浓度为1.776mg/mL。在-80℃保存氨基葡聚糖马来酰亚胺直到需要时。
将100mg SB4碳粒子(德固赛公司(Degussa))水溶液(50mL)超声处理0.5小时。将所得悬浮液中的1.667mL碳胶体与氨基葡聚糖-马来酰亚胺溶液(2.252mL)和0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)(8.859mL)混合。将该混合物超声处理30秒，然后滚轴混合90分钟。然后，将该混合物离心并粒化15分钟，弃去上清液。通过超声处理将该混合物再次溶解于0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)(10mL)30秒，并使悬浮液再次减速旋转。总共进行3次洗涤循环。
平行地，使用单根PD-10 Sephadex G25M一次性柱使11.66mg抗肌钙蛋白抗体克隆560(Hytest公司)脱盐成磷酸盐缓冲液，然后用5当量的N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)(赛默飞世尔公司(Thermo-Fisher))(90μL在DMSO中的1mg/mL溶液)在20℃下活化1小时，然后使用羟胺缓冲液(315μL)脱保护15分钟。硫醇化的抗体在两根PD-10 Sephadex G25M一次性柱上纯化成0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，获得包含1.76mg/mL抗体的溶液。使用Ellman分析测量硫醇结合水平为每抗体1.9硫醇。
在氨基葡聚糖马来酰亚胺中涂布的碳的最后洗涤循环之后，弃去上清液并将硫醇化的抗体(10mg,5.682mL)以及4.318mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)一同加入。通过超声处理30秒将该混合物再次溶解，然后将反应滚轴混合1小时45分钟，然后用2-巯基乙醇(200μL，在水中为1mg/mL)淬灭15分钟，然后用PEG12-马来酰亚胺(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))(180μL,10mg/mL)再淬灭15分钟。然后该混合物如之前一样减速旋转，并且再经过三次洗涤循环，然后用60秒超声处理最终溶解于0.01M磷酸盐+0.1％BSA+3％蔗糖+0.05％PEG 20K pH 7.2缓冲液(375μL)中。
相似地，碳缀合物在与如上所述完全相同的情况下制备，不同的是未用SATA活化抗体。所有的制备步骤和洗涤步骤均用相似的方式进行。
实例5
两种不同的碳抗-cTnl胶体的结合能力的比较
实例3和4中的抗-cTnl碳缀合物被稀释于心肌肌钙蛋白I在磷酸盐缓冲盐水和0.5％牛血清白蛋白中的溶液。肌钙蛋白的最终浓度为50ng/mL，而碳固体的最终浓度在0.000039％w/v至0.0035％w/v的范围内。对照在未添加碳缀合物的情况下进行。每个反应的总体积为500μL。通过测量在450nm时溶液的光密度并与标准曲线(由SB4碳在水中的悬浮液制备)进行比较来检测碳固体浓度。在温育30分钟后，通过离心将碳固体从各反应混合物中移除。然后，将50μL各混合物稀释于450μL游离肌钙蛋白血清，并且在Abbott Architect临床免疫分析分析仪上测量每个样品中未结合的肌钙蛋白的浓度。通过减法计算各个碳固体浓度处的结合肌钙蛋白的数量，然后将这绘制成图，并且对于两个缀合物的每一个，结合50％的肌钙蛋白所需的总碳缀合物由该数据内推算出(在图3中示出)。
结合肌钙蛋白的浓度由平衡公式控制：
K a = [ Ab + Ag ] [ Ab ] [ Ag ]
其中，[Ab*Ag]为肌钙蛋白-抗体复合物的浓度，[Ag]为游离的肌钙蛋白的浓度，而[Ab]等于在具有可用结合位点的反应混合物中的抗体的浓度。在50％结合的情况下，游离的肌钙蛋白浓度等于复合的肌钙蛋白的浓度，所以用于平衡的公式(质量作用定律)简化为Ka＝1/[Ab]。因为相同的抗体用于每个缀合物，所以达到50％结合所需的碳固体的百分比为两种缀合物提供了活性抗体的相关数量的直接测量。可以观察到，相比于葡聚糖缀合物(0.00005％固体)，结合50％的肌钙蛋白需要约5倍多的被动吸附缀合物(0.00025％固体)，这意味着在葡聚糖缀合物上存在约5倍多的活性抗体。
实例6
使用被动涂覆有抗体的碳胶体的cTnl的免疫分析
使用实例3中制备的碳缀合物进行肌钙蛋白I的免疫分析。使用WO 2004/D9D512中描述的热电检测器系统利用对照进行该分析，如上文所述。概括地说，PVDF传感器的三个单独的区域在三种不同的抗体中涂布，第一种为非特异性阴性对照抗体，第二种为针对肌钙蛋白的单克隆抗体(Hytest克隆19C7)以及第三种为多克隆山羊抗小鼠抗体。抗体之前已经生物素化，并且将它们涂覆在普遍聚合的链霉亲和素表面上，该表面之前已经涂覆在PVDF传感器上。如图2所示，传感器封闭在由注塑成形部分和多个冲切压敏粘合剂制成的射流装置中，其产生三个单独的、互连的样品室以用于三个单独的测量。制备混合有碳缀合物1和缓冲液(35mM HEPES，42mM EGTA，280mM氯化钠，1.22％吐温)的人血浆，其具有不可检测的肌钙蛋白水平或掺杂人肌钙蛋白ITC复合物至约1ng/mL。碳缀合物按1:12稀释以得到约0.004％w/v的最终碳浓度。传感器表面的三个区域暴露于反应混合物并且使用高能LED(690nm)依次照射这三个区域。在10分钟的过程中，放大并且检测每个区域处产生的热电信号。然后，计算10分钟内每个样品室中信号的变化率，并且相对于其他两个区域，计算出在区域2处碳粒子对抗-肌钙蛋白抗体的结合率。因此，样品室3中的动力信号被限定为1.00，样品室1中的动力信号限定为0.00，而分析输出为位于其他两个样品室之间的样品室2中的动力信号。如果碳粒子上有足够的抗体，则所有粒子将结合到样品室3中的山羊抗小鼠表面，并且结合率将仅仅由扩散动力学控制。在每个浓度处重复十次，以产生该测量的平均信号和标准偏差。
数据在图4中示出，具有1标准偏差错误条。在存在1ng/mL肌钙蛋白I的情况下，信号为约0.11，即结合发生在最大扩散率的11％处。信号的量级和观测到的不精确度提供了约120pg/mL的分析灵敏度。
实例7
使用主动涂覆有抗体的碳胶体的cTnl的免疫分析
使用实例4中制备的碳缀合物进行肌钙蛋白的免疫分析。该实验和实例6中所描述的唯一不同在于碳缀合物不同，所有其他分析条件均相同。在该例中，观察到的信号(参见图4)几乎是4倍高，但是在零分析物水平下不精确度保持相对不变。信噪比的这种改善将分析灵敏度减少至35pg/mL。应当注意，在实例6和7中，样品室1和3中的信号类似，主要的变化在样品室2中。可以推断，缀合物2上活性抗体的较高水平导致更多的肌钙蛋白结合到粒子，因此在样品室2中粒子至传感器表面的结合率增加。还使用来自实例4的缀合物(其在未用SATA活化抗体的情况下制备)进行对照实验。这在样品室2或3中形成不可分辨的信号，这意味着抗体未结合到马来酰亚胺葡聚糖，除非抗体具有可用于形成共价键的游离的硫醇基团。
实例8
制备具有荧光素和地高辛的牛血清白蛋白的共缀合物
将牛血清白蛋白(BSA，西格玛公司(Sigma))以15mg/mL溶解于0.1M碳酸氢钠溶液中，然后将2.267mL(34mg BSA)该溶液与251μL 20mg/mL的地高辛N-羟基琥珀酰亚胺酯(瑞氏罗氏(Roche))溶液(在DMSO中)在20℃下温育60分钟。60分钟后，将518μL(7mg)该溶液移除并将61μL 15mg/mL的荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(Perbio公司)溶液(在DMSO中)添加至该等分试样。将该溶液在20℃下再温育60分钟。计算的地高辛:BSA和荧光素:BSA的摩尔比率分别为20:1和15:1。
将粗制BSA-地高辛-荧光素产物纯化为PBS缓冲液(pH7.1)，该缓冲液包含在单个PD-10Sephadex G25M柱(通用公司(GE))上的0.1％叠氮化钠，生成1.6mL包含大约4.30mg/mL BSA的溶液，其被过滤至0.2μm(Minisart过滤器，赛多利斯(Sartorius))。
实例9
制备具有荧光素和地高辛的氨基葡聚糖的共缀合物
将70KDa氨基葡聚糖(英杰公司(Invitrogen))以5.0mg/mL溶解于0.1M碳酸氢钠溶液中，然后将1.0mL(5mg氨基葡聚糖)该溶液同时与19μL 5.0mg/mL的地高辛N-羟基琥珀酰亚胺酯(瑞氏罗氏(Roche))溶液(在DMSO中)和14μL 5.0mg/mL的荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(Perbio公司)溶液(在DMSO中)在20℃下温育60分钟，两种试剂均对氨基葡聚糖2:1摩尔过量。
将粗制氨基葡聚糖-地高辛-荧光素产物纯化为PBS缓冲液(pH 7.1)，该缓冲液包含在单个PD-10 Sephadex G25M柱(通用公司(GE))上的0.1％叠氮化钠，生成2.7mL包含大约1.67mg/mL的氨基葡聚糖的溶液。加入Proclin 950(27μL)并将该溶液过滤至0.2μm(Minisart过滤器，赛多利斯(Sartorius))。
实例10
制备碳牛血清白蛋白地高辛/荧光素共缀合物
将来自实例8的牛血清白蛋白缀合物在10mM磷酸盐缓冲液中稀释至150μg/mL，然后向1mL该溶液中加入0.5mL 0.2％的SB4碳在去离子水中的溶液。2小时后，加入3mL来自实例3的洗涤/储存缓冲液，然后对该混合物进行离心、粒化、洗涤和重悬(在相同的缓冲液中)，最后在2.5mL储存缓冲液中重组并且保持在4℃下。
实例11
制备碳葡聚糖地高辛/荧光素共缀合物
将来自实例9的葡聚糖缀合物在10mM磷酸盐缓冲液中稀释至25μg/mL，然后向1mL该溶液中加入0.5mL 0.2％的SB4碳在去离子水中的溶液。2小时后，加入3mL来自实例3的洗涤/储存缓冲液，然后对该混合物进行离心、粒化、洗涤和重悬(在相同的缓冲液中)，最后在2.5mL储存缓冲液中重组并且保持在4℃下。
实例12
地高辛/荧光素BSA碳的分析性能和稳定性
使用实例10中制备的碳缀合物进行地高辛的竞争分析。使用WO 2004/090512中描述的热电检测器系统利用对照进行该分析，如上文所述。概括地说，PVDF传感器的三个单独的区域在三种不同的抗体中涂布，第一种为非特异性阴性对照抗体，第二种为针对地高辛的单克隆抗体(Jackson Immunoresearch克隆HY-A.1)以及第三种为单克隆抗-FITC抗体。抗体之前已经生物素化，并且将它们涂覆在普遍聚合的链霉亲和素表面上，该表面之前已经涂覆在PVDF传感器上。如图2所示，传感器封闭在由注塑成形部分和多个冲切压敏粘合剂制成的射流装置中，其产生三个单独的、互连的样品室以用于三个单独的测量。制备混合有碳缀合物8和缓冲液(66mM Tris，14mM MgCl2和0.05％吐温20)的人血浆，其具有不可检测的地高辛水平，或掺杂纯化的地高辛至约5ng/mL。在样品中将碳缀合物按1:14稀释以得到约0.0035％w/v的最终碳浓度。传感器表面的三个区域暴露于反应混合物并且使用高能LED(690nm)依次照射这三个区域。在10分钟的过程中，放大并且检测每个区域处产生的热电信号。然后，计算10分钟内每个样品室中信号的变化率，并且相对于其他两个样品室，计算出在样品室2处碳粒子对抗地高辛-抗体的结合率。在每个浓度处重复十次，以产生该测量的平均信号和标准偏差。在该实例中，在不存在地高辛的情况下，在样品室2中期待高信号，因为表面上的抗体可识别碳粒子表面上的地高辛。如果地高辛存在于样品中，则通过阻塞传感器表面上的抗体结合位点来干扰样品室2中的结合。在数天内重复该分析，每次样品均为新制备的，使用在4℃下以液态形式储存的碳缀合物8。
数据在图5中示出，具有1标准偏差错误条。在第零天该分析按照期望地执行，在不存在地高辛的情况下产生高信号，而在存在地高辛的情况下产生低信号。然而，可以看到，分析性能随时间推移而变化，在地高辛不存在的情况下，在储存碳缀合物时信号减小。这些分析的样品室1中的信号(最少结合对照)随时间推移保持大致不变，而样品室2(抗-地高辛)和3(抗-FITC)中的信号在改变，两室中的信号均随时间推移减弱。图6示出了随时间推移样品室3中的结合率。样品室3中的信号与地高辛浓度无关，因为是结合到碳粒子上的荧光素基团。信号减弱意味着BSA-地高辛-FITC缀合物在储存时随时间推移从碳粒子的表面解除吸收。溶液中任何未结合的BSA-地高辛-FITC将会竞争表面上的结合位点并降低结合率。这已通过对碳缀合物进行离心、粒化、洗涤和重悬得到证实。这致使样品室3中的结合增加，如图7所示。
实例13
地高辛/荧光素葡聚糖碳的分析性能和稳定性
使用实例11中制备的碳缀合物进行地高辛的竞争分析。除了碳缀合物，反应条件与在实例12中所用的相同。比例式分析计数在图8中示出。可以观察到，最终分析信号(比例式输出)表明29天内保存于4℃下的碳没有变化。样品室3的值在图9中示出，证实了在这段时间里缀合物无变质。

Claims (15)

1.一种分析标记，包括无定形碳粒子、被动吸附到所述碳粒子的表面上的官能化葡聚糖聚合物和共价结合到所述官能化葡聚糖聚合物的互补结合对的第一构件。
2.根据权利要求1所述的分析标记，其中所述碳粒子具有25-250nm的粒度。
3.根据权利要求1或2所述的分析标记，其中所述官能化葡聚糖聚合物具有3-2,000KDa的数均分子量。
4.根据权利要求1或2所述的分析标记，其中所述官能化葡聚糖聚合物包含至少一个选自硫酸基团、酮、醛、羧酸、磺酸、活化的羧酸/磺酸和硫醇基团的官能团。
5.根据权利要求4所述的分析标记，其中所述官能化葡聚糖聚合物为氨基葡聚糖。
6.根据权利要求1或2所述的分析标记，其中所述互补结合对的所述第一构件为小分子。
7.根据权利要求1或2所述的分析标记，其中所述互补结合对的所述第一构件选自蛋白质和核酸。
8.根据权利要求1或2所述的分析标记，其中所述互补结合对的所述第一构件是抗体。
9.根据权利要求7所述的分析标记，其中所述分析标记还包括所述官能化葡聚糖聚合物和所述互补结合对的所述第一构件之间的连接基。
10.根据权利要求8所述的分析标记，其中所述分析标记还包括所述官能化葡聚糖聚合物和所述互补结合对的所述第一构件之间的连接基。
11.一种用于制备分析标记的方法，包括以下步骤：
(i)提供无定形碳粒子、官能化葡聚糖聚合物和互补结合对的第一构件；
(ii)将所述官能化葡聚糖聚合物被动吸附至所述无定形碳粒子的表面上；
(iii)使所述官能化葡聚糖聚合物与所述互补结合对的所述第一构件反应，以在所述官能化葡聚糖聚合物上的官能团和所述互补结合对的所述第一构件之间形成共价键，其中步骤(ii)和(iii)可以任一顺序执行，但均沿循步骤(i)。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括使所述官能化葡聚糖聚合物在与所述互补结合对的所述第一构件反应之前与双官能分子反应，以在所述官能化葡聚糖聚合物和所述互补结合对的所述第一构件之间形成连接基。
13.一种用于进行分析的装置，包括：
根据权利要求1至10中任一项所述的分析标记；
辐射源，其能够产生在一定波长下的电磁辐射的一系列脉冲，使得所述标记吸收所述辐射，从而通过非辐射衰减产生能量；
样品室，其包含具有热电元件或压电元件的换能器以及能够将非辐射衰减产生的能量转换为电信号的电极；以及
检测器，其能够检测由所述换能器产生的所述电信号。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述样品室具有上表面和下表面并且所述换能器形成所述上表面。
15.根据权利要求13或14所述的装置，其中所述装置由读取器和盒形成，其中所述盒可释放地与所述读取器接合，并且其中所述读取器包括所述辐射源和所述检测器，并且所述盒包括所述标记、所述换能器和所述样品室。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201000643D0 (en) * 2010-01-15 2010-03-03 Vivacta Ltd A method for sensing a chemical
WO2021193108A1 (ja) * 2020-03-26 2021-09-30 日本軽金属株式会社 バイオビーズ用粒子及びその製造方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3442819A (en) * 1965-03-26 1969-05-06 Mount Sinai Hospital Research Molecular sieve coated particulate adsorbent and processes using same
US4028465A (en) * 1975-11-10 1977-06-07 Bio-Rad Laboratories Assay method for serum folate
US4760030A (en) * 1984-09-10 1988-07-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Quantitative opaque particle agglutination assay
WO2004090512A1 (en) * 2003-04-10 2004-10-21 Piezoptic Limited Optical chemical sensing device with pyroelectric or piezoelectric transducer
CN1972961A (zh) * 2004-06-07 2007-05-30 厄普弗朗特色谱公司 血浆或者血清蛋白的分离
WO2011149233A2 (ko) * 2010-05-24 2011-12-01 한국과학기술원 자성 나노입자-플래티늄 나노입자-다공성 탄소 복합체 및 그 제조방법

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5252496A (en) * 1989-12-18 1993-10-12 Princeton Biomeditech Corporation Carbon black immunochemical label
US5248772A (en) * 1992-01-29 1993-09-28 Coulter Corporation Formation of colloidal metal dispersions using aminodextrans as reductants and protective agents
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
DE10027776A1 (de) * 2000-06-07 2002-02-14 Roche Diagnostics Gmbh Neuartige core-shell Partikel
EP1319181A2 (en) * 2000-09-05 2003-06-18 Illumina, Inc. Cellular arrays comprising encoded cells
AU2003903504A0 (en) * 2003-07-08 2003-07-24 Johnson, Daniel Improvements in sensor chips
WO2009009630A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Clemson University Photoluminescent materials for multiphoton imaging
US20120238725A1 (en) * 2009-09-04 2012-09-20 Northwestern University Primary carbon nanoparticles
GB201000643D0 (en) * 2010-01-15 2010-03-03 Vivacta Ltd A method for sensing a chemical
US8491908B2 (en) * 2010-06-01 2013-07-23 Canon Kabushiki Kaisha Composite particle, contrast agent for photoacoustic imaging, and method for producing the composite particle

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3442819A (en) * 1965-03-26 1969-05-06 Mount Sinai Hospital Research Molecular sieve coated particulate adsorbent and processes using same
US4028465A (en) * 1975-11-10 1977-06-07 Bio-Rad Laboratories Assay method for serum folate
US4760030A (en) * 1984-09-10 1988-07-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Quantitative opaque particle agglutination assay
WO2004090512A1 (en) * 2003-04-10 2004-10-21 Piezoptic Limited Optical chemical sensing device with pyroelectric or piezoelectric transducer
CN1972961A (zh) * 2004-06-07 2007-05-30 厄普弗朗特色谱公司 血浆或者血清蛋白的分离
WO2011149233A2 (ko) * 2010-05-24 2011-12-01 한국과학기술원 자성 나노입자-플래티늄 나노입자-다공성 탄소 복합체 및 그 제조방법

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