CN104583759B - 生理条件下的新动态光谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动态光谱学领域，更精确地说，涉及一种包括设计为确定生理以及病理条件下分子构象和组装体的过渡性变化的动态分子光谱技术。所述方法包括在严格控制的温度下取得样品体外指纹图谱，以获得一个或全部分子动态的精准图像。由于其精确信息，本发明方法允许缩短药物发现阶段。
Description
本发明涉及动态光谱学领域，更精确地说，涉及一种包括设计为确定生理以及病理条件下分子构象和组装体(assembly)的过渡性变化(transitional change)的动态分子光谱技术。所述方法包括在严格控制的温度下取得样品体外指纹图谱，以获得一个或全部分子动态的精准图像。由于其精确信息，本发明方法允许缩短药物发现阶段。
在过去的二十年间，确定分子间相互作用尤其是蛋白质-蛋白质相互作用一直是制药公司面临的重要挑战之一。事实上，药物研发正处在较少创新从而使生产力低下的阶段。药物发现项目的成功依靠从基础研究、靶标验证等获得的知识的丰富度和准确度。基础研究取决于用于解决生物问题的方法、工具和技术的针对性以及局限性。药物发现和研发停滞不前的这一事实表明现有的方法和技术无法满足治疗需要。而且，现有药物研发方案耗时太长，成本太高。
有几个原因可以解释制药公司为何对蛋白质-蛋白质相互作用研究感兴趣，并且，一些主要的公司允许对涉及生物体特定功能活性的蛋白质进行鉴定，确定对应靶标并由此确定对应受体，然后鉴定并验证所述治疗靶标和药效结构(pharmacophore)，以及最后设计并研发能够结合鉴定的受体、优化先导化合物并最终构建候选药物的分子。这是传统的药物发现和研发方案。事实上，建立药物研发策略需要的所有信息均来自间接探索方法，其中天然靶标用复制本或部分相同的结构代替。所有这些方法均基于基因修饰或化学修饰的修饰靶标，即纯蛋白、蛋白嵌合体、突变蛋白、缀合物、敲除蛋白(knock out)等。这些方法和尖端技术均未全面考虑到生物体。相反，它们的重点在于特异性信号级联中的特定靶标，这对于体外和体内研究都是有效的。
不幸的是，付出如此巨大精力进行研发获得的成果仍然非常小，并且，在某些情况下由于诸如靶标验证、先导优化等多种问题失败了。许多失败都是由于使用了不适合该情况的技术或使用了太简单的生理的但验证的研究模型。而且，许多级联对齐的步骤，无论是否适合，仅以前一个步骤的效率为基础。结果，不确定性或近似性导致了失败。
此外，制药行业正面临新的需求，因为传统的药物研发仍然效率低下并且对于新疗法的开发不利。医生似乎更注重预防和治疗医学，而不是对症治疗。需要研究并理解给定疾病的病理生理学的方法和技术。也需要给出关于分子间相互作用的性质的准确信息，允许对不同的分子作用子(actor)进行鉴定，允许对靶标受体进行鉴定并且允许选择具有有益治疗效果的特异性配体的方法。理想地，所述方法是互补的，并且彼此依赖以克服现有技术的缺陷。
作为现有技术的一个实例，我们可以提及如Wubiao D.等人(Organic&Biomolecular Chemistry,2005,vol.3,n°13)或Tung CH.等人(Chembiochem,2003,4(9):897-9)中所描述的使用近红外发光标签如荧光素的光谱学方法。这类技术包括至少一个对感兴趣的分子进行标记的步骤，并且该步骤导致废除(abolition)含有感兴趣的分子的样品的生理条件。作为现有技术的另一实例，我们可以提及描述使用近红外光谱检测生理上可接受的聚合物分子的方法的专利申请EP23566467。所述方法以使用近红外光谱对结合在感兴趣的蛋白质上的聚合物的量进行的检测为基础，并且，对每个蛋白质分子的聚合物部分的量的测量允许生产具有相同量的聚合物部分的分子，这有助于药物组合物的生产。当与先前计算的具有与感兴趣的蛋白质缀合的已知量的聚合物分子的标准比较时，得到结果。所述方法包括纯化和浓缩感兴趣的蛋白质，所以废除了生理条件，并且另一缺陷在于需要参考或标准来对研究做出结论。此外，该方法是以荧光素的NIR光谱为基础，而不是感兴趣的蛋白质的周围环境。
专利申请WO2008/115120描述了一种检测含水样品中物质的结合和反应的方法，其中，所述结合或反应改变了水的光谱性质，并且所述结合或反应是通过观察或测量水光谱性质的任何变化而测得。该文献仅涉及一种概念，因为未对方法进行完整地描述也没有通过数据进行说明。而且，WO2008/115120的方法不依赖于用于测量光谱性质变化的任何特定检测装置，并且同样使用红外、拉曼、太赫兹、和频(sum frequency generation)或光声光谱、或振动圆二色谱。
急需一种更高效的基本的转化开发策略以克服上述缺陷。理想地，该新方法应该是以一步探索技术为基础，其中其结果反映了一个分子或全部分子对特定刺激或多种刺激的活动行为。其在正常和病理条件下也应该是与从人体获得的信号一样精确的体外信号。最后，所述方法应该考虑到整个信号级联内给定刺激之后生物体中产生的所有变化，而不是仅考虑选择的反应，如隔离信号。
本发明涉及一种含有感兴趣的生物分子的样品的构象分析方法，其中，所述分析是通过对包围感兴趣的分子的水分子的近红外波长进行光谱分析来实现的。光谱分析得到通过图形或三维图像以及数据采集和处理物化的感兴趣的分子的指纹图谱或空间指纹图谱。本发明还涉及一种提供分子体外指纹图谱的方法，所述指纹图谱表示生理和病理条件下体内分子的相互作用。本发明的方法可在存在或不存在维生素、微量元素、cAMP、ADP、ATP、cGMP、GDP、GTP、NADH、NADPH、FAD、FADH2、或在给定细胞、组织、器官或有机体中参与天然分子相互作用以满足生理需要或以参与疾病的病理生理机制的任何其它分子时，应用于分子、大分子、蛋白质、蛋白质复合物、糖蛋白、脂蛋白、至少一种或多种或两个或更多核酸、DNA、所有已知形式的RNA、蛋白质、糖蛋白和脂蛋白的一种或多种多组装体。
事实上，分子相互作用遵从热力学定律。这意味着，分子内的、或与其所在环境有关的或与相同环境内的另一分子的所有相互作用均力图达到最低能量状态。也就是说，从最高亚稳能量状态进入最低亚稳能量状态最后达到稳定状态。后者称为分子自组装理论。活细胞内的分子相互作用，虽然受该相同热力学理论限制，但是不遵从自组装理论。这都是由于ATP。热力学分子相互作用以及ATP都是确保细胞活性并因此保持其生理机能的主要作用子。分子相互作用的级联是多样的并且短暂的。信号级联内的所有作用子固有地且与周围分子有关地不断改变其构象。这解释了它们作为信号级联作用的转化演变。在极短时间内，给定蛋白质起到受体的作用，且在另一短时间内，其变成结构伙伴(structurepartner)或代替效应子的作用。当设计新研究方法和开发适合技术时，必须考虑这些快速转化。
现有技术中，通过光谱法在波长范围为260nm和280nm之间时进行三维分子分析。所得图像取决于芳香族氨基酸上的光吸收。当波长更大时，没有更多吸收，因此没有更多信息。在红外范围内，所得图像取决于碳原子吸收。所有已知方法如结晶学和核磁共振需要纯样品或特定条件如在有机溶剂中稀释。所有已知方法均得到三维图像及由此的分析，但它们没有一个可在生理条件中进行。
如上述详细说明，现有技术中未已知下面的使用光谱技术在近红外范围内测定的生理条件下的生物分子构象。在近红外范围内进行的优点是其允许测量水分子的光强透射率light intensity transmission)。并且由于对这些数据的分析，数据处理之后，获得示出由所述水分子包围的分子的空间指纹图谱的图形和三维图像。本发明基于对不同情况中水分子和其各种伙伴之间的构象平衡情况的观察。本发明给出水分子的动态指纹图谱或空间指纹图谱，并因此允许说明被观察的水分子包围的分子之间的相互作用。
对生理条件中所有分子相互作用必需的最重要的分子是水。其作为介质存在于大分子周围以及作为伙伴存在于蛋白质内，这使得分子相互作用不仅是可能的而且是动态的。这意味着如果其不存在，所有相互作用会停止。如果水分子失去其谐振和内在作用，也会发生停止。当水冻住时，会发生停止。在这种情况下，水结晶是获得大分子指纹图谱的理想介质。这些可在恒温下进行，从而获得稳定的指纹图谱或在不同温度下进行，从而获得动态指纹图谱。
本发明的体外指纹图谱是基于从亚稳态到稳态再到亚稳态构象的水分子动态构象，在严格控制的温度即逐步从-37℃升至37℃再回到-37℃时于恒定谐振中获得的。在存在生理介质即与具有可比较阴离子、阳离子、微量元素、维生素、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂质、糖、核酸，简言之具有整个细胞质的活细胞内的一样时，于其生理构象中获得指纹图谱。
本发明提供在生理条件下使用光谱获得样品中至少一种感兴趣的生物分子的指纹图谱的方法，其包括：
a)将样品暴露于近红外光谱中的光源下；
b)测量包围感兴趣的生物分子的水分子的光强透射率；
c)测定所述感兴趣的生物分子的指纹图谱。
在第一实施方案中，在近红外波长范围内于不断增大的波长下使用本发明的方法。在第二实施方案中，在近红外波长范围内选择的给定波长下进行本发明的方法。
本发明以前述原理为基础，涉及提供体外动态分子指纹图谱的方法，其中所述方法包括以下步骤：
—制备具有感兴趣的分子的样品；
—在近红外波长下使用传统光谱学技术研究所述感兴趣的分子的动态变化；
—基于光源和检测器的恒定谐振，将所述样品暴露于光散射和严格控制的温度即从生理温度37℃到负温再回到初始温度下；
—数据采集和处理以及还有图形分析之后，构建三维图像；
其中所述光源、温度调节器、样品支架、光学系统和检测器均置于真空室的相对真空中。
包围感兴趣的分子的水分子的光强透射率可受水分子和其组织的光吸收或光衍射的影响。当实验参数如温度变化时，水分子网络也将变化，并且水分子与感兴趣的分子之间的结合也将变化。
以下定义的术语可以是单数的或复数的，并且当在本文中使用时，具有与以下详细说明的相同的含义。
本文中使用的术语“样品”指的是含有至少一种感兴趣的分子的任何样品。该样品可以在溶液中或不在溶液中。不受任何限制地，这种样品可以是植物组织、动物组织或人类组织、植物器官、动物器官、人类器官、微生物、细胞培养物、细胞群落、细胞悬浮液、细胞提取物、癌细胞、一种核酸或多种核酸、或其任何部分或提取物、或其任何制剂。
本文中使用的术语“感兴趣的分子”指的是存在或不存在维生素、微量元素、cAMP、ADP、ATP、cGMP、GDP、GTP、NADH、NADPH、FAD、FADH2、或在给定细胞、组织、器官或有机体中参与天然分子相互作用以满足生理需要或以一种方式或其它方式参与疾病的病理生理机制的任何其它分子时的分子、大分子、蛋白质、蛋白质复合物、糖蛋白、脂蛋白，至少一种核酸、DNA、所有已知形式的RNA的一种或多种组装体。
本文中使用的术语“指纹图谱(fingerprint)”或“空间指纹图谱(spatialprint)”或“指纹图谱(print)”指的是感兴趣的分子的空间指纹图谱的可视化表示，如图形或三维图像。更准确而言，空间指纹图谱指的是在近红外范围内于各种波长下的一组数据和/或吸光率测量值。这种感兴趣的分子与测试化合物或测试组织等结合或没有结合、组装或没有组装、相互作用或没有相互作用。
本文中使用的术语“包围(surrounding)”指的是与感兴趣的分子相邻的事实，无论是否与所述感兴趣的分子接触或是否与所述感兴趣的分子相互作用或是否所述感兴趣的分子结合。本发明的样品中的这种分子通常是水分子。
本文中使用的术语“光谱(spectroscopy)”指的是根据波长对包围感兴趣的分子的水分子的光强透射率的测量。更具体而言，近红外光谱(NIR或NIRS)是对样品近红外光波长和吸收强度的测量。近红外光跨越范围为800nm-2.5μm(12500-4000cm-1)，并且能量足以激发分子振动的倍频(overtones)和合频(combinations)至更高的能量级。本发明的方法利用了包围感兴趣的分子的水分子的差异吸收和/或衍射性质。
本文中使用的术语“动态光谱(dynamic spectroscopy)”或“动态指纹图谱(dynamic fingerprint)”指的是光谱结果如上述指纹图谱、三维图像或图形之间的比较结果，以评估在不同温度条件下感兴趣的分子的构象演变。根据本发明，动态光谱允许研究分子动力学、大分子动力学、分子络合物、大分子络合物、蛋白构象、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质复合物、同源二聚作用、异源二聚作用、同源寡聚作用、异源寡聚作用、配体蛋白质相互作用和配体相互作用组(interactome)相互作用，其中所述配体是天然配体、生物配体或其外源性物质，而所述外源性物质在来自活细胞、器官和有机体的任何提取物上，是天然的或合成的，而所述有机体是真核细胞、原核细胞或植物。
本文中使用的术语“测试分子”指的是分离分子。其可以是具有任何大小和性质的天然分子或合成分子。所述测试分子可以是纯的或不纯的。
术语“使……接触(putting in contact)”指的是有或没有相互作用的空间接触，还指有关组分的混合物。
在一个优选实施方案中，本发明的方法提供于接近37℃的生理温度到非常低的温度如-37℃再回到37℃的生理温度下获得的动态分子指纹图谱。这意味着按这样从给定活细胞或器官分离的全部大分子相互作用急剧冻至-37℃，并在其时逐步融解至37℃。
本发明描述了提供体外动态分子指纹图谱的方法，其中所述方法包括以下步骤：
—制备具有感兴趣的分子的样品；
—在近红外波长下使用传统光谱学技术研究所述感兴趣的分子的动态变化；
—基于光源和检测器的恒定谐振，将所述样品暴露于光散射和严格控制的温度即从37℃到-37℃再回到37℃下；
—数据采集和处理以及还有图形分析之后，构建三维图像；
其中所述光源、温度调节器、样品支架、光学系统和检测器均置于真空室的相对真空中。
本发明的方法在对应于波长范围为680nm至2500nm，优选900nm至1410nm，更优选680至1100nm的近红外光谱中使用。
在一特定实施方案中，本发明的方法提供在近红外波长即900-1410nm下或在同样波长范围内的固定波长下使用光谱技术，于从37℃至-37℃再回到37℃时的每一度连续读数获得的动态分子指纹图谱。本发明涉及获得上面详述的感兴趣的分子的指纹图谱的方法，其中波长范围为680-2500nm，优选900-1410nm之间。在另一实施方案中，本发明的方法在选自近红外范围内的一固定波长即包含在900-2500nm，更优选地在900-1410nm内的一波长下进行。
在另一实施方案中，当样品置于激光或可见光源和检测器之间时获得本发明的动态分子指纹图谱，同时所述光源和检测器在具有可调谐振速度的恒定水平谐振中。因此，本发明涉及获得如上详述的指纹图谱的方法，其中所述光源是可见光、卤素或激光。
根据本发明，通过于37℃到-37℃再回到37℃下，基于光源和检测器的谐振在样品上进行光散射获得动态分子指纹图谱，对其处理以构建显示嵌在生理存在的水分子中的大分子的细微构象演变的三维图像。在第一实施方案中，本发明涉及获得感兴趣的生物分子的指纹图谱的方法，其中所述指纹图谱由三维图像组成。在第二实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述指纹图谱由图形表示组成。
在一特定实施方案中，本发明的方法包括在不同温度下获得相同样品的多个指纹图谱，对其编译以推断(deduct)所述感兴趣的分子的动态构象行为。另一特定实施方案中，在正温和负温(摄氏度)的各个温度下获得感兴趣的分子的指纹图谱。在又一实施方案中，在-37℃和37℃之间的温度范围，优选由37℃到-37℃再回到37℃的温度范围内测量相同样品的不同指纹图谱。在一优选实施方案中，选择温度范围内每一整数摄氏度下得到一个本发明的指纹图谱。
本发明的方法允许在存在或不存在维生素、微量元素、cAMP、ADP、ATP、cGMP、GDP、GTP、NADH、NADPH、FAD、FADH2、或在给定细胞、组织、器官或有机体中参与天然分子相互作用以满足生理需要或以一种方式或其它方式参与疾病的病理生理机制的任何其它分子时，分析各种感兴趣的分子，包括大分子、蛋白质、蛋白质复合物、糖蛋白、脂蛋白；至少一种或多种或两个或更多核酸、DNA、所有已知形式的RNA、蛋白质、糖蛋白和脂蛋白的一种或多种组装体。因此，本发明涉及在存在或不存在维生素、微量元素、cAMP、ADP、ATP、cGMP、GDP、GTP、NADH、NADPH、FAD、FADH2、或在给定细胞、组织、器官或有机体中参与天然分子相互作用以满足生理需要或以一种方式或另一种方式参与疾病的病理生理机制的任何其它分子时，提供上述体外动态分子指纹图谱的构象分析方法，其中所述感兴趣的分子是大分子、蛋白质、蛋白质复合物、糖蛋白、脂蛋白，至少一种核酸、DNA、所有已知形式的RNA的一种或多种组装体。
本发明的方法允许研究分子动力学、大分子动力学、分子络合物、大分子络合物、蛋白构象、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质复合物、同源二聚作用、异源二聚作用、同源寡聚作用、异源寡聚作用、配体蛋白质相互作用和配体相互作用组相互作用，而所述配体可以是天然配体、生物配体或其外源性物质，而所述外源性物质在来自活细胞、器官和有机体的任何提取物上，是天然的或合成的，而所述有机体是真核细胞、原核细胞或植物。本发明涉及使用上述方法研究来自活细胞、器官和有机体的任何提取物上的分子动力学、大分子动力学、分子络合物、大分子络合物、蛋白构象、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质复合物、同源二聚作用、异源二聚作用、同源寡聚作用、异源寡聚作用、配体蛋白质相互作用和配体相互作用组相互作用，而所述有机体是真核细胞、原核细胞或植物。
本发明描述了一种患者对给定药物治疗的敏感性的体外鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
a)将怀疑患有或易患上给定疾病的患者的样品分为两个子样品A和B；
b)按照本发明的方法测定子样品A的指纹图谱；
c)使子样子B与给定药物接触；
d)按照本发明的方法测定步骤c)获得的子样品的指纹图谱；
e)如果d)中获得的所述指纹图谱示出相对于b)中测定的对照水平单个大分子体积的变化，则确定所述患者对给定药物敏感。
本发明还涉及鉴定与选择的疾病和/或病症disorder)有关的生物标记物的方法。事实上，患者之间的某些疾病和/或病症的病理生理机制不同。当将证明对一种疾病和/或病症具有临床效果的已知药物用于治疗和/或预防有需要的患者时，不是所有的患者均以相同的方式对所述治疗应答，一些患者甚至没有应答。本发明的一个目的是实现对有应答患者的快速鉴别，然后根据所述疾病和/或病症的进展用后面的一种或几种生物标记物实现对每例患者治疗的调节。
本发明描述了显示患者对给定药物治疗的敏感性的至少一种生物标记物的选择方法，包括：
a)按照上述方法确定对给定药物敏感的一组患者；
b)按照与a)中相同的方法确定对给定药物不敏感的一组患者；
c)测量组a)患者中的各种生物标记物；
d)测量组b)患者中的各种生物标记物；
e)选择在c)下的测量值相比于d)下的测量值增加或减小的至少一种生物标记物作为显示患者对所述给定药物治疗的敏感性的生物标记物。
在另一实施方案中，本发明提供提高患有给定疾病的患者的治疗效果的方法，所述方法包括：
a)按照关于患者敏感性或生物标记物鉴定的上述方法中的任一种确定患者对给定药物的敏感性；以及
b)向所述患者施用所述给定药物。
通过对本发明范围没有限制性的以下附图举例说明本发明。
图1是设置用于在生理条件下进行动态蛋白光谱法的仪器的示意图。光源、温度调节器、光学系统和检测器均置于真空室的相对真空中。数据采集器和处理器在所述真空室外，且结果是图形分析和三维图像。
图2-10示出生理条件中大鼠下丘脑提取物的结果。
图2示出37℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中蛋白质构象的动态变化。
图3示出-37℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中蛋白质构象的动态变化。
图4示出-25℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中的蛋白质组装体。
图5示出-15℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中的蛋白质组装体。
图6示出-5℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中的蛋白质组装体。
图7示出5℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中的蛋白质组装体。
图8示出-15℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中的蛋白质组装体。
图9示出37℃时各种近红外波长(1200-1450nm)下三种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物中的蛋白质组装体。
图10示出37℃到-37℃再回到37℃的温度变化时蛋白质组装体的光谱演变。
图11示出存在干扰蛋白质组装体的硫双二氯酚时大鼠下丘脑提取物上的结果。
图12-16示出阿托品(atropine)与人类小脑、枕叶和海马体的总蛋白质提取物的相互作用。
图12示出37℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。
图13示出-37℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。
图14示出-7℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。
图15示出7℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。
图16示出37℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。
图17示出将本发明的方法应用于对给定药物敏感的患有IBD的患者的结果。
图18示出将图17中相同的方法应用于对给定药物不敏感的患有IBD的患者的结果。
本发明还提供在生理条件下使用光谱法测定样品中至少一种生物分子的构象的方法，包括：
a)按照上述方法测定感兴趣的生物分子的指纹图谱，以及
b)由步骤a)的结果确定所述感兴趣的分子的构象。
在一特定实施方案中，测定生物分子构象的所述方法包括获得各个温度下相同样品的不同指纹图谱，对所述指纹图谱进行编译以推断所述感兴趣的生物分子的动态构象行为。
在又一实施方案中，本发明提供测定至少一种感兴趣的分子的生物活性的方法，包括：
a)使样品与测试分子接触；
b)按照上述方法测定含有a)中定义的测试分子的样品的指纹图谱；
c)用至少两个不同样品重复步骤a)和b)；
d)比较b)和c)中获得的指纹图谱；以及
e)推断所述感兴趣的分子的生物活性。
在另一实施方案中，测定上述生物活性的方法包括其它步骤，包括：
a)按照上述方法测定溶液中测试分子的指纹图谱；
b)使样品与测试分子接触；
c)按照上述方法测定含有a)中定义的和a)中使用的测试分子的样品的指纹图谱；
d)用至少两个不同样品重复步骤b)和c)；
e)比较a)、b)和c)中获得的指纹图谱；以及
f)推断所述感兴趣的分子的生物活性。
在一优选实施方案中，所述样品是组织或器官提取物。所述样品无需任何纯化、浓缩或标记步骤，即可直接使用。
这种方法允许在生理条件下对测试分子和组织和/或器官的相互作用的观察。在又一实施方案中，该方法应用于各种组织或器官提取物，例如脑如小脑、海马体、枕叶、顶叶皮层的提取物，以获得每种脑提取物中测试分子的指纹图谱。在一优选实施方案中，获得各个温度下的所述指纹图谱，优选地，该温度选自正温和负温(摄氏度)。这实现了脑提取物或特定脑提取物的测试分子和组分之间组装体的可视化。其还允许观察是否不存在这种组装体。这提供了关于相对于每种测试的脑提取物的测试分子的潜在生物效果的信息。
在另一实施方案中，本发明提供根据上述实施方案测定至少一种感兴趣的分子的生物活性的方法，包括以下步骤：
a)使样品与测试分子接触；
b)按照上述方法测定含有a)中定义的测试分子的样品的构象；
c)用至少两个不同样品重复步骤a)和b)；
d)比较b)和c)中获得的构象；以及
e)推断所述感兴趣的分子的生物活性。
在又一实施方案中，本发明提供根据上述实施方案测定至少一种感兴趣的分子的生物活性的方法，包括以下步骤：
a)按照上述方法测定溶液中测试分子的构象；
b)使样品与测试分子接触；
c)按照上述方法测定含有a)中定义的测试分子的样品的构象；
d)用至少两个不同样品重复步骤b)和c)；
e)比较a)、c)和d)中获得的构象；以及
f)推断所述感兴趣的分子的生物活性。
在一实施方案中，阿托品是测试分子，测试组织是脑提取物。在一特定实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)使样品与阿托品接触；
b)按照上述方法测定含有a)中定义的阿托品的样品的指纹图谱；
c)用至少两个不同样品重复步骤b)和c)；
d)比较b)和c)中获得的指纹图谱；以及
e)推断阿托品的生物活性。
这种方法允许观察生理条件下阿托品和脑提取物的相互作用。
在另一实施方案中，这种方法应用于各种组织和/或器官提取物，例如脑如小脑、海马体、枕叶、顶叶皮层的提取物，以获得每种脑提取物中阿托品的指纹图谱。在一优选实施方案中，获得各个温度下的所述指纹图谱，优选地，该温度选自正温和负温(摄氏度)。
这实现了脑提取物或特定脑提取物的阿托品和组分之间组装体的可视化。其还允许观察是否不存在这种组装体。这提供了关于相对于每种测试的脑提取物的阿托品的潜在生物效果的信息。
下面在实施例部分给出关于本发明的方法应用于阿托品的更详细说明。
在一优选实施方案中，在严格控制的温度即从37℃到-37℃再回到37℃时，基于光源和检测器的恒定谐振实施上述的本发明的方法。
这种方法允许鉴定用于感兴趣的受体并因此参与药物研究和研发过程的配体。
详细说明所有实施例和附图，以解释本发明和其数个步骤。它们不限制本发明的范围。
实施例
下文中使用的所有化学物质采购自Sigma 在改良版的具有红外采样能力的Cary 5000双采样分光光度计上进行光谱分析。材料是在250nm下激发的单色仪UV-Vis 1200线/mm和在800nm下激发的NIR(近红外)800线/mm，是检测器NIR冷却的InGaAs(砷化镓铟)。
1)膜制备
死后的人脑或从雄性威斯塔鼠(Wistar rat)分离的小鼠全脑，立即转移到冰的TRIS-EDTA缓冲液中。在液氮中和4℃分别进行3个连续快速冻结和融解循环之前，按同样的方式对全脑或小脑、海马体、下丘脑/丘脑、新皮层、前额皮质和纹状体分别进行均质。其后于4℃以6500xg离心20分钟。使用BCA蛋白分析方法测定总蛋白质浓度，储存在-20℃下待用。每个部分仅融解一次用于每个实验系列。
2)动态光谱
在所有不同条件中进行所有实验，与溶剂或参比分子比较。从空白(溶剂)和参比分子减去呈现的图表。
对于稀释实验，总分离蛋白使用的浓度为10-3、10-6和10-9mg/ml。对于不同脑结构的实验，样品稀释为10-6mg/ml。对于使用测试分子的实验，样品使用的浓度为10-6mg/ml。所有实验均在体积为110μl时进行。样品缓冲液构成空白。对于使用测试分子的实验，将10μl终浓度为1μM的阿托品和硫双酚二氯加入测试样品中。空白由样品缓冲液中1μM的测试分子组成。简言之，上述浓度和体积的总蛋白以及空白在-37℃急速冷冻。在900-1410nm之间进行动态频谱样品的采样，每个样品进行35秒，从-37℃逐渐到37℃，根据实验设定，以7或10度为增加的温度间隔。
3)结果
图2-10中示出3种不同稀释比的大鼠下丘脑提取物蛋白质构象中的动态变化。
在图2中，1340nm的吸收峰显示不同蛋白质浓度之间没有差异。全部吸收光谱是相同的，表明在正常生理温度下，各种条件之间的分子指纹图谱差异不显著。
在图3中，与图2相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式不同。尽管D2的吸收光谱在1200-1350nm之间保持最高，与溶剂和D3相比，D1中后者发生在1350-1400nm之间。该现象在1200-1300nm时相反(reversed)。这些变化表明与图2相比，水分子按浓度和温度依赖方式设置。这意味着近红外(NIR)区的水吸收受蛋白质浓度的影响，其中在D1、D2和D3之间其动态是显著的。
在图4中，与图3相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式不同。尽管D2的吸收光谱在1250-1400nm保持最高(与图3的1200-1350nm相比)，D1中后者与溶剂相比发生在1380-1400nm之间，与D3相比发生在1200-1350nm之间。D1的吸光率在1350-1400nm间相对高于溶剂，在1200-1350nm间相对低于溶剂。这些变化表明(与图2和图3相比)水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。这意味着NIR区的水吸收受蛋白质浓度的影响，其中在D1、D2和D3之间其动态是显著的。
在图5中，与图3和图4相比，蛋白质指纹图谱的全部光谱的浓度和温度依赖方式不同。尽管D2的吸收光谱相对于D1和D3在1200-1400nm(与图4的1350-1400nm相比)保持最高，其保持低于溶剂的吸收光谱。这些变化表明(与图2-4相比)水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。这些差异还随着温度升高而减小。这意味着NIR区的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，图2-5中在D1、D2和D3之间其是显著的。
在图6中，与图3-5相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式不同。尽管在1200-1400nm之间(与图4的1350-1400nm相比)，D2的吸收光谱相对于溶剂、D1和D3在1300-1400nm之间是最低的，但其在1200-1250nm之间保持最高。这些变化表明(与图2-5相比)水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。随温度升高这些差异更为显著。这意味着NIR区中的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如图2-5中D1、D2和D3之间所示。
在图7中，与图3-6相比，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱的浓度和温度依赖方式不同。其形态保持相似。与溶剂、D1和D2相比，D3的吸收光谱在1200-1400nm之间最低。D1的吸收光谱最高，并且随波长从1450降低至1200nm而升高。这些变化表明(与图2-6相比)水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。随温度升高，这些光谱形态的差异和演变更为显著。这意味着NIR区中的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如图2-6中D1、D2和D3之间所示。
在图8中，对于溶剂和D1，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱没有差异。在1200-1450nm之间，溶剂、D1和D2、D3之间成对地存在明显差异与在1350nm的相比，D2和D3的吸光率在1200nm时都更高。看起来与图3-7相比，这两个独立的吸光率变化，特别是对于D3，是温度依赖型的。这些变化表明(与图2-7相比)水分子按浓度和温度依赖方式设置在蛋白质分子周围。随温度升高，这些光谱形态的差异和演变更为显著。这意味着NIR区中的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如图2-6中D1、D2和D3之间所示。
图9示出还未完全返回至基线。对于溶剂、D1和D3，蛋白质指纹图谱的全部吸收光谱没有差异(1200-1450nm)。虽然D2的光谱形态与其它的相似，但在1200-1350nm之间的基线返回似乎被延迟或改变了。此时，温度变化和该特定浓度的蛋白质的存在的组合阻止水分子回到其原始状态。它们不可逆地改变了位置，从而改变其在NIR波长下的吸光率。这意味着NIR波长下的水吸收受蛋白质浓度的影响小于温度的影响，如图2-6中D1、D2和D3之间所示。
图10示出根据温度变化即从37℃到-37℃再回到-37℃的蛋白组装体的光谱演变。该光谱形态随温度变化而变化。这是由于蛋白质周围的水分子分别在每一温度中的重排和相互作用导致的。这意味着水分子的吸收导致蛋白质不同构象的固态指纹图谱(solidfingerprint)。
如所见，蛋白质构象变化取决于蛋白质浓度和温度。当示出从-37℃到37℃示出的温度光谱演变时，就这点而言，图10中的差异更为显著。
图11示出存在干扰蛋白质组装体的硫双二氯酚时大鼠下丘脑提取物的结果。硫双二氯酚改变了蛋白质构象，从而其也改变了NIR波长内的水分子光谱。注意到与图3相比，后者在-37℃时变化最大。其返回基线快速。这意味着硫双二氯酚引起的构象变化在低温时是可见的，并且随着温度升高是可逆的。如图11所示，硫双二氯酚干扰蛋白质组装体，蛋白质构象方式适合存在的水分子，并因此得到特征指纹图谱。
图12示出37℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。在存在阿托品时不同脑结构的光谱形态虽然按照相同的趋势但并不相似。来自顶叶的蛋白质的吸收光谱与其余的相比在900-1000nm之间更高。该差异不具结论性。这意味着不同人脑结构之间的水分子的初始重排是不可比的，在37℃下也不足以被注意到。
图13示出-37℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。存在阿托品时不同人脑结构的吸收光谱之间有巨大差异。小脑蛋白质周围的水分子在1100-1400nm之间吸收较少，其中顶叶蛋白质周围的水分子吸收最多。不同脑结构中的水分子排列不同，预告着其结构和功能不同。后者有利于分子构象指纹图谱和其在人类中的对应生理作用。这意味着与图12相比，由于温度的变化，可观察到指纹图谱。
存在阿托品时不同人脑结构中的蛋白质组装体不一样。虽然在37℃时，这些差异不显著，但其在-37℃时显著不同(图12和13)。所述变化全按组织依赖型方式遵循其特定动态模式(图14和15)。
图14示出-7℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。如通过水分子NIR光谱所见的，小脑蛋白质构象变化。其在1250-1400nm之间最高。相反，存在阿托品时，海马体蛋白质对水重排的影响与来自小脑的相反，因为其在相同波长范围内吸收更少。这意味着由于水分子吸光率的变化，可研究来自不同结构的蛋白质由于药物的存在引起的细微构象变化。
图15示出7℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。存在阿托品时，如通过水分子NIR光谱所见的，小脑蛋白质构象变化。其在1250-1400nm之间最高。相反，存在阿托品时，海马体蛋白质对水重排的影响与来自小脑的相反，因为其在相同波长范围内吸收更少。这意味着由于水分子吸光率的变化，可研究来自不同结构的蛋白质的细微构象变化。
图16示出37℃下存在阿托品时来自不同人脑结构的蛋白质组装体。虽然基线返回不完全一样。NIR波长下的全部吸收光谱是可比的，但小脑比其它的更低。这意味着阿托品将来自人小脑的蛋白质构象改变为与来自其它结构的不同(因为回到37℃之后其是显著的)。后者与不同人脑组织中已知的毒蕈碱型受体分布一致。
4)结论
该动态光谱提供即可用于基础研究又可用于制药需求的易适应任何种类的筛选的有力探索方法。其简单且易于操作。由于其一步设置，实验误差最小，并且其重现性增加。其是用于所有领域的医学研究中生物标记物研究、药物研发和个体化医疗的最适合的方法。
它还是用于结构生物化学的强大技术。
本发明的方法用于针对炎性肠病(IBD)的临床试验的实例
该临床试验针对炎性肠病(IBD)。根据英夫利昔(infliximab)标准临床协议治疗患者，且基于MAYO评分体系评估其一般病症。本发明的方法旨在前瞻性研究中鉴定英夫利昔()的应答子和非应答子特征(profile)。
患者
所有患者都接受英夫利昔()治疗。英夫利昔是抗TNFα。在Erlange医院日间病房寻求医疗救助的平均年龄为43±8岁的50例患者(女性16名，男性34名)参与该研究。使用柠檬酸钠vacutainer管采集患者全血(5-10ml/例患者)。样品是盲样样品。
样品制备
从血样品聚蔗糖(Ficoll)梯度分离外周血单核细胞(PBMC)，然后冰冻。在生理条件中制备粗PBMC膜，而不加入任何蛋白酶抑制剂或抗磷酸酶或裂解缓冲液。对PBMC样品进行三次快速深冷冻(液氮，于4℃缓慢融解，循环)。测定蛋白质浓度：用BCA分析(BCA蛋白质分析试剂，二喹啉甲酸)测定总蛋白质浓度。
药物：提供冻干形式的英夫利昔，并使用无菌双蒸超纯水按1mg/ml置于溶液中。
实验
向光谱细胞(样品和空白，分别)中加入100μl HBS和10μl来自每例患者的PBMC的粗膜蛋白质(终浓度为0.01mg/ml)。于37℃下在波长范围850-1450nm内进行基线光谱实验。之后在相同波长区间内于-37℃然后升温至37℃下进行实验。在重复相同实验循环之前，将终浓度为10e-6M的英夫利昔加入测试样品中。对每个患者样品重复该实验三次。
结果
在存在和不存在英夫利昔时分析一个变量：比较单个大分子体积(INV)，其定义为由于不存在和存在药物时的大分子构象变化引起的从-37℃到37℃的总大分子光谱变化，表达为作为温度和波长的函数的吸光率变化。体积的微小变化表明治疗的细微影响，反之大变化预告其在大分子重排中的重要性，并因此对于治疗效果可能性更高。图17和18中示出结果。
图17示出应答子样品对英夫利昔的INV图(profile)，Y轴＝吸光率，X轴＝波长(nm)，且Z轴＝温度(℃)。
图18示出非应答子样品对英夫利昔的INV图(轴与图17中相同)。
基于其从-37℃到37℃的光谱指纹图谱对结果进行分析，并进行比较以鉴别有应答患者和无应答患者。
其显示，就INV而言，对于对英夫利昔有应答的患者，存在英夫利昔时其全体一致增加。
然后将鉴定为是英夫利昔应答子的患者样品与临床试验中患者的MAYO分数比较，在对英夫利昔有应答的患者列表与显示出该实验期间其指纹图谱光谱显著变化的样品之间存在完美的对应性。
另一步骤是选择有应答和无应答患者之间不同的特征生物标记物。所述生物标记物将能用作有应答或无应答患者对治疗的特征。
Claims (11)
1.在生理条件下通过光谱技术获得样品中至少一个感兴趣的生物分子的指纹图谱的方法，其包括：
a)将所述样品暴露于近红外光谱中的光源下；
b)测量各种波长下包围所述感兴趣的生物分子的水分子的光强透射率；
c)测定所述感兴趣的生物分子的指纹图谱；
其中获得包括负温的不同温度下的多个指纹图谱，并且对其进行编译以推断所述感兴趣的生物分子的动态构象行为。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述近红外光谱介于680-2500nm。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述近红外光谱介于900-1410nm。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述近红外光谱介于680-1100nm。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在-37℃和37℃之间的温度范围内测量结果。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述范围内每一整数度获得一个指纹图谱。
7.在生理条件下使用光谱技术确定样品中至少一个感兴趣的生物分子的构象的方法，其包括：
a)按照权利要求1-6中任一项所述的方法确定所述感兴趣的生物分子的指纹图谱；以及，
b)由步骤a)的结果确定所述感兴趣的生物分子的构象。
8.确定至少一个感兴趣的生物分子的生物活性的方法，其包括：
a)使样品与测试生物分子接触；
b)按照权利要求1-6中任一项所述的方法确定含有所述测试生物分子的所述样品的指纹图谱；
c)用至少两个不同的样品重复步骤a)和b)；
d)比较b)和c)中得到的所述指纹图谱；以及，
e)推断所述感兴趣的生物分子的生物活性。
9.如权利要求8所述的方法，其包括以下步骤：
a)按照权利要求1-6中任一项所述的方法测定溶液中所述测试生物分子的指纹图谱；
b)使所述样品与测试生物分子接触；
c)按照权利要求1-6中任一项所述的方法确定含有所述测试生物分子的所述样品的指纹图谱；
d)用至少两个不同样品重复步骤b)和c)；
e)比较a)、c)和d)中获得的所述指纹图谱；以及
f)推断所述感兴趣的生物分子的生物活性。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述样品选自组织提取物或器官提取物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述样品是脑提取物。
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| Perez-Guaita et al. | Multimodal vibrational imaging of cells | |
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| Rayyad et al. | Quantification of clinical mAb solutions using Raman spectroscopy: Macroscopic vs microscopic analysis | |
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| Wetzel | Mid-IR and near-IR chemical imaging: Complementary for biological materials | |
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| Nelson | Introduction to spectroscopy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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