CN104569407B

CN104569407B - 一种真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置

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Publication number: CN104569407B
Application number: CN201410820047.2A
Authority: CN
Inventors: 曾俊伟; 林育佳; 吕柱彬; 马兴彦; 袁海华; 施志远
Original assignee: SHENZHEN KANGBOLIN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN KANGBOLIN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2034-12-25
Also published as: CN104569407A

Abstract

本发明提供了一种真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置。本发明通过构建真菌毒素检测数据库，联合单标准酶联免疫检测技术，检测人员只需使用本发明提供的不含毒素的单个标准品，即可完成对待测样品的检测；相对传统ELISA检测技术来说，本发明提供的技术方案不再需要使用含有毒素的标准品制作标准曲线，在保证准确度和灵敏度的同时，大大提高了ELISA检测技术的可操作性、减少了检测试剂的使用，具有简便、省时、快速、实用、环保等优点。

Description

一种真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置

技术领域

本发明涉及生物医学组织工程技术领域，尤其涉及一种真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置。

背景技术

真菌毒素(mycotoxin)是由某些真菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，目前已知的种类有300多种，有30多种真菌毒素对人类和动物有强毒性，包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲毒素和伏马毒素等，这些毒素可广泛污染食物、农作物及其制品等。产毒真菌污染食品后，可使食用者中毒，有些毒素可以诱导基因突变和产生致癌性，有些则显示出对特定器官的毒性。

用来检测真菌毒素的常用方法有LC-MS、GC-MS、HPLC等，但是这几种方法检测步骤相对繁琐，对仪器要求较高，不适合大量样本的快速检测。近年来应用最广泛的是酶联免疫吸附测定方法(ELISA)，该方法具有敏感、特异、稳定、简便的优点，适合真菌毒素的检测。但是，在ELISA检测过程中，需要添加毒素标准品，增加了检测人员被毒素污染的风险。同时需要绘制标准曲线，计算过程较复杂，耗时较长。

因此，有必要提供一种能简便、快速检测真菌毒素的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置。

本发明通过构建真菌毒素检测数据库，联合单标准酶联免疫检测技术，检测人员只需使用本发明提供的不含毒素的单个标准品，即可完成对待测样品的检测；相对传统ELISA检测技术来说，本发明提供的技术方案不再需要使用含有毒素的标准品制作标准，在保证准确度和灵敏度的同时，大大提高了ELISA检测技术的可操作性、减少了检测试剂的使用，具有简便、省时、快速、实用、环保等优点。

第一方面，本发明提供了一种真菌毒素检测数据库的构建方法，包括如下步骤：

(1)提供或配置N种真菌毒素的系列标准品，每种真菌毒素的系列标准品包括M个浓度梯度的溶液，其中，N、M均为自然数，且M不小于5；

(2)取每个系列标准品分别采用ELISA检测，其中，每个系列标准品均进行ΣR_Q+P次ELISA检测，对所得的检测数据进行线性回归分析，制作标准曲线，得到N*(ΣR_Q+P)条标准曲线，构建成真菌毒素检测数据库；其中，Q表示ELISA检测中的Q种影响因素，R_Q为第Q种影响因素中设置了R_Q种变量，Q、R、P均为自然数，且Q不小于2；

P表示Q种影响因素各取随机变量进行P次检测，每次P检测时，在Q种影响因素中随机设置至少2种影响因素，第Q种影响因素设置了R’_Q种变量，各种影响因素的R’_Q种变量进行随机组合，P＝Σ(C_Q ²)[(R’_Q)]，所述(C_Q ²)表示在Q种影响因素中随机设置至少2种影响因素，(R’_Q)表示第P次检测时，选取的各影响因素的R’_Q的乘积，R’为自然数，Σ(C_Q ²)[(R’_Q)]表示(C_Q ²)种影响因素组合下的(R’_Q)之和。

在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述N种真菌毒素包括但不限于目前已知的300多种真菌毒素。

在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述N种真菌毒素为粮食制品中真菌毒素残留。

在本发明一优选实施例中，所述步骤(1)中，所述N种真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲毒素、伏马毒素、T2毒素、棒曲霉素和展青霉素的至少一种。

在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述M为5～8的自然数。

在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述M为5或6。

如本发明所述的，所述步骤(2)中，“Q种影响因素”为传统ELISA检测中，制备标准曲线时影响整个反应体系OD值的因素，包括但不限于反应体系的操作时间(比如变化孵育的时间或显色的时间)、孵育温度(比如样品和抗体的孵育时间、显色液的孵育时间)、加样时间(每次加样1～2min)、洗板方式(比如洗板的次数)以及试剂盒存放时间，其中，所述反应体系即ELISA间接竞争反应体系，包括抗原或是二抗的包被、抗原抗体的反应、显色反应等常规实验步骤。

如本发明所述的，所述步骤(2)中，“R_Q”表示不同影响因素设置了不同变量，比如，影响因素Q为操作时间时，其他影响因素不变，设置操作时间为-18、-15、-12、-9、-6、-3、0、3、6、9、12、15、18分钟13个变量，则R_Q即为13，其中，负数表示比正常操作时间快(正常操作时间为成品试剂盒给定的体系反应时间，负数的绝对值表示快的时间)，负数越大，表示操作越快，花的时间越少；再比如，影响因素Q为加样方式时，其他影响因素不变，设置加样方式为1)加完标准品以及其他试剂后，不震荡混匀，2)加完标准品以及其他试剂后，轻轻震荡混匀，2个变量，则R_Q即为2。

如本发明所述的，所述步骤(2)中，“P”表示进行P次检测，每次检测均随机变换操作时间(比如变化孵育的时间或显色的时间)、孵育温度(比如样品和抗体的孵育时间、显色液的孵育时间)、加样时间(每次加样1～2min)、洗板方式(比如洗板的次数)以及试剂盒存放时间中至少两种影响因素的变量；比如，可以选取操作时间、孵育温度两种影响因素，随意变化操作时间和孵育温度，其他影响因素不变，当操作时间的变量为20、25、30分钟，孵育温度的变量为35℃、36℃、37℃、38℃时，P＝Σ(C_Q ²)[(R’_Q)]＝Σ(1)[(3*4)]＝12次检测，可获得12条标准曲线。

需要注意的是：Σ(C_Q ²)[(R’_Q)]中，(C_Q ²)并不是要和[(R’_Q)]相乘，(C_Q ²)是一个标识，表示的是有多少种组合，即(R’_Q)要计算多少次，相应的(R’_Q)要求和(C_Q ²)次。比如上述距离中，(C_Q ²)为1，即(R’_Q)只有1个值，12。

在本发明一实施例中，所述步骤(2)中，所述线性回归分析的方法为采用常规的统计学中线性回归分析的方法，可用excel完成。

本发明提供的真菌毒素检测数据库的构建方法，综合考虑了检测人员检测习惯，进行多因素影响模拟实验，得到大量的检测数据；其中，多因素影响包括操作时间、孵育温度、加样方式、加样时间、洗板方式以及试剂盒存放时间等，这些因素来源于长期的收集和实验模拟，最大程度地获得了覆盖面广的标准曲线集合。

第二方面，本发明提供了一种真菌毒素的检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂盒a或试剂盒b，其中，

试剂盒a包括：

(1)包被真菌毒素抗原的酶联板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的二抗；

(3)真菌毒素单克隆抗体或多克隆抗体；

(4)真菌毒素标准品0溶液a，所述真菌毒素标准品0溶液a中，真菌毒素的浓度为0μg/L，所述真菌毒素标准品0溶液a为含有血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

(5)底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺、四甲基联苯胺硫酸盐或氨基水杨酸；

(6)终止液a为硫酸缓冲液或盐酸缓冲液；

(7)洗涤液a为pH 7.0～8.0，含有0.1％～0.5％吐温20，0.1％～2％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；

(8)抗体稀释液为pH值7.0～8.0，含有2％～15％血清的磷酸盐缓冲液；

(9)复溶液a为含有0.5～2％小牛血清、5％～80％甲醇的磷酸盐缓冲液；

试剂盒b包括：

(1)包被二抗的酶联板；

(2)用碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原；

(3)真菌毒素单克隆抗体或多克隆抗体；

(4)真菌毒素标准品0溶液b，所述真菌毒素标准品0溶液b中，真菌毒素的浓度为0μg/L，所述真菌毒素标准品0溶液b为含有血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

(5)底物显色液b对硝基磷酸盐缓冲液；

(6)终止液b为氢氧化钠缓冲液；

(7)洗涤液b为PH 7.0～8.0，含有0.5％～2％吐温20和0.1％～0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；

(8)复溶液b为含有30％～70％甲醇、0.5％～2％血清的磷酸盐缓冲液。

优选地，所述试剂盒a包括：

(1)包被真菌毒素抗原的酶联板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的二抗；

(3)真菌毒素单克隆抗体或多克隆抗体；

(4)真菌毒素标准品0溶a液，所述真菌毒素标准品0溶液a中，真菌毒素的浓度为0μg/L，所述真菌毒素标准品0溶液a为含有0.5％～15％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

(6)终止液a为0.1～0.5mol/L硫酸缓冲液或盐酸缓冲液；

(7)洗涤液a为pH 7.4，含有0.1％～0.5％吐温20，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；

(8)抗体稀释液为pH值7.0～8.0，0.05mol/L、含有3％小牛血清的磷酸盐缓冲液；

(9)复溶液为含有5％～80％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。

进一步优选地，所述试剂盒a中，所述步骤(7)中，所述洗涤液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，所述洗涤液以15～20倍浓度的浓缩液形式备用。

进一步优选地，所述试剂盒a中，所述步骤(8)中，所述抗体稀释液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M。

进一步优选地，所述试剂盒a中，所述步骤(9)中，所述复溶液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，所述复溶液以5～10倍浓度的浓缩液形式备用。

优选地，所述试剂盒b包括：

(1)包被二抗的酶联板；

(2)用碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原；

(3)真菌毒素单克隆抗体或多克隆抗体；

(4)真菌毒素标准品0溶液b，所述真菌毒素标准品0溶液b中，真菌毒素的浓度为0μg/L，所述真菌毒素标准品0溶液b为含有0.5％～2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

(5)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液；

(6)终止液为2mol/L的氢氧化钠缓冲液；

(7)洗涤液为PH 7.4，含有0.8％吐温20和0.1％叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；

(8)复溶液为含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液；以5～10倍浓度的浓缩液形式备用。

进一步优选地，所述试剂盒b中，所述步骤(7)中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mm/L M，所述洗涤液以10～20倍浓度的浓缩液形式备用。

进一步优选地，所述试剂盒b中，所述步骤(8)中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mm/L M，所述复溶液以5～10倍浓度的浓缩液形式备用。

如本发明所述的，所用血清均优选为牛血清。

本发明所述方法a的检测原理：当包被原为真菌毒素偶联抗原时是将真菌毒素与牛血清白蛋白偶联物吸附于固相载体上。在测定时，样本中残留物真菌毒素和微孔中预包被的偶联抗原竞争抗真菌毒素抗体，加入酶标二抗，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物真菌毒素的含量成负相关。将标准品0和样本吸光度值输入数据分析软件，得出受检样品中真菌毒素的含量。

本发明所述方法b的检测原理：包被原为二抗时是将二抗吸附于固相载体上，加入真菌毒素特异性抗体，再加入酶标记的真菌毒素抗原和样本，样本中残留的真菌毒素和酶标记的真菌毒素抗原竞争真菌毒素特异性抗体，用TMB显色后终止，测定样本的吸光度值，该值与样本中真菌毒素残留量呈负相关。将标准品0和样本吸光度值输入数据分析软件，得出受检样品中真菌毒素的含量。

如本发明所述的，所述“真菌毒素的检测试剂盒a”与“单标准检测真菌毒素的酶联免疫试剂盒a”通用，所述“真菌毒素的检测试剂盒b”与“单标准检测真菌毒素的酶联免疫试剂盒b”通用。

第三方面，本发明提供了一种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：S1.样品处理，并使用酶标仪检测样品的OD值；S2.调用分析模块；S3.输入OD值；S4.调取预定程式；S5.操作预定程式；S6.读取检测结果。

在本发明一实施例中，所述步骤S1中，样品处理包括样品的预处理阶段和用试剂盒处理样品阶段；

在本发明优选一实施例中，所述预处理的具体操作为：当所述待测真菌毒素样品为水溶性固体样品或者液体样品时，直接用复溶液按比例稀释，得到待测样品溶液；当所述待测真菌毒素样品为固体样品碎化后加水振荡提取或超声提取，若溶解，直接用复溶液按比例稀释；若不溶解，取上清，用复溶液按比例稀释；得到待测样品溶液。

进一步优选地，所述复溶液为1x复溶液。

在本发明优选一实施例中，所述试剂盒处理采用了本发明提供的真菌毒素的检测试剂盒a(单标准检测真菌毒素的酶联免疫试剂盒a)，具体操作为：

a-1)向真菌毒素偶联抗原包被的酶标板微孔中分别加入标准品0溶液a以及待测样品溶液20～80ul/孔，再加入酶工作液50～80ul/孔，真菌毒素抗体工作液20～80ul/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃(优选37℃)下孵育10～60min分钟；

a-2)倒出孔内液体，用洗涤液a洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干；

a-3)加入底物显色液A液50μl/孔，再加底物显色液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，20℃～39℃(优选37℃)恒温箱避光显色5～30min；

a-4)每孔加入终止液a 50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

进一步优选地，所述步骤(a-2)中，所述洗涤液a的加入量为250μl/孔，用吸水纸拍干后，未被清除的气泡可用干净的枪头刺破。

进一步优选地，所述步骤(a-3)中，底物显色液A、B液或终止液a的加入量为50μl/孔。

进一步优选地，所述步骤(a-1)中，3次加液体的规定操作时间为：每次规定1～2min，3次共计3～6min。

进一步优选地，所述步骤(a-3)中，2次加液体的规定操作时间为每次规定1～2min，2次共计2～4min。

在本发明优选一实施例中，所述试剂盒处理采用了本发明提供的真菌毒素的检测试剂盒b(单标准检测真菌毒素的酶联免疫试剂盒b)，具体操作为：

b-1)向羊抗兔抗抗体包被的酶标板微孔中加入真菌毒素兔多克隆抗体工作液100ul/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃(优选37℃)恒温箱中反应30～120min，倒出孔中液体，用洗涤液b洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干；

b-2)每孔加入碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原20～80μl，再分别加入标准品0溶液b以及样本溶液20～80μl/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃(优选37℃)恒温箱中反应10～30min；

b-3)倒出孔中液体，用洗涤液b洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干；

b-4)加入底物显色液b，轻轻振荡混匀，20℃～39℃(优选37℃)恒温箱避光显色10～30min；然后加入终止液b，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

进一步优选地，所述步骤(b-1)和(b-3)中，所述洗涤液b的加入量为250μl/孔，用吸水纸拍干后，未被清除的气泡可用干净的枪头刺破。

进一步优选地，所述步骤(b-4)中，底物显色液b的加入量为100μl/孔，终止液b的加入量为50μl/孔。

进一步优选地，所述步骤(b-1)和(b-1)中，3次加液体的规定操作时间为每次规定1～2min，3次共计3～6min。

进一步优选地，所述步骤(b-3)中，1次加液体的规定操作时间为每次规定1～2min，3次共计2～4min。

本发明所述的抗体，一般采用1000～10000倍稀释，或按照购买回来的说明书稀释或使用。

在本发明一实施例中，所述步骤S2中，所述每种真菌毒素对应至少一个分析模块。

本发明构建的300多种真毒毒素的标准曲线数据库包括多个子数据库，每种真菌毒素的标准曲线数据库对应至少一个子数据库，每个子数据库对应一个分析模块。

在本发明一实施例中，所述步骤S2～S5(S2.根据待测真菌毒素的种类调用分析模块；S3.输入OD值；S4.操作预定程式；S5.读取检测结果)采用了本发明提供的真菌毒素快速检测仪。

在本发明一优选实施例中，所述真菌毒素快速检测仪包括电子数据分析终端，所述电子数据分析终端包含一计算机主机101、一显示器102。计算机主机101与显示器102有电连接；计算机主机101包含分析模块103和处理模块104；将OD值输入分析模块103后，处理模块104获取分析模块103传输的电子信息，处理模块104的数据处理结果在显示器102通过一图形界面得以显示。

在本发明一优选实施例中，步骤S2所述的根据待测真菌毒素的种类调用分析模块具体包括：开机，进入显示器102的检测图形主界面，调用匹配的真菌毒素分析模块103，进入“定量检测”界面。

进一步优选地，所述“定量检测”界面出现输入数值界面，上面有输入零标准OD值的2个输入框，下面有可以输入6个检测样本OD值的12个输入框，每个样本各2个平行；中间有样本稀释倍数选择，根据需求进行选择。

在本发明一优选实施例中，步骤S3所述的输入OD值具体包括：将所检测的标准品0吸光度值、待测样品吸光度输入其分析模块103。

进一步优选地，所述吸光度输入分析模块103的操作由人工在显示器102一图形界面中输入完成。

在本发明另一优选实施例中，计算机主机101还包含数据采集模块105，所述数据采集模块105与酶标仪有电连接；在此优选条件下，所述数据采集模块105将酶标仪检测的吸光度值输入分析模块103。

在本发明一优选实施例中，步骤S4所述的操作预定程式具体包括：处理模块104将其与数据库中的标准品0吸光度值进行比对，同时自动调用数据库中与试剂盒所测标准品0吸光度值一样或是最为接近的计算公式进行比对分析。

本发明真菌毒素快速检测仪处理模板104调用的数据库，预先存储在主机中，该数据库为本发明在真菌毒素标准数据库建立及数据分析需求的基础上，通过对软件进行了系统设计，软件编码阶段，根据功能、性能、界面等方面的设计要求，将标准曲线的数据分析结果导入软件程序中，最后对编写完成的软件进行测试，获得存储在真菌毒素快速检测仪主机中的数据库。

在本发明一优选实施例中，步骤S5所述的读取检测结果具体包括：处理模块104的数据处理结果在显示器102通过一图形界面得以显示。

优选地，输入对应标准品0和样本的检测OD值后(如样本只做了一个检测值，请把该值输入两遍)，点击确定后，界面右边出现对应的计算结果。

如需计算第二批样本，点击清除按钮，数值全部变为空白值，继续对第二批样本进行计算，重复步骤S2～S5即可。

采用本发明提供的电子数据分析终端，所检测的标准品0吸光度值、待测样品吸光度输入其分析模块103后，处理模块104将其与数据库中的标准品0吸光度值进行比对，同时自动调用数据库中与试剂盒所测标准品0吸光度值一样或是最为接近的计算公式进行比对分析，得出待测样品中真菌毒素的含量。

在本发明另一实施例中，本发明提供了的真菌毒素的检测方法，优选包括如下步骤：S1.样品处理，并使用酶标仪检测样品的OD值；S2.调用分析模块；S3.输入OD值；S4.调取预定程式；S5.操作预定程式；S6.读取检测结果。具体而言，本包括如下步骤：

1、样品预处理，并使用酶标仪检测样品的OD值；

2、开机，进入检测主界面，调用匹配的真菌毒素分析模块，进入“定量检测”界面；

3、按照该仪器软件“定量检测”界面上的真菌毒素检测说明书的步骤(预定程式)进行操作；

4、直接读出检测结果。

在本发明一个实施例中，所述的真菌毒素检测说明书的步骤如下：

a.双击单标准计算软件，点击进入计算按钮。

b.出现输入数值界面，上面有输入零标准OD值的2个输入框，下面有可以输入6个检测样本OD值的12个输入框，每个样本各2个平行。中间有样本稀释倍数选择，根据需求进行选择。

c.输入对应标准品0和样本的检测OD值后(如样本只做了一个检测值，请把该值输入两遍)，点击确定，界面右边出现对应的计算结果。如需计算第二批样本，点击清除按钮，数值全部变为空白值，继续对第二批样本进行计算。

d.软件使用完，点击退出按钮。

本发明提供的单标准专业计算软件的应用原理是通过多因素影响模拟实验，得到标准品0～4(标准品的数量不限于5个)的吸光度值，所得标准品0的吸光度值范围一般在1.00～3.00(优选为1.50～2.50)之间但不限于该范围，构建成不同影响因素下的标准曲线数据库。在用试剂盒对样品进行检测过程中，所检测的标准品0吸光度值输入软件后，软件将其与数据库中的标准品0吸光度值进行比对，同时自动调用数据库中与试剂盒所测标准品0吸光度值一样或是最为接近的计算公式进行比对分析，得出受测样品中真菌毒素的含量。

第四方面，本发明还提供了一种真菌毒素的检测装置，包括电子数据分析终端，所述电子数据分析终端包含一计算机主机101、一显示器102，计算机主机101与显示器102电连接；计算机主机101包含分析模块103和处理模块104；将待检测样本的OD值输入分析模块103后，处理模块104获取分析模块103传输的电子信息，处理模块104的数据处理结果在显示器102通过一图形界面得以显示。

优选地，所述真菌毒素的检测装置还包括数据采集模块105，所述数据采集模块105与酶标仪电连接，所述数据采集模块105将酶标仪检测的吸光度值输入分析模块103。

优选地，所述真菌毒素的检测装置包括的电子数据分析终端为如第二方面所述的电子数据分析终端。

本发明提供的真菌毒素检测数据库的构建方法、真菌毒素检测方法、试剂盒及装置，具有以下优点和有益效果：

a.简便性——检测过程中只需加入真菌毒素标准品0和待测样品。将标准品0和样品吸光度值输入试剂盒配套单标准数据分析软件即可得到结果，无需用户计算、无需绘制标准曲线，非专业人员也能熟练操作。

b.实用性——试剂盒只需添加标准品0，与以往技术相比，节省了添加标准曲线的步骤，提高检测效率和减少操作误差。

c.环保性——试剂盒标准品中不含真菌毒素，避免了检测人员对毒素的接触和废弃物的处理，安全环保。

附图说明

图1是本发明实施例提供的检测真菌毒素的原理流程图。

图2为本发明实施例提供的真菌毒素快速检测仪的电子数据分析终端组成框架图。

图3为本发明实施例提供的真菌毒素快速检测仪的真菌毒素定量检测界面。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当指出，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold SpringHarbor)。

若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品，黄曲霉毒素B1，A6636，德国Dr.Ehrenstorfer；玉米赤霉烯酮，Z2000，德国Dr.Ehrenstorfer；呕吐毒素，D0156，德国Dr.Ehrenstorfer；各标准品稀释方法为：先将呕吐毒素用水稀释至1000ppb，再按照需要的比例进行稀释(比如稀释00ppb、10ppb、30ppb、90ppb、270ppb等比例)。

下面结合附图1～3进一步说明本发明是如何实现的：

实施例1

本实施例提供了一种真菌毒素检测试剂盒，其包含下述组分：

(1)包被真菌毒素抗原的酶联板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；

(3)真菌毒素鼠单克隆抗体；

(4)真菌毒素标准品溶液1瓶，浓度为0μg/L。

(5)底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为邻苯二胺；

(6)终止液为2mol/L的硫酸缓冲液；

(7)浓缩洗涤液为pH 7.4，含有0.1％～0.5％吐温20，0.5％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；

(8)抗体稀释液为pH值8.0、0.05mol/L、含有3％小牛血清和5‰N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液；

(9)浓缩复溶液为含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。

该试剂盒的使用方法为：

a-1)加样：向真菌毒素偶联抗原包被的酶标板微孔中分别加入标准品0溶液a以及待测样品溶液50ul/孔，再加入酶工作液50ul/孔，真菌毒素抗体工作液50ul/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃下孵育10～60min分钟；

a-2)倒出孔内液体，用洗涤液a(250μl/孔)洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)；

a-3)加显色液：加入底物显色液A液50μl/孔，再加底物显色液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，20℃～39℃恒温箱避光显色5～30min；

a-4)每孔加入终止液a50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

实施例2

使其包含下述组分：

(1)包被羊抗兔二抗的酶联板；

(2)用碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原；

(3)真菌毒素兔多克隆抗体；

(4)真菌毒素标准品溶液1瓶，浓度为0μg/L；

(5)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液；

(6)终止液为2mol/L的氢氧化钠缓冲液；

(7)浓缩洗涤液为PH 7.4，含有0.8％吐温20和0.1％叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；

(8)浓缩复溶液为含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。

该试剂盒的使用方法为：

b-1)加样：向羊抗兔抗抗体包被的酶标板微孔中加入真菌毒素兔多克隆抗体工作液100ul/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃恒温箱中反应30～120min，倒出孔中液体，用洗涤液b(250μl/孔)洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干；

b-2)加抗体：每孔加入碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原50μl，再分别加入标准品0溶液b以及样本溶液50μl/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃恒温箱中反应10～30min；

b-3)倒出孔中液体，用洗涤液b(250μl/孔)洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干；

b-4)加显色液：加入底物显色液b 100μl/孔，轻轻振荡混匀，20℃～39℃恒温箱避光显色10～30min；然后加入终止液b 50μl/孔，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

本发明所述试剂盒中真菌毒素包被抗原是采用常规的化学偶联方法将真菌毒素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)蛋白进行偶联得到的，二抗可为羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗，制备酶联板过程中所用的包被缓冲液的pH为值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被真菌毒素抗原或二抗的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有0.1％～0.5％吐温20，0.5％叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；所用的封闭液是含有8％～15％的脱脂奶和1％惰性蛋白的溶液。

本发明所述试剂盒中包被真菌毒素抗原的酶联板或包被二抗的酶联板的制备步骤为：

(1)用包被缓冲液将真菌毒素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联物或二抗以0.02～0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或二抗稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或二抗稀释液，37℃温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15～30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。

本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记二抗或酶标真菌毒素，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液含有50％甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1％的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。

本发明所述试剂盒中酶标记二抗(酶标二抗)的制备步骤为：

(1)二抗的制备：以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠二抗；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔二抗。

(2)过氧化物酶标记二抗的制备：首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反应较弱的分子先用过量的偶联剂活化，然后去除多余的偶联剂；第二步将一端与某种分子连接的偶联剂，通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁琐，但偶联效率较高，而且形成的同分子聚合物减少。

本发明所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与真菌毒素半抗原进行偶联得到。

本发明所述试剂盒中真菌毒素特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用活泼酯法将真菌毒素半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液；抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3％小牛血清的磷酸盐缓冲液。

本发明所述试剂盒中真菌毒素特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，其制备方法如下：

(1)真菌毒素单克隆抗体制备的步骤为：

a.动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(真菌毒素半抗原与牛血清白蛋白的偶联物)免疫剂量为80～100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2～3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；

b.细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5～10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

c.细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l～5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

d.单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l05～106个/只，7～10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；

e.抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；

f.抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02～0.08μg/ml浓度进行稀释。

(2)真菌毒素多克隆抗体制备的步骤为：

采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(真菌毒素与牛血清白蛋白的偶联物)免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7～l0天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

本发明所述试剂盒中当标记酶为过氧化物酶时底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为四甲基联苯胺硫酸盐或氨基水杨酸、终止液为0.1～0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液。

当标记酶为碱性磷酸酯酶时；底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液；终止液为2mol/L氢氧化钠溶液；浓缩洗涤液为含有0.8％吐温20，0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。

本发明所述试剂盒中真菌毒素标准品溶液为不含真菌毒素的真菌毒素标准品缓冲液，缓冲液为含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

实施例3

本实施例提供了一种真菌毒素检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1.抗原的合成

a.包被原的合成

将真菌毒素采用衍生物法合成真菌毒素半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和牛血清白蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。

b.免疫原的合成

将真菌毒素采用常规化学合成法合成真菌毒素半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和钥孔槭血蓝蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。

2.真菌毒素鼠单克隆抗体的制备

a.动物免疫

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以真菌毒素半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为300μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

c.细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×l06个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l06个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，20℃保存。

3.真菌毒素兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以真菌毒素半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为3mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

4.酶标板的制备

用包被缓冲液将羊抗兔二抗稀释成0.06μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例4

本实施例提供了一种真菌毒素检测数据库的构建方法制备方法：

本发明所述试剂盒中单标准专业计算软件是在逐步实验得出数据结果的基础上，由程序编辑软件制作而成，步骤如下：

(1)单标准检测试剂盒分析数据库的建立

对传统非单标准真菌毒素检测试剂盒(如含有标准品0：0ppb标准品；标准品1：10ppb标准品；标准品2：30ppb标准品；标准品3：90ppb标准品；标准品4：270ppb标准品)进行多因素影响模拟实验，得到大量的检测数据，通过常规的线性回归分析集合成一个标准曲线数据库。其中多因素影响包括操作时间、孵育温度、加样方式、加样时间及洗板方式等，这些因素来源于长期的检测人员检测习惯收集和实验模拟。最终通过对这些标准曲线进行统计、归纳、分析，构建了特定单标准真菌毒素检测数据结果的分析数据库。

例如，影响因素为操作时间时，实验操作时间会有差异(考虑到不同人员由于熟练程度的差异，会导致操作时间缩短或是延长；孵育温度严格规定37度)，本发明对实施例1提供的试剂盒a的不同操作时间(包括了-18到+18分钟的时间区间，负值表示比规定的操作时间短，正值表示比规定的操作时间延长，0分钟表示按照试剂盒规定的操作时间进行检测，本实施例变动的操作时间具体为：变动步骤(a-1)的孵育时间，以及步骤(a-3)的显色时间，变动比例为2:1，比如：取步骤(a-1)的孵育时间0点为30分钟，步骤(a-3)的显色时间0点为10分钟，则，当操作时间为+3分钟时，则步骤(a-1)的实际孵育时间为32分钟，步骤(a-3)的实际显色时间为11分钟)进行实验，并检测结果；

本实施例中，反应温度严格规定37度，操作时间变化时，部分实验数据如表1(包括表1-1和表1-2)所示：

表1-1

表1-2

其中，影响因素为操作温度时(包括孵育温度和显色温度比如，孵育温度通常在孵育温度室温至39度之间变化：包括20～39度)。

发明人对不同的上述孵育温度和显色温度进行实验，实验操作时间按照体系严格限定，并检测结果；本实施例中，同一次实验中，取孵育温度和显色温度的值相等。

其中，严格规定操作时间为：30分钟孵育+10分钟显色，孵育温度和显色温度发生变化时，部分实验数据如表2(包括表2-1和表2-2)所示：

表2-1

表2-2

发明人对两种影响因素(比如操作时间和操作温度，其中，操作时间具体为：变动步骤(a-1)的孵育时间，以及步骤(a-3)的显色时间，操作温度具体为：变动孵育温度和显色温度)同时变化时进行了检测分析。

当规定操作时间在-18至+18区间随机变化，操作温度在20至39度随机变化，部分实验数据包括(表3，包括表3-1和表3-2)：

表3-1

表3-2

从表1、2和3的数据可以看出，不同影响因素下，OD值同为1.7或其他数值时，其线性稳定，IC50一致。因此，在该体系下，不论操作时间和孵育温度等条件的变化，只要0标准品OD值相同其对应的IC50基本一致，从而实现单标准运算软件在不同的0零标准情况下都能对样本进行精确的定量。

上述表格数据仅为本数据库部分数据，按照上述方法，本发明人制备了50标准曲线，涵盖本领域普通技术人员常规实验操作习惯等各种影响因素，其中，所述的操作习惯的影响因素包括：操作时间(比如样品和抗体的孵育时间、显色液的孵育时间)、加样时间(每次加样的规定时间为1～2min)、洗板方式(比如洗板3次、4次和5次)及试剂盒存放时间(比如2个月、4个月、6个月)。最终构建成本发明的单标准检测试剂盒数据库。

(2)单标准检测试剂盒数据分析软件的开发

在数据库建立及数据分析需求的基础上，对软件进行了系统设计，在软件编码阶段，研发团队根据功能、性能、界面等方面的设计要求，将标准曲线的数据分析结果导入软件程序中，最后对编写完成的软件进行测试。

本发明根据实验所得的大量的基础数据，编写了该单标准品运算软件，采用本发明实施例提供的单标准品运算软件可完成对真菌毒素含量进行检测。

所得软件的定量检测界面如图3所示。

实施例5

结合图2，本实施例提供了一种真菌毒素快速检测装置，真菌毒素快速检测装置包括真菌毒素快速检测仪，所述真菌毒素快速检测仪包括电子数据分析终端，所述电子数据分析终端10包含一计算机主机101、一显示器102。计算机主机101与显示器102有电连接；计算机主机101包含分析模块103和处理模块104；将OD值输入分析模块103后，处理模块104获取分析模块103传输的电子信息，处理模块104的数据处理结果在显示器102通过一图形界面得以显示。

采用本发明提供的电子数据分析终端，所检测的标准品0吸光度值、待测样品吸光度输入其分析模块103后，处理模块104将其与数据库中的标准品0吸光度值进行比对，同时自动调用数据库中与试剂盒所测标准品0吸光度值最接近的标准曲线进行分析计算，得出待测样品中真菌毒素的含量，本实施例所述数据库为实施例4制备的标准曲线数据库，结合前处理数据，在数据库建立及数据分析需求的基础上，对软件进行了系统设计，软件编码阶段，根据功能、性能、界面等方面的设计要求，将标准曲线的数据分析结果导入软件程序中，最后对编写完成的软件进行测试。

所述吸光度输入分析模块103的操作由人工在显示器102一图形界面中输入完成。

在本发明另一实施例中，计算机主机101还包含数据采集模块105，所述数据采集模块105与酶标仪有电连接，所述数据采集模块105将酶标仪检测的吸光度值输入分析模块103。

实施例6

本实施例提供了一种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：

1.样品前处理(萃取方法的调试和软件的调试)

准确称取2±0.05g均匀粉碎样本于离心管中，加入蒸馏水10ml，充分振荡5min，室温离心5min，转速4000r/min以上。取上清液200ul加入600ul 1×复溶液稀释作为待测液；或者根据检测限按比例稀释。取50ul待测液用于分析。

2.用试剂盒a检测

向真菌毒素偶联抗原包被的96孔酶标板微孔中加系列标准品或样本溶液(各2孔)50μl，再加入酶工作液50ul/孔，真菌毒素抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应20min。倒出孔中液体，每孔加入250μl稀释后的浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入底物显色液A液过氧化氢50μl，再加显色液B液邻苯二胺50μ1，轻轻振荡混匀，20～25℃恒温箱避光显色10min。每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

3.检测结果分析

将酶标仪测定所获得的标准品0溶液的吸光度值输入单标准专业计算软件的零标准输入框(若是单孔，则重复输入)，同时将所测样品的吸光度值输入单标准计算软件的零标准输入框，同时选择样品稀释倍数，然后单击确定按钮，即可得出每个样品的中真菌毒素的含量。下表为使用单标准产品和非单标准产品对饲料中呕吐毒素含量的检测结果对比。

表4 单标准产品和非单标产品对饲料中呕吐毒素含量的检测结果比对

实施例7

本实施例提供了一种真菌毒素的检测方法，包括如下步骤：

1.样品前处理(萃取方法的调试和软件的调试)

准确称取2±0.05g均匀粉碎样本于离心管中，加入蒸馏水20ml，充分振荡5min，室温离心5min，转速4000r/min以上。取上清液400ul加入400ul 1×复溶液稀释作为待测液；或者根据检测限按比例稀释。取50μl待测液用于分析。

参照实施例4同样的方式制备标准曲线数据库，并参照实施例5的方法，在数据库建立及数据分析需求的基础上，对软件进行了系统设计，软件编码阶段，根据功能、性能、界面等方面的设计要求，将标准曲线的数据分析结果导入软件程序中，最后对编写完成的软件进行测试，提供了一种真菌毒素快速检测装置。

2.用试剂盒b检测

向羊抗兔二抗包被的96孔酶标板微孔中加入真菌毒素兔多克隆抗体工作液100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μl稀释后的浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入细菌提取碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原50μl，再加入系列标准品或样本溶液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，重复洗涤过程。加入对硝基磷酸盐缓冲液100μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液2mol/L。氢氧化钠50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

3.检测结果分析

表5 单标准产品和非单标产品对饲料中呕吐毒素含量的检测结果比对

效果实施例

为充分说明本发明的有益效果，本发明实施例还提供了如下效果实施例：

效果实施例1标准品精密度试验

本效果实施例1采用本发明实施例1所述的试剂盒a。

从每批按照实施例3(4)中的方法制备的呕吐毒素酶联板中，各抽出48个微孔，测定400μg/L标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次求平均值，计算变异系数CV％，结果见表4～7。

表6 标准精密度试验

表7 标准精密度试验

表8 标准精密度试验

表9 标准精密度试验

本发明效果实施例1的结果表明，酶连板的批内变异系数范围在2.8％～4.9％之间，批间变异系数在0.6％～7.6％之间，符合了变异系数小于15％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。

效果实施例2样本可重复性试验

本效果实施例1采用本发明实施例1所述的试剂盒a。

以真菌毒素中呕吐毒素为例进行样本可重复性实验，以400μg/L浓度的呕吐毒素对饲料、麦麸和DDGS，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表8～10。

表10 饲料样品可重复性试验

表11 麦麸样品可重复性试验

表12 DDGS样品可重复实验

本发明效果实施例2的结果表明，饲料、麦麸及DDGS样本变异系数均低于10％，符合了变异系数小于15％的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。

效果实验例3试剂盒的准确度试验

本效果实施例1采用本发明实施例1所述的试剂盒a。

以单标准真菌毒素检测试剂盒系列中单标准呕吐毒素检测试剂盒为例进行准确度试验，取两个浓度的呕吐毒素标准品溶液，分别为500μg/kg(L)和1000μg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率(表11)。

表13 试剂盒准确度测定

结果表明饲料、麦麸及DDGS添加的回收率在91％～108％之间。

按照效果实施例1～3的方法对实施例2提供的试剂盒b做同样的检测，结果表明实施例2提供的试剂盒b同样达到标准要求。

效果实验例4

本效果实施例1采用本发明实施例1所述的试剂盒a和实施例2提供的试剂盒b。

试剂盒保存条件为2～8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、真菌毒素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果表明试剂盒在2～8℃可以保存6个月以上。

对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种真菌毒素检测数据库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

P表示Q种影响因素各取随机变量进行P次检测，P次检测中每次检测时，在Q种影响因素中随机设置至少2种影响因素，第Q种影响因素设置R’_Q种变量，各种影响因素的R’_Q种变量进行随机组合，P＝Σ(C_Q ^k)[(R’_Q)]，所述(C_Q ^k)表示在Q种影响因素中随机设置至少2种影响因素，k不小于2，(R’_Q)表示第P次检测时，选取的各影响因素的R’_Q的乘积，R’为自然数，Σ(C_Q ^k)[(R’_Q)]表示(C_Q ^k)种影响因素组合下的(R’_Q)之和。

2.如权利要求1所述的真菌毒素检测数据库的构建方法，所述步骤(1)中，所述N种真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲毒素、伏马毒素、T2毒素、棒曲霉素和展青霉素的至少一种。

3.一种真菌毒素的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.取待测真菌毒素样品，将其进行预处理和试剂盒处理，并使用酶标仪检测样品的OD值；

S2.根据待测真菌毒素的种类调用分析模块；

S3.输入OD值；

S4.调取预定程式；

S5.操作预定程式；

S6.读取检测结果；

其中，步骤S2～S5采用了真菌毒素快速检测仪，所述的真菌毒素快速检测仪包括电子数据分析终端，所述电子数据分析终端包含一计算机主机101、一显示器102，计算机主机101与显示器102电连接；计算机主机101包含分析模块103和处理模块104；将待测真菌毒素样品的OD值输入分析模块103后，处理模块104获取分析模块103传输的电子信息，处理模块104的数据处理结果在显示器102通过一图形界面得以显示；

所述真菌毒素快速检测仪还用于预存采用如权利要求1所述的真菌毒素检测数据库的构建方法所构建的数据库；

步骤S3具体包括：将所检测的标准品0吸光度值、待测样品吸光度输入其分析模块103；

步骤S4具体包括：将步骤S3输入的标准品0吸光度值、待测样品吸光度与所述预存储的数据库中的标准品0吸光度值进行比对，同时自动调用所述预存储的数据库中与试剂盒所测标准品0吸光度值一样或是最为接近的计算公式进行比对分析，得出待测样品中真菌毒素的含量。

4.如权利要求3所述的真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述预处理的具体操作为：当所述待测真菌毒素样品为水溶性固体样品或者液体样品时，直接用复溶液按比例稀释，得到待测样品溶液；当所述待测真菌毒素样品为固体样品碎化后加水振荡提取或超声提取，若溶解，直接用复溶液按比例稀释；若不溶解，取上清，用复溶液按比例稀释；得到待测样品溶液。

5.如权利要求3所述的真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述试剂盒处理具体操作为：

a-1)向真菌毒素偶联抗原包被的酶标板微孔中分别加入标准品0溶液a以及待测样品溶液20～80ul/孔，再加入酶工作液50～80ul/孔，真菌毒素抗体工作液20～80ul/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃下孵育10～60min分钟；

a-3)加入底物显色液A液，再加底物显色液B液，轻轻振荡混匀，20℃～39℃恒温箱避光显色5～30min；

a-4)每孔加入终止液a，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

6.如权利要求3所述的真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述试剂盒处理具体操作为：

b-1)向羊抗兔抗抗体包被的酶标板微孔中加入真菌毒素兔多克隆抗体工作液，用盖板膜封板，20℃～39℃恒温箱中反应30～120min，倒出孔中液体，用洗涤液b洗板4～5次，每次间隔10～30秒，用吸水纸拍干；

b-2)每孔加入碱性磷酸酯酶标记的真菌毒素抗原20～80μl，再分别加入标准品0溶液b以及样本溶液20～80μl/孔，用盖板膜封板，20℃～39℃恒温箱中反应10～30min；

b-4)加入底物显色液b，轻轻振荡混匀，20℃～39℃恒温箱避光显色10～30min；然后加入终止液b，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

7.如权利要求3所述的真菌毒素的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，每种真菌毒素对应至少一个分析模块。

8.一种真菌毒素的检测装置，其特征在于，包括电子数据分析终端，所述电子数据分析终端包含一计算机主机101、一显示器102，计算机主机101与显示器102电连接；计算机主机101包含分析模块103和处理模块104；将待检测样本的OD值输入分析模块103后，处理模块104获取分析模块103传输的电子信息，处理模块104的数据处理结果在显示器102通过一图形界面得以显示；

其中，所述真菌毒素快速检测仪还用于预存采用如权利要求1所述的真菌毒素检测数据库的构建方法所构建的数据库；

所述处理模板104还用于将获取的分析模块103传输的电子信息与真菌毒素的检测装置预存数据库中的标准品0吸光度值进行比对，同时用于自动调用所述预存储的数据库中与试剂盒所测标准品0吸光度值一样或是最为接近的计算公式进行比对分析，得出待测样品中真菌毒素的含量。

9.一种如权利要求8所述的真菌毒素的检测装置，其特征在于，还包括数据采集模块105，所述数据采集模块105与酶标仪电连接，所述数据采集模块105将酶标仪检测的吸光度值输入分析模块103。