CN104527254B - 一种在材料表面打印双蛋白复合微图案的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在材料表面打印双蛋白复合微图案的方法。选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为基底，通过微转移模塑法在表面得到规则的微图案。将第一种蛋白(例如Collagen)沉积在具有微图案的PDMS表面，干燥后用表面plasma处理过后的PDMS平模板接触转移走PDMS基底伤凸起微图案处的胶原蛋白。再以微接触打印法将第二种蛋白(例如Fibronectin，FN)打印到PDMS基底的凸起微图案处。最终制得材料表面形状规则的双种不同蛋白的复合微图案。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及的是一种在材料表面打印双蛋白复合微图案的方法。
背景技术
细胞的生长，分化与其所处的生理环境密切相关。在体内，细胞外基质以及相邻细胞的分布与排列使得细胞的生长具有很强的导向性，这种来自环境的信号在诸如血管、骨骼、神经等组织的再生中有极为重要的意义。而在体外，细胞的生长则依赋于材料的属性。近来科研进展表明，多种细胞可以响应材料在微米尺寸的几何结构以及成分分布。理想的生物兼容性材料应当可以针对性地参与组织修复与再生，可以实现特定细胞的黏附及相关生长因子的选择性相互作用。此种材料将作为可植入材料在组织工程及医疗修复领域发挥重要作用。
为了能使生物分子能在基底材料上规则地分布，就需要通过微加工手段在基底表面构筑微图案，最终达到引导相关细胞定位黏附及定向生长的目的。哈佛大学Whitesides教授研究小组发明的″软刻蚀″技术能在多种材料表面上实现微图案化。将软刻蚀技术中的微接触打印与生物分子吸附技术相结合，通过对表面生物分子的吸附沉积过程加以控制，已经研究出了许多在基底表面实现蛋白质的图案化的工艺方法。然而，目前的研究多局限于单一种类的蛋白质图案化，虽然尚有一些实现复合微图案即将两种或多种类型的分子共同结合在同一块基底上，这些方法也都难以实现不同类型的分子严格的区域化分布，从而难以满足生物工程中日趋复杂的结构生长需求。
发明内容
本发明内容鉴于现有技术的以上缺点，目的是提供一种在材料表面制备两种蛋白质的复合微图案的方法，即采用微接触打印，微转移技术以及表面吸附沉积相结合的方法，制备胶原蛋白/纤连蛋白复合微图案，实现再微米尺度上的图案化分布。
本发明的技术方案如下：
一种在材料表面打印双蛋白复合微图案的方法，包括如下步骤：
(1)具有凹凸微结构的PDMS基底的制备；
(2)两种蛋白溶液的配制；
(3)微图案的打印：用步骤(2)得到的第一种蛋白溶液浸泡步骤(1)得到的带有凹凸微结构的PDMS基底，使得PDMS基底上均匀附着第一种蛋白，之后去除多余溶液，以PBS溶液清洗两次，再以氮气吹干；
(4)PDMS平印章的制备：分别按两种质量比例充分混合PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面平整的硅模版上；于65℃下固化4小时后将固化物从硅模板上剥离得到两种PDMS平印章。
(5)将步骤(4)得到的第一种PDMS平印章通过plasma做亲水性处理，再将印章反扣在步骤(3)得到的打印有微图案的PDMS基底上，使得PDMS基底凸起部分的第一种蛋白被印章转移走，PDMS基底仅在凹下部分表面附着有第一种蛋白；
(6)将步骤(4)得到的第二种PDMS平印章浸泡在步骤(2)得到的第二种蛋白溶液中，静置半小时，之后以氮气吹干，再以此印章反扣在(5)得到的只有凹下部分表面附着第一种蛋白的PDMS基底上，保持紧密接触后剥离，使得PDMS基底凸起部分均匀打印上第二种蛋白，得到PDMS表面形状规则的双种蛋白质复合微图案。
优选的，所述步骤(1)的具体方法为：按质量比10∶1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面具有微米尺寸凹凸微结构的SU-8光刻胶模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从SU-8模板上剥离得到具有凹凸微结构的PDMS基底；SU-8模板采用光刻方法将设计好的图形在SU8光刻胶上曝光，然后采用显影液进行显影，控制显影时间，使未曝光的SU8光刻胶部分去除；然后将其置于烘箱内进行烘烤，使曝光区域的SU8完全固化后所得。
优选的，所述步骤(2)的具体方法为：Collagen和FN两种蛋白分别溶于磷酸缓冲盐溶液PBS中，配制成50μg/ml Collagen和FN溶液。
优选的，以胶原蛋白Collagen和纤连蛋白FN为原料通过分次微接触打印使Collagen和FN两种蛋白在聚二甲基硅氧烷PDMS基底表面得到规则复合微图案，具体包括以下步骤：
(1)具有凹凸微结构的PDMS基底的制备：按质量比10∶1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面具有微米尺寸凹凸微结构的SU-8光刻胶模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从SU-8模板上剥离得到具有凹凸微结构的PDMS基底。SU-8模板采用光刻方法将设计好的图形在SU8光刻胶上曝光，然后采用显影液进行显影，控制显影时间，使未曝光的SU8光刻胶部分去除；然后将其置于烘箱内进行烘烤，使曝光区域的SU8完全固化后所得；
(2)溶液的配制：Collagen和FN两种蛋白分别溶于磷酸缓冲盐溶液PBS中，配制成50μg/ml Collagen和FN溶液；
(3)微图案的打印：用步骤(2)得到的Collagen溶液浸泡步骤(1)得到的带有凹凸微结构的PDMS基底，静置半小时，使得PDMS基底上均匀附着Collagen，之后去除多余溶液，以PBS溶液清洗两次，再以氮气吹干；由于PDMS基底的凹凸结构有5μm左右的落差，而附着的collagen蛋白厚度不足1μm，所以此时附着Collagen蛋白后的PDMS基底仍呈现凹凸微结构；
(4)PDMS平印章的制备：分别按质量比20∶1和5∶1的比例充分混合PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面平整的硅模版上；于65℃下固化4小时后将固化物从硅模板上剥离得到PDMS平印章；
(5)将步骤(4)得到的质量比20∶1的PDMS平印章通过plasma做亲水性处理，再将印章反扣在步骤(3)得到的打印有微图案的PDMS基底上，保持紧密接触30秒后剥离，使得PDMS基底凸起部分的Collagen被印章转移走，PDMS基底仅在凹下部分表面附着有Collagen；
(6)将步骤(4)得到质量比5∶1的PDMS平印章浸泡在步骤(2)得到的FN溶液中，静置半小时，之后以氮气吹干，再以此印章反扣在(5)得到的只有凹下部分表面附着Collagen的PDMS基底上，保持紧密接触30秒后剥离，使得PDMS基底凸起部分均匀打印上FN，得到PDMS表面形状规则的双种蛋白质复合微图案。
与现有技术相比，本发明方法克服了现有技术的缺点，以简易有效的方法在材料表面实现双种蛋白的均匀规则分布，且几何尺寸上精确到微米级。其有益效果具体表现为：
首先，本发明在材料表面制备了胶原蛋白与纤连蛋白两种蛋白的复合微图案，该方法可以拓展到任意组合的两种蛋白或生物分子，制备的材料表面具备良好生物相容性。
其次，本发明方法实现了两种蛋白共同有规则地吸附在同一材料表面，在微观尺度上实现了两种蛋白的复合，从而精确定位细胞黏附及调控细胞生长。
最后，微图案的几何形状及尺寸大小可以按照需要灵活调整，制备工艺上简单易行，步骤少成本低，能有效运用于各种微米级的人体组织中。
附图说明
图1 PDMS基底上胶原蛋白/纤连蛋白复合微图案的制备流程示意图；
图2本发明实施例PDMS基底上胶原蛋白/纤连蛋白复合微图案的荧光显微镜图；
图3本发明实施例PDMS基底上胶原蛋白/纤连蛋白复合微图案的荧光显微镜侧视图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
一种材料表面打印双蛋白复合微图案的方法，以胶原蛋白Collagen和纤连蛋白FN为原料通过分次微接触打印使Collagen和FN两种蛋白在聚二甲基硅氧烷PDMS基底表面得到规则复合微图案，包括如下步骤(参考图1)：
(1)具有凹凸微结构的PDMS基底的制备：按质量比10∶1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面具有微米尺寸凹凸微结构的SU-8光刻胶模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从SU-8模板上剥离得到具有凹凸微结构的PDMS基底。SU-8模板采用光刻方法将设计好的图形在SU8光刻胶上曝光，然后采用显影液进行显影，控制显影时间，使未曝光的SU8光刻胶部分去除；然后将其置于烘箱内进行烘烤，使曝光区域的SU8完全固化后所得。
(2)溶液的配制：Collagen和FN两种蛋白分别溶于磷酸缓冲盐溶液PBS中，配制成50μg/ml Collagen和FN溶液；然后分别用Cy5荧光燃料和Alexa Fluor 488-FITC荧光燃料标记Collagen和FN溶液(注：荧光染料的标记已达到可以用颜色区别不同种蛋白的目的，实际应用中可以不以荧光染料标记)。
(3)微图案的打印：用步骤(2)得到的Collagen溶液浸泡步骤(1)得到的带有凹凸微结构的PDMS基底，静置半小时，使得PDMS基底上均匀附着Collagen，之后去除多余溶液，以PBS溶液清洗两次，再以氮气吹干(由于PDMS基底的凹凸结构有5μm左右的落差，而附着的collagen蛋白厚度不足1μm，所以此时附着Collagen蛋白后的PDMS基底仍呈现凹凸微结构)。
(4)PDMS平印章的制备：分别按质量比20∶1和5∶1的比例充分混合PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面平整的硅模版上；于65℃下固化4小时后将固化物从硅模板上剥离得到PDMS平印章。
(5)将步骤(4)得到的质量比20∶1的PDMS平印章通过plasma做亲水性处理，再将印章反扣在步骤(3)得到的打印有微图案的PDMS基底上，保持紧密接触30秒后剥离，使得PDMS基底凸起部分的Collagen被印章转移走，PDMS基底仅在凹下部分表面附着有Collagen。
(6)将步骤(4)得到质量比5∶1的PDMS平印章浸泡在步骤(2)得到的FN溶液中，静置半小时，之后以氮气吹干，再以此印章反扣在(5)得到的只有凹下部分表面附着Collagen的PDMS基底上，保持紧密接触30秒后剥离，使得PDMS基底凸起部分均匀打印上FN。得到PDMS表面形状规则的双种蛋白质复合微图案。这种蛋白复合微图案实际构筑了细胞外基质在微米尺寸的几何结构以及成分分布，这对于在该种基底上生长的细胞具有很强的导向性，这种来自环境的信号对多细胞构筑的组织的再生有着显著的意义。配合诸如水凝胶之类的生物兼容性材料，这种复合微图案应当可以针对性地参与组织修复与再生，可以实现特定细胞的黏附、生长及相关生长因子的选择性相互作用。从而为可植入材料在组织工程及医疗修复领域中奠定基础。
图2本发明实施例PDMS基底上胶原蛋白/纤连蛋白复合微图案的荧光显微镜图；图中可以看到在PDMS基底凹下部位附着红色荧光标记的Collagen蛋白(图中数字标记1)，而凸起部位则附着绿色荧光标记的FN蛋白(图中数字标记2)，两种蛋白在俯视图中呈现规则的交替排列，图中比例尺：20μm；
图3本发明实施例PDMS基底上胶原蛋白/纤连蛋白复合微图案的荧光显微镜侧视图。图中可以看到红色荧光标记的Collagen蛋白(图中数字标记1)与绿色荧光标记的FN蛋白(图中数字标记2)呈现规则的交替排列，图中比例尺：20μm。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种在材料表面打印双蛋白复合微图案的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)具有凹凸微结构的PDMS基底的制备；
(2)两种蛋白溶液的配制；
(3)微图案的打印：用步骤(2)得到的第一种蛋白溶液浸泡步骤(1)得到的带有凹凸微结构的PDMS基底，使得PDMS基底上均匀附着第一种蛋白，之后去除多余溶液，以PBS溶液清洗两次，再以氮气吹干；
(4)PDMS平印章的制备：分别按两种质量比例充分混合PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面平整的硅模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从硅模板上剥离得到两种PDMS平印章；
(5)将步骤(4)得到的第一种PDMS平印章通过plasma做亲水性处理，再将印章反扣在步骤(3)得到的打印有微图案的PDMS基底上，使得PDMS基底凸起部分的第一种蛋白被印章转移走，PDMS基底仅在凹下部分表面附着有第一种蛋白；
(6)将步骤(4)得到的第二种PDMS平印章浸泡在步骤(2)得到的第二种蛋白溶液中，静置半小时，之后以氮气吹干，再以此印章反扣在步骤(5)得到的只有凹下部分表面附着第一种蛋白的PDMS基底上，保持紧密接触后剥离，使得PDMS基底凸起部分均匀打印上第二种蛋白，得到PDMS表面形状规则的双种蛋白质复合微图案。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体方法为：按质量比10∶1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面具有微米尺寸凹凸微结构的SU-8光刻胶模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从SU-8光刻胶模板上剥离得到具有凹凸微结构的PDMS基底；SU-8光刻胶模板采用光刻方法将设计好的图形在SU-8光刻胶上曝光，然后采用显影液进行显影，控制显影时间，使未曝光的SU-8光刻胶部分去除；然后将其置于烘箱内进行烘烤，使曝光区域的SU-8光刻胶完全固化后所得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体方法为：Collagen和FN两种蛋白分别溶于磷酸缓冲盐溶液PBS中，配制成50μg/ml Collagen和FN溶液。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，以胶原蛋白Collagen和纤连蛋白FN为原料通过分次微接触打印使Collagen和FN两种蛋白在聚二甲基硅氧烷PDMS基底表面得到规则复合微图案，具体包括以下步骤：
(1)具有凹凸微结构的PDMS基底的制备：按质量比10∶1的比例充分混合聚二甲基硅氧烷PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面具有微米尺寸凹凸微结构的SU-8光刻胶模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从SU-8模板上剥离得到具有凹凸微结构的PDMS基底；SU-8光刻胶模板采用光刻方法将设计好的图形在SU-8光刻胶上曝光，然后采用显影液进行显影，控制显影时间，使未曝光的SU-8光刻胶部分去除；然后将其置于烘箱内进行烘烤，使曝光区域的SU-8光刻胶完全固化后所得；
(2)溶液的配制：Collagen和FN两种蛋白分别溶于磷酸缓冲盐溶液PBS中，配制成50μg/ml Collagen和FN溶液；
(3)微图案的打印：用步骤(2)得到的Collagen溶液浸泡步骤(1)得到的带有凹凸微结构的PDMS基底，静置半小时，使得PDMS基底上均匀附着Collagen，之后去除多余溶液，以PBS溶液清洗两次，再以氮气吹干；由于PDMS基底的凹凸结构有5μm左右的落差，而附着的collagen蛋白厚度不足1μm，所以此时附着Collagen蛋白后的PDMS基底仍呈现凹凸微结构；
(4)PDMS平印章的制备：分别按质量比20∶1和5∶1的比例充分混合PDMS与硅橡胶固化剂，所得混合物浇铸在表面平整的硅模板上；于65℃下固化4小时后将固化物从硅模板上剥离得到PDMS平印章；
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(6)将步骤(4)得到质量比5∶1的PDMS平印章浸泡在步骤(2)得到的FN溶液中，静置半小时，之后以氮气吹干，再以此印章反扣在步骤(5)得到的只有凹下部分表面附着Collagen的PDMS基底上，保持紧密接触30秒后剥离，使得PDMS基底凸起部分均匀打印上FN，得到PDMS表面形状规则的双种蛋白质复合微图案。
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