CN104548063A - 一种免疫抑制剂在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环孢素A、他克莫司和雷帕霉素在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，所述环孢素A、他克莫司和雷帕霉素，可以有效地抑制线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5的活性。本发明还公开了所述环孢素A、他克莫司和雷帕霉素在制备抗心脏衰竭,抗帕金森综合症或抗抗炎症药物中的用途，包含所述环孢素A、他克莫司和雷帕霉素的药物对心脏衰竭，帕金森综合症或炎症具有很好的疗效。

Description

一种免疫抑制剂在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及免疫抑制剂环孢素A、他克莫司和雷帕霉素在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，以及上述三种免疫抑制剂在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

背景技术

环孢素A（英文名称Cyclosporine A，CsA）和他克莫司（英文名称Tacrolimus，FK506）为免疫抑制剂，临床上主要用于肝、肾以及心脏移植的抗排异反应，也可治疗免疫性疾病。研究表明，这两种药物结合相应蛋白（他克莫司-FKBP、环孢素A-亲环蛋白）复合物，与钙离子依赖的钙神经素/钙调节素结合可阻碍钙离子依赖的信号传导，同时降低钙神经素的丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶的活性，通过转录因子（NF-AT）的作用降低细胞因子的基因活性，抑制白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素4、肿瘤坏死因子α和干扰素γ等淋巴因子的表达，并能直接抑制白细胞介素2的基因转录，抑制钙离子依赖性T和B细胞的活化，发挥强大的免疫抑制作用。雷帕霉素（英文名称RAPA），属大环内酯类抗生素，与他克莫司的结构相似。起初雷帕霉素被研究作为低毒性的抗真菌药物，1977年发现雷帕霉素具有免疫抑制作用，1989年开始把雷帕霉素作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行试用，1999年9月，美国食品药品管理局批准将雷帕霉素作为免疫抑制剂用于肾移植。雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，雷帕霉素可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。雷帕霉素和他克莫司一样，结合在相同的免疫亲和蛋白FKBP12上，形成雷帕霉素-FKBP12复合物，这种复合物不能与钙调素结合，而且雷帕霉素并不抑制T细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成。

线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PGAM5）是磷酸甘油酸变位酶（PGAM）的家族成员，PGAM是中间代谢的进化保守的酶，在糖酵解中将3-磷酸甘油酸（3PG）转化成2-磷酸甘油酸（2PG）。2009年，Takeda等人通过研究发现，PGAM5作为一种特异性的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，通过对凋亡信号调控激酶1（apoptosis signal-regulating kinase1，ASK1）去磷酸化对其活化。2012年，Wang等人通过研究发现PGAM5在多种原因造成的细胞坏死通路中占据枢纽的作用，参与例如氧自由基的过量增长和钙离子的过度渗漏等引起的细胞坏死，然而目前尚未发现PGAM5磷酸酶的小分子抑制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前尚未发现线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5抑制剂的现状，首次提供一种免疫抑制剂环孢素A、他克莫司和雷帕霉素在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5抑制剂中的用途，以及上述三种免疫抑制剂在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种结构式如式Ⅰ所示的环孢素A在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，

其中所述结构式如式Ⅰ所示的环孢素A的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为商业购买所得。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种结构式如式Ⅰ所示的环孢素A在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

其中所述环孢素A较佳地单独作为活性成分或者与其他抗心脏衰竭,抗帕金森综合症或抗炎症药物联合作为活性成分制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种结构式如式Ⅱ所示的他克莫司在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，

其中所述他克莫司的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为商业购买所得，所述他克莫司的分子量较佳地为804.02。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：一种结构式如式Ⅱ所示的他克莫司在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

其中所述他克莫司较佳地单独作为活性成分或者与其他抗心脏衰竭,抗帕金森综合症或抗炎症药物联合作为活性成分制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五为：一种结构式如式Ⅲ所示的雷帕霉素在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，

其中所述的雷帕霉素的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为商业购买所得，所述雷帕霉素的分子量较佳地为914.18。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六为：一种结构式如式Ⅲ所示的雷帕霉素在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

本发明所述的线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶是本领域常规的一种磷酸酶，其特异地催化蛋白质底物上的丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸化，即脱磷酸。其中所述的线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶较佳地为磷酸甘油酸变位酶（PGAM）的家族成员，即线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5。

本发明所述的“炎症”较佳地为临床上常见的炎症疾病，更佳地包括淋巴结炎，肝炎或肺炎。

本发明所述的“活性成分”是指具有预防或治疗心脏衰竭，帕金森综合症或炎症功能的化合物。

本发明所述的“药物”较佳地包含生理学或药学上可接受的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、卡波姆和脂质体中的一种或多种。因此在本发明中，所述的环孢素A、他克莫司或雷帕霉素较佳地与所述药物辅料组成药物组合物。其中所述的药物组合物为本领域常规的各种药物剂型，所述药物剂型较佳地为赋形剂、填充剂或者稀释剂等，优选地为凝胶剂、乳剂、膜剂、微球和纳米球中的一种或多种。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种环孢素A、他克莫司和雷帕霉素的新用途，即上述三种化合物在制备丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，上述三种化合物能够有效抑制线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的活性。本发明还提供了环孢素A、他克莫司和雷帕霉素在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。利用含有本发明所述免疫抑制剂他克莫司、环孢素A和雷帕霉素作为活性成分制备的药物治疗心脏衰竭，帕金森综合症或各种炎症，均能获得显著的疗效。

附图说明

图1为线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PGAM5）催化5-FAM修饰的底物肽去磷酸化的化学反应方程式。

图2为环孢素A，他克莫司与雷帕霉素抑制PGAM5催化底物肽去磷酸化反应的色谱图。其中A为50μM PGAM5底物肽的荧光吸收色谱图；B为50μM PGAM5底物肽体系中加入0.37μM PGAM5蛋白，37℃反应30分钟后产物的荧光吸收色谱图；C为在反应体系中加入2.5μM他克莫司，37℃反应30分钟反应溶液的荧光吸收色谱图，D为加入2.5μM环孢素A，37℃反应30分钟反应溶液的荧光吸收色谱图，E为加入2.5μM雷帕霉素，37℃反应30分钟反应溶液的荧光吸收色谱图。

图3为PGAM5底物肽的质谱图。

图4为PGAM5催化底物肽去磷酸化反应的产物质谱图。

图5为环孢素A对PGAM5催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线。

图6为他克莫司对PGAM5催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线。

图7为雷帕霉素对PGAM5催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

选用文献（Takeda，et al，2009）中应用的底物肽RRApSVA为基础（所述底物肽的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示），委托吉尔生化(上海)有限公司合成该底物肽，并对其进行5-羧基荧光素（5-FAM）衍生，以提高检测的灵敏度，同时荧光素钠基团与肽段之间通过聚乙二醇（PEG）连接，以提高底物肽的亲水性，所得底物肽的肽段结构如结构式Ⅳ所示：

实施例中使用的环孢霉素A购自百灵威科技有限公司，产品编号：182347；他克莫司购自百灵威科技有限公司，产品编号：F370000；雷帕霉素购自百灵威科技有限公司，产品编号：948477。

配制酶反应缓冲液：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes），pH由NaOH调节至7.5，5mM1,4-二硫代苏糖醇，0.1mM乙二胺四乙酸，0.01%α-异十三烷基-ω-羟基-聚(氧-1,2-亚乙基)和2mM氯化锰（实验方法具体请参见Takeda，et al，2009），使用5μL酶反应缓冲液溶解50μM底物肽与线粒体丝氨酸/苏氨酸0.37μM PGAM5（其中所述线粒体丝氨酸/苏氨酸PGAM5的制备方法请参见文献：Zhigao Wang,Hui Jiang,She Chen,Fenghe Du,Xiaodong Wang(2012).The mitochondrial phosphatase PGAM5functions at theconvergence point of multiple necrotic death pathways.Cell148,228–243.）。

我们首先采用高效液相色谱（HPLC）-荧光检测器分离0.37μM PGAM5与50μM底物肽的反应体系并考察不存在环孢素A，他克莫司和雷帕霉素（加入0.1%二甲基亚砜作为对照）与分别在反应体系中加入2.5μM（0.1%二甲基亚砜溶解免疫抑制剂）以上三种免疫抑制剂环孢素A，他克莫司和雷帕霉素后该反应体系的差异，分离所用的仪器为Agilent1260液相色谱系统，配有UV检测器和荧光检测器；色谱柱为Agilent ZORBAX C18柱(250mm×4.6mm)；UV检测波长为214nm；荧光检测器激发波长为488nm，发射波长为520nm；进样量1μL；流速1mL/min；柱温25℃。洗脱液A和B分别为水和乙腈，两者均含0.1%三氟乙酸。梯度洗脱条件为：0-25min,17%B–32%B。

所得结果如图2所示，其中图C-图E所述的反应体系分别为向包含50μM PGAM5的底物肽和0.37μM PGAM5蛋白形成的反应体系中分别加入不同的抑制剂所形成（其中A为50μM PGAM5的底物肽的荧光吸收色谱图；B为50μM PGAM5的底物肽体系中加入0.37μM PGAM5蛋白，37℃反应30分钟后产物的荧光吸收色谱图；C为上述反应体系中加入2.5μM他克莫司，37℃反应30分钟反应溶液的荧光吸收色谱图，D为上述反应体系加入2.5μM环孢素A，37℃反应30分钟反应溶液的荧光吸收色谱图，E为上述反应体系加入2.5μM雷帕霉素，37℃反应30分钟反应溶液的荧光吸收色谱图），结果表明在包含0.37μM PGAM5蛋白与50μM底物肽的反应体系中分别加入上述三种免疫抑制剂，都可以有效抑制PGAM5对底物肽的去磷酸化反应。

为了进一步证明荧光吸收色谱图中各峰的归属，证明去磷酸化产物的生成，我们采用HPLC-MS连用的方法，检测条件为：HPLC与LCQ-Fleet离子阱质谱（Thermo Scientific,CA）偶联，所有质谱均在正离子模式下获得；喷雾电压为4.5kV；毛细管电压为33V；毛细管温度为320℃。检测结果如图3，4所示，其中图3为PGAM5的底物肽的质谱图；图4为PGAM5催化底物肽去磷酸化反应所得产物的质谱图。其中磷酸化底物肽分子离子峰理论值为1242.22，实测值为622.03(M+2H)，去磷酸化产物分子离子峰理论值为1163.52，实测值为582.05(M+2H)，上述结果表明PGAM5能够有效催化其底物肽的去磷酸化反应。

进行酶催化活性抑制研究时，需要在反应体系中分别加入不同浓度的环孢素A，他克莫司以及雷帕霉素，反应方程式如图1所示，上述三种化合物的加入浓度如表1所示：

表1环孢素A，他克莫司以及雷帕霉素的添加浓度

抑制剂	浓度(nmol/L)
		环孢素A	0.1，7.5，10，50，75，100，250，500，750
他克莫司	0.01，0.075，0.1，0.5，0.75，1，7.5，10，75，100，250
		雷帕霉素	0.01，0.075，0.1，0.75，1，5，7.5，10，50，75，100，250

实验所用仪器为P/ACE MDQ毛细管电泳仪（Beckman Coulter,CA,USA），配有激光诱导荧光检测器，氩离子激光源，激发波长488nm，发射波长520nm；数据通过装有32Karat Software的计算机采集；弹性石英毛细管柱规格为内径50μm（外径370μm）×40cm（有效柱长29.5cm）（Polymicro Technologies，AZ，USA）。如没有特殊注明，所有分析的电泳条件都为：柱温25℃，正端压力进样。

实验方法为：将新毛细管柱在30psi压力条件下用0.1M NaOH溶液处理20分钟，再分别用超纯水、背景电解质分别冲洗5分钟。每次运行间隔在30psi压力条件下以1M NaOH、超纯水、背景电解质各冲洗3分钟。样品在0.2psi条件下进样5s；分离电压为25kV；柱温维持在25℃。分离缓冲液为100mM Hepes，pH值由NaOH调节至7.5。荧光素钠为内标以校正进样量，具体实验方法请参见文献：Takeda,K.,Komuro,Y.,Hayaka wa,T.,Oguchi,H.,Ishida,Y.,Muraka mi,S.,Noguc hi,T.,Kinoshita,H.,Sekine,Y.,Iemura,S.,et al.(2009).Mitoch ondrialphosp hoglycerate mutase5uses alternatecatalytic activity as a proteinserine/threonine phosphatase to activate ASK1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA。

PGAM5的活性通过检测去磷酸化肽量来确定。通过毛细管电泳的分离和去磷酸化肽校正峰面积的测定（校正峰面积即去磷酸化肽和内标的峰面积比），可以定量测定PGAM5的活性。对于抑制活性研究或抑制剂筛选，将纳摩尔至微摩尔浓度免疫抑制剂环孢素A，他克莫司以及雷帕霉素分别加入到反应溶液中，上述三种化合物的抑制活性可以通过与空白对照（即不加入免疫抑制剂）相比，根据去磷酸化肽峰面积的减少来确定，上述三种化合物的抑制百分比可以通过以下公式计算：

$I\%=100-(\frac{A_x}{A_o}\×100).$

其中，I%是抑制百分数；A_x和A_o分别是加入抑制剂和不加任何抑制剂时的去磷酸化肽峰面积，取抑制作用百分比为50%时所对应的抑制剂浓度得到的半抑制浓度即抑制剂的IC₅₀值。

经检验确定，当PGAM5的底物肽浓度为4μM时，PGAM5浓度在0.1-0.5U/μL内，孵育时间在0-10分钟内，产物生成量与孵育时间成正比关系。最终选定反应体系为：PGAM5的底物肽的浓度为4μM，PGAM5的浓度为0.3U/L，孵育时间为5分钟，在底物的转化率不超过20%条件进行以下的酶抑制剂筛选工作。

按照表1所示，将不同浓度的环孢素A，他克莫司以及雷帕霉素分别加入到上述反应体系中进行酶促反应（反应体系中PGAM5的底物肽的浓度为4μM，PGAM5的浓度为0.3U/L，孵育时间为5分钟），按照上述毛细管电泳法检测三种免疫抑制剂环孢素A，他克莫司以及雷帕霉素针对PGAM5活性的抑制百分比，检测结果分别如表2，表3和表4所示。

表2不同浓度的环孢素A对PGAM5活性抑制百分比

表3不同浓度的他克莫司对PGAM5活性抑制百分比

表4不同浓度的雷帕霉素对PGAM5活性抑制百分比

将所得三种免疫抑制剂环孢素A，他克莫司以及雷帕霉素的抑制百分比结果，利用通用型数据处理软件Origin8.0非线性拟合方法进行处理，得到了环孢素A，他克莫司和雷帕霉素对PGAM5的抑制曲线，其中环孢素A对PGAM5催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线如图5所示，他克莫司对PGAM5催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线如图6所示，雷帕霉素对PGAM5催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线如图7所示。

根据上述检测结果和抑制曲线，计算出上述三种免疫抑制剂的半抑制浓度IC₅₀值分别为：环孢素A的IC₅₀值是52nM，他克莫司的IC₅₀值是2.6nM，雷帕霉素的IC₅₀值是6.4nM，所得实验结果说明以上三种免疫抑制剂环孢素A，他克莫司和雷帕霉素都可以有效地抑制线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5的对底物肽的去磷酸化活性，上述免疫抑制剂都具有极强的线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5抑制活性，都能够用于制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5的抑制剂。

应理解，以上实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种结构式如式Ⅰ所示的环孢素A在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，

2.一种结构式如式Ⅰ所示的环孢素A在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途，

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的环孢素A作为单一活性成分或者与其他抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物联合作为活性成分在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

4.一种结构式如式Ⅱ所示的他克莫司在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，

5.一种结构式如式Ⅱ所示的他克莫司在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途，

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的他克莫司作为单一活性成分或者与其他抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物联合作为活性成分在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

7.一种结构式如式Ⅲ所示的雷帕霉素在制备线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂中的用途，

8.一种结构式如式Ⅲ所示的雷帕霉素在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途，

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的雷帕霉素作为单一活性成分或者与其他抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物联合作为活性成分在制备抗心脏衰竭，抗帕金森综合症或抗炎症药物中的用途。

10.如权利要求2、3、5、6、8或9任一项所述的用途，其特征在于，其中所述炎症为淋巴结炎，肝炎或肺炎。