CN104546203A - 一种经盲肠系膜三角建立的小鼠结肠癌原位种植模型及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种经盲肠系膜三角建立的小鼠结肠癌原位种植模型及其方法，包括将结肠癌细胞悬液注射到麻醉小鼠的盲肠系膜三角内，使肿瘤细胞沿着盲肠体部肠系膜附着处顺盲肠轴向分布生长。本发明结肠癌原位荷瘤模型的肿瘤接种部位在盲肠系膜三角，该局部有盲肠系膜动脉，血供丰富，肿瘤易于生长；该处肠壁无浆膜，使结肠癌细胞易于种植生长，接种的肿瘤细胞直接接触盲肠壁，是结肠原位成瘤；盲肠肠腔宽大，且注射后形成的水泡沿盲肠系膜附着处分布，最终形成的肿瘤沿盲肠轴位分布，短期内不易发生肠腔梗阻导致小鼠死亡；通过注射肿瘤细胞悬液建立荷瘤模型，易于控制肿瘤细胞注射剂量，肿瘤形成均一度好。

Description

一种经盲肠系膜三角建立的小鼠结肠癌原位种植模型及其方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种接种于盲肠系膜三角的小鼠结肠癌原位荷瘤模型及其建立方法。

背景技术

结肠癌是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。远处转移和浸润性生长是人类结肠癌致死的主要原因，现代研究通过对患结肠癌死亡的患者进行尸检证实，其中约60％-70％的患者存在肝脏转移。因此，建立一种易于观察、生物学行为更为接近于临床表现的结肠癌肝转移动物模型，对于了解结肠癌生长、演进、转移的过程及正确评价各种治疗方案的疗效等都具有重要意义。

目前，常用于建立小鼠结肠癌模型的方法包括自发及原位诱发小鼠结肠癌模型和移植性小鼠结肠癌模型，后者根据移植物分为细胞移植和组织移植，根据部位的不同，又可分为皮下移植、肝脏移植和原位移植。现有技术的结肠癌小鼠模型要么制备周期长、成瘤均一度差；要么未能完全模拟自然转移过程、并发症多；要么制备操作复杂、成功率较低、模型不稳定。由于小鼠肠壁菲薄纤细，注射针极易刺穿肠壁，致使结肠壁原位注射手术难度较大，或者因为刺穿肠壁，导致肿瘤接种失败，或者由于漏液造成肠外腹腔多处种植。即使成功致瘤，也易于出现因接种部位肿瘤组织呈团块状生长过大，造成肠腔梗阻，导致小鼠死亡。

因此，有必要继续改进小鼠结肠癌小鼠模型的制备方法。为了解决上述问题，本发明由此而来。

发明内容

本发明要解决的技术问题针对现有结肠癌建立模型周期长、不稳定的缺陷，提供一种高转移、高浸润、稳定的小鼠结肠癌原位种植模型的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种经盲肠系膜三角建立小鼠结肠癌原位种植模型的方法，包括以下步骤：

(1)制备、培养结肠癌细胞悬液，

(2)将小鼠麻醉后，无创固定在手术台上，手术切开腹部曝露盲肠，在盲肠体部顺盲肠轴位进针至盲肠系膜三角，回抽无血后，缓慢注射结肠癌细胞悬液，退针后轻轻按压注射部位，确定无注射液渗出，

(3)缝合小鼠腹膜和腹壁肌肉层，最后缝合皮肤，令其自然生长并观察。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(1)中的结肠癌细胞悬液的浓度为(2.5±0.5)×10⁷个/ml，每只小鼠注射20～50μl。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(2)中所用的注射针头规格为不大于0.4×13mm。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(2)中的注射部位为盲肠系膜三角，注射后，结肠癌细胞悬液分布于盲肠系膜附着处，部分液体可扩散至盲肠系膜附着处两侧的浆膜下。

本发明的优选技术方案中，所述小鼠形成结肠癌肿块后，位于盲肠系膜一侧，肿块沿盲肠轴位分布，短期内不易发生肠腔梗阻导致小鼠死亡。

本发明的优选技术方案中，所述小鼠形成结肠癌肿块后，位于盲肠系膜一侧，易于侵犯肠系膜血管和淋巴管，远处转移发生率高。

本发明的优选技术方案中，所述小鼠不必进行禁食禁水肠道准备。

本发明的第二方面，提供一种前述方法得到的经盲肠系膜三角建立的小鼠结肠癌原位种植模型。

在人体解剖学概念中，血管、淋巴管和神经进出肠壁的部位称为系膜缘，系膜缘处的肠壁与两层腹膜围成肠系膜三角，此处肠壁无浆膜覆盖。对应于人体解剖学概念的“系膜缘”，在小鼠解剖学上称为“肠系膜附着处”，小鼠解剖学上没有“系膜三角”的概念，为表述方便，本文将小鼠盲肠系膜附着处的肠壁与两层腹膜围成的三角形区域定义为“盲肠系膜三角”，此处肠壁无浆膜覆盖，有血管、淋巴管和神经在此处进出(图1)。盲肠系膜三角横截面呈三角形，组织间隙相对宽松，在此处进行注射操作，进针方便，易于掌握。本研究即尝试在“盲肠系膜三角”注射肿瘤细胞悬液用于制备小鼠结肠癌原位种植及肝转移模型。

本发明结肠癌原位荷瘤模型的制备方法的优点：

(1)在盲肠系膜三角，作为肿瘤建立区域，该局部有盲肠系膜动脉，血供丰富，肿瘤易于生长；

(2)盲肠系膜三角处肠壁无浆膜覆盖，使结肠癌细胞易于种植生长，接种的肿瘤细胞直接接触盲肠壁，是真正的结肠原位成瘤；

(3)本发明的方法接种于盲肠部位，该处肠腔宽大，注射后形成的水泡沿盲肠系膜附着处呈条带状分布，张力小，不易发生渗漏，最终形成的肿瘤位于盲肠系膜一侧，沿盲肠轴位分布，加之盲肠肠腔宽大，短期内不易发生因肠腔梗阻导致的小鼠死亡；

(4)本发明的方法通过注射肿瘤细胞悬液建立模型，易于控制肿瘤细胞注射剂量，肿瘤形成均一度好，有利于后继实验的开展；

(5)盲肠系膜动、静脉和淋巴管在盲肠系膜三角进出肠壁，血供丰富，血液回流于门静脉系统，该部位肿瘤较易于侵犯肠系膜血管和淋巴管，使结肠癌易于发生远处转移，尤其是肝转移发生率高，其转移路径符合人结肠癌转移特点，能完全模拟结肠癌自然转移发生过程；

(6)本发明的方法，实验小鼠不必进行禁食禁水等肠道准备，手术时程短，手术风险小，对小鼠的创伤小，不易损伤结肠壁，手术操作简单，穿刺注射容易，整套技术易于掌握，建模成功率高，实用性强；

(7)本发明的方法所建立的小鼠结肠癌原位种植模型将在结肠癌的发生、发展及转移机制研究，抗结肠癌药物的研发，结肠癌的预防等方面发挥一定的价值。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1A，1B为盲肠系膜三角结构示意图，其中1为盲肠，2为盲肠系膜三角，为本发明的注射区域，3为浆膜，4为肠系膜血管；图1B为1A的横切面结构。

图2为本发明的经小鼠盲肠系膜三角注射结肠癌肿瘤细胞悬液(含1％台盼蓝，起示踪作用)的手术过程：

图2A，小鼠经10％水合氯醛麻醉后，无创固定在手术台上。红色虑线示手术切口位置。

图2B，曝露盲肠，可见内含大量肠内容物。蓝色箭头示盲肠系膜；

图2C，将结肠癌肿瘤细胞悬液(50μl)在盲肠体部顺盲肠轴位注射至盲肠系膜三角(针头规格：0.4×13mm)，黄色箭头示进针位置；

图2D，注射的结肠癌肿瘤细胞悬液分布于小鼠盲肠系膜附着处，部分液体扩散至盲肠系膜附着处两侧的浆膜下(白色箭头示蓝黑色区域)。

图2E，缝合腹膜和腹壁肌肉层。

图2F，缝合皮肤。

图3为结肠癌原位肿瘤形成和器官转移情况：

图3A显示结肠原位荷瘤小鼠腹腔内含大量暗红色血性腹水；

图3B显示曝露腹腔，#：肓肠，*：肿瘤；

图3C显示结肠癌肝转移灶(黄色箭头示)，图C为图B的局部放大；

图3D显示结肠癌横膈转移灶(白色箭头示)；

图3E为离体的部分消化道和肿瘤，#：肓肠，*：肿瘤。

图3F为小肠系膜淋巴结转移(蓝色箭头示)；图2F为图2E的局部放大。

图3G显示脾脏肿大，出现结肠癌转移灶。

图4A，4B为本发明建立得到的小鼠结肠癌原位荷瘤模型一实施例的超声检查结果。

图5A，5B，5C为本发明建立得到的小鼠结肠癌原位荷瘤模型MRI检查结果图。

图6为本发明建立得到的小鼠结肠癌原位荷瘤模型一实施例的病理组织学检查图像。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所详细描述的本发明。

实验材料及仪器：

小鼠结肠癌细胞株CT26.WT购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，SPF级8周龄BALB/c小鼠购于南通大学实验动物中心，雌雄各半，体重20±2.5g。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。7.0T Micro-MRI(PharmaScan，Brukers，Germany)

实施例1：经盲肠系膜三角制备小鼠结肠癌原位荷瘤模型的方法

1.1CT26.WT细胞悬液的制备

常规细胞培养，将CT26.WT细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养。取指数生长期的细胞，用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化，机械吹打成细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpm离心8min，弃上清液，PBS洗涤2次，细胞沉淀加适量生理盐水重悬，台盼蓝染色测定细胞活力＞95％，调整细胞浓度至2.5×10⁷/ml，冰浴保存备用。

1.2小鼠经10％水合氯醛(0.05ml/g)腹腔注射麻醉后，取仰卧位，用胶带将小鼠四肢无创固定在手术台上。安尔碘腹部皮肤消毒后，在腹部正中线偏左侧垂直手术切口1cm，逐层切开皮肤、肌肉和腹膜，将盲肠拖出。在盲肠体部顺盲肠轴位进针至盲肠系膜三角(针头规格：0.4×13mm)，回抽无血后，缓慢注射肿瘤细胞悬液(50μl)，退针后轻轻按压注射部位，确定无注射液渗出后，逐层缝合腹膜、腹壁肌肉层和皮肤。伤口再次消毒后，将小鼠移至IVC系统自然恢复，自由进食及饮水(图2)。连续观察21天。可以用腹部触诊法监测肿瘤的生长情况，以食指指腹轻柔触诊，可扪及肿块。

1.3结果

20只BALB/c小鼠经盲肠系膜三角注射肿瘤细胞悬液制备小鼠结肠癌原位种植模型的成瘤率为100％(20/20)。在整个实验过程中(25天)，所有荷瘤小鼠均生长良好，未出现肠梗阻现象，无小鼠死亡。在接受手术15天后，于小鼠腹部可触及小硬节，以后逐渐增大。至实验结束时，腹部触诊可明显扪及肿块。

当荷瘤小鼠出现明显消瘦，弓背，精神萎靡等衰竭体征时将实验鼠处死，解剖原位移植模型，观察原位肿瘤生长情况，腹腔脏器转移情况及淋巴结转移情况，如图3所示。

实施例2：小鼠结肠癌的超声检查

2.1方法

小鼠接受手术后25天，用高频超声观察盲肠接种部位有无异常回声区，并记录异常肿块的回声类型、形态和大小等。

2.2结果

应用高频超声观察盲肠接种部位，腹腔内出现低回声团块影，最大径介于6.1～14.5mm，平均(9.1±0.4)mm，检测结果如图4所示。

实施例3：小鼠结肠癌的MRI检查

3.1方法

原位结肠癌肿瘤小鼠经异氟烷气体麻醉后固定于扫描床上，使用38mm大鼠体部线圈。。MR成像采用7.0T Micro-MRI(Pharma Scan,Bruker,Germany,东南大学江苏省分子影像与功能影像重点实验室提供)，成像序列及参数如下：MSME-T2WI序列：TR 2400ms，TE16.1ms，层厚2mm，FOV3.0cm×3.0cm，矩阵256×256，成像时间约3分20秒。

3.2结果

T2WI像示小鼠盲肠部位见约1.7×0.8cm椭圆形稍高信号肿块影，信号不均匀，内见小片状稍低信号影，病灶境界部分欠清晰(图5)。

实施例4：病理组织学检查

4.1方法

将实施例1方法得到模型的小鼠结肠癌肿瘤组织放入4％甲醛溶液中过夜固定，经80％、90％、100％乙醇和正丁醇脱水后，置于60℃蜡盒内浸蜡包埋，切片后行苏木紫—伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，封片后在光学显微镜下观察。

4.2结果

经盲肠系膜三角注射肿瘤细胞悬液制备的小鼠结肠癌原位种植模型，其瘤灶较易剥离，与周围组织分界较清。分离的肿瘤表面尚光滑，呈多个结节状突起，整体呈粉红色，质地较韧。瘤灶局部表面可见破溃、糜烂。切面为灰白色，可见坏死灶，血供较丰富。镜下可见小鼠盲肠原位移植瘤细胞异型性明显，核大，深染，细胞大小不等，形态不规则，有病理性核分裂像，保持了原接种癌细胞的特点(图6)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.一种经盲肠系膜三角建立小鼠结肠癌原位种植模型的方法，包括以下步骤：

(1)制备、培养结肠癌细胞悬液；

(2)将小鼠麻醉后，无创固定在手术台上，手术切开腹部曝露盲肠，在盲肠体部顺盲肠轴位进针至盲肠系膜三角，回抽无血后，缓慢注射结肠癌细胞悬液，退针后轻轻按压注射部位，确定无注射液渗出。

(3)缝合小鼠腹膜和腹壁肌肉层，最后缝合皮肤，令其自然生长并观察。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的结肠癌细胞悬液的浓度为(2.5±0.5)×10⁷个/ml，每只小鼠注射20～50μl。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所用的注射针头规格为不大于0.4×13mm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的注射部位为盲肠系膜三角，注射后，结肠癌细胞悬液分布于盲肠系膜附着处，部分液体可扩散至盲肠系膜附着处两侧的浆膜下。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠形成结肠癌肿块后，位于盲肠系膜一侧，肿块沿盲肠轴位分布，短期内不易发生肠腔梗阻导致小鼠死亡。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠形成结肠癌肿块后，位于盲肠系膜一侧，易于侵犯肠系膜血管和淋巴管，远处转移发生率高。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠不必进行禁食禁水肠道准备。

8.一种权利要求1-7任一项所述的方法得到的经盲肠系膜三角建立小鼠结肠癌原位种植模型。