CN104519909A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

适于向人类施用的包含以下抗原中的至少两种或更多种的疫苗组合物：DTap-HEV-HepB-HPV。公开了适于相伴施用的这些抗原的组合的若干变化。公开了制备疫苗组合物的方法。提供了编码抗原的核酸，及其制备方法和用途。

Description

疫苗组合物
技术领域
本发明涉及组合疫苗及其用途。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)感染的发病率在发展中国家是高的。根据2010年6月WHO/ICO HPV信息中心的报告，在印度，每年报告超过134,000个新增病例和接近74,000例由宫颈癌引起的死亡。
在印度，在女性中的癌症病例中，特别是在15-44岁的年龄组中，宫颈癌和乳腺癌是最常见的。一般人群中约7.9％的女性患HPV感染，且浸润性宫颈癌的大部分发病率是由HPV16和HPV18引起的。与其他HPV基因型的混合感染是普遍的。针对多种基因型提供广谱保护效力的候选疫苗是有效的HPV疫苗接种的前行之路。使用L1衣壳蛋白的HPV疫苗对HPV16、HPV18、HPV6和HPV11是类型特异性的，而不能向由也与HPV感染向宫颈癌的演变相关的其他基因型，例如HPV31、HPV35、HPV52、HPV58等引起的感染提供完全的保护。至今还没有针对多种HPV基因型的感染提供交叉保护的市售可得的HPV疫苗。包括重组HPV L1病毒样颗粒(VLP)的两种预防性疫苗已被许可。它们仅针对约15种已知致癌HPV类型中的两种。接近70％的宫颈癌病例是由HPV16和HPV18引起的，并且存在对于针对其他密切相关的HPV基因型的一定程度的交叉保护的证据。开发广谱保护性HPV疫苗的其他途径包括使用至少九种HPV致癌病毒的L1衣壳蛋白的多价疫苗，该方法具有无附加成本的优势，且因此这些疫苗的成本会妨碍其持续的全球运送，特别是在HPV感染的发病率高的第三世界国家中。其他途径已使用与HPV L2衣壳蛋白组合的HPV L1抗原，这些抗原具有广谱中和表位(broadly neutralizing epitope)。然而，L2衣壳蛋白自身免疫性差，使将来源于L2蛋白的表位结合HPV L1衣壳蛋白，或结合其他具有装配成病毒样颗粒(VLP)的能力的病毒抗原的替代策略成为必需。该嵌合体的设计原理是用于增加VLP骨架上异源肽的表位密度，从而增加其免疫原性。PCT/IN2009/000333已经描述了装配成病毒样颗粒(VLP)的HPV16 L2表位与HbsAg(乙肝表面抗原)的嵌合构建体。
戊型肝炎病毒(HEV)是引起地方性肝炎以及分散性急性肝炎的肠道传播病毒。感染HEV的人表现出广泛的临床特征谱(clinical spectrum)，从无症状感染到爆发性肝炎变化。伴随黄疸、高烧、肝肿大和瘙痒戊型肝炎病毒的临床特征与其他嗜肝病毒引起的急性病毒性肝炎的临床特征相似。病毒感染通常通过实验室发现升高的血清胆红素、肝脏酶的增加和碱性磷酸酶活性的轻度增加来诊断。在发展中国家HEV的发病率是高的(Emerson和Purcell,2007；Chandra等,2008)。在发展中国家HEV是分散性爆发性肝衰竭(FHF)的重要发病原因(Nanda等，1994)。HEV感染占急性病毒肝炎病例的大于50％，在一般人群中具有0.2％至4％的致死率(case fatality)并且在孕妇中，尤其是在怀孕的晚期妊娠(third trimester)期间具有高达20％的致死率(Guu等,2009)。爆发性肝衰竭之后的高死亡率是孕妇的HEV感染特有的，特别是在怀孕的晚期妊娠期间(Khuroo等,1981)，并且可能与怀孕时的激素变化有关(Lindemann等,2010)。在涉及孕妇的研究中表明，HEV占急性病毒性肝炎感染的接近37％和爆发性肝炎病例的81％(Beniwal等,2003)。产科并发症，例如胎膜早破和胎儿宫内生长受限常见于怀孕中的HEV感染期间(Kumar等,2004)。在怀孕的晚期妊娠期间的HEV感染中，爆发性肝炎或产科并发症经常会引起死亡(Tsega等,1993)。伴随婴儿发病率和死亡率的病毒的垂直传播也常见于晚期妊娠的戊型肝炎感染(Khuroo等,1995)。孕妇中的高死亡率的原因未被清楚地理解。HEV感染可能与先前患肝脏疾病的人的严重疾病相关[Kumar Acharya等,2007]。虽然HEV慢性感染是罕见的，但在感染HIV的人中更为常见[Dalton等,2009]。发展中国家的肝炎爆发主要由HEV基因型1引起。墨西哥和西非的流行病爆发是由基因型2引起的。亚洲的分散性病例是由基因型4引起的。迄今为止仅基因型1和2发生于人类，而基因型3和4则还未在动物中分离到。HEV仅有一种血清型(Mushahwar,2008)，这意味着一种血清型的候选疫苗可以交叉保护由HEV的其他基因型引起的感染。戊型肝炎病毒抗原，包括ORF2(全长蛋白或截短的蛋白)的的用途是现有技术中已知的(Amini-Bavil-Olyaee等,2009)。已经公开了HEV病毒抗原作为用于预防HEV感染的疫苗的用途。还已发现在大肠杆菌(E.coli)中制备的HEV ORF2的重组疫苗对于向人类施用是安全的(Zhu等，2010)。现有技术中未公开戊型肝炎和HPV疫苗的组合用于女性的综合医疗保健。因此，需要通过实验证明开发组合疫苗的可行性，其中肝炎病毒和HPV抗原作为临时混合的混合物或者作为嵌合抗原被相伴施用时没有抗原干扰，所述嵌合抗原在表达为病毒样颗粒(VLP)的单个多肽上携带这两种疫苗表位。这些组合物的制备和用途在现有技术中是未知的。
带有其他病毒抗原的嵌合疫苗的开发中遇到的常见问题是支架抗原(scaffold antigen)在不影响两种疫苗的免疫原性所必需的天然结构构象下容纳异源蛋白序列受到限制，尤其是如果其待被组装成病毒样颗粒的话。除了支架抗原，用于制备嵌合抗原的异源蛋白的序列和结构构象是重要的。还至关重要的是异源序列待被添加到支架抗原上的位置。因此，这些因素在制备和测试嵌合构建体之前不能被预先确定。简而言之，一对抗原的工作原理与另一对抗原的不同，且因此该信息不能从描述了嵌合抗原的类似设计的现有技术推测得到。戊型肝炎的全长ORF2蛋白由660个氨基酸组成。病毒的中和表位不主要存在于蛋白的N末端和C末端。位于N-末端和C-末端的大多数氨基酸缺失不减弱蛋白组装成VLP的能力。HPV-HEV嵌合体的合理设计包括在HEV ORF2蛋白的任何的区域中插入异源HPV L2广谱中和表位，所述插入不影响蛋白的天然结构，并且不影响这两种病毒抗原的免疫原性。将具有期望序列的HPV L2表位插入HEVORF2蛋白的任意区域中(所述插入不减弱HEV抗原组装成VLP的能力，并且同时将异源HPV L2表位展示在嵌合VLP的表面上)，对于抗HPV和HEV二者的疫苗将是理想的选择。作为这两种抗原的混合物的HEV抗原与HEV-HPV L2嵌合抗原和/或与HPV 16和HPV18 L1衣壳抗原的组合也是非常有效的疫苗组合。将HbsAg或嵌合HbsAg-HPVL2(PCT/IN2009/000333中描述了其制备方法)添加至HEV和/或HEV-L2抗原在现有技术中也是未知的。也是免疫原性结构蛋白的HEV的ORF3是良好的疫苗候选物，其可作为抗原被包括在该疫苗组合中。将Tdap或DTap(白喉类毒素、破伤风类毒素和无细胞百日咳抗原)或DTwP(其中无细胞百日咳抗原被全细胞百日咳抗原替代)添加到前述疫苗抗原中也是新的且未被现有技术描述。由于以下提及的原因，该疫苗组合的发现和开发也是非常重要的。
在全球，初生儿破伤风引起的死亡率是高的并且在发展中国家尤其是这样。其可容易地预防，因为针对破伤风毒素的抗体通过胎盘从被免疫的母亲被主动运输至其胎儿。这在初生阶段以及对于出生后的几个月提供了针对破伤风的被动保护。通过对孕妇或生育年龄的女性免疫可降低初生儿破伤风引起的死亡率。已证明在怀孕期间使用两个或更多个剂量的破伤风类毒素可预防初生儿破伤风(Schofield等，1961)。孕妇的破伤风类毒素接种已经被纳入WHO的免疫扩展项目。类似地，还向孕妇推荐了接种Tdap(破伤风类毒素，减少的白喉类毒素(reduced diphtheria toxoid)和无细胞百日咳)疫苗。推荐在晚期妊娠期间或在中期妊娠(second trimester)晚期(妊娠20周后)施用一个剂量的Tdap。如果不在怀孕期间施用，Tdap应在产后立即施用。当在怀孕期间施用Tdap时，在分娩时母亲将被保护，使得她不太可能将百日咳传给其婴儿，并且跨胎盘的母体抗体可能会在生命早期防止婴儿免受百日咳感染。在孕妇中，优选的日程安排是间隔4周两个剂量的Td，和在第二个剂量六个月后(产后)一个剂量Tdap。推荐青少年和/或正值育龄的女性应优选在怀孕前给予一个剂量的Tdap。全细胞百日咳疫苗还可替代无细胞百日咳疫苗施用。因此，Tdap和/或破伤风类毒素疫苗是与HPV和HEV抗原一起被包括在针对女性的组合疫苗中的良好选择。
含或不含HPV抗原的针对戊型肝炎与破伤风类毒素的组合疫苗是新的，且不是市售可得的，或者其未在任何现有技术中被公开。在本发明中，公开了关于开发HEV和HPV组合疫苗的方法。将前述抗原组合在作为混合物的单一制剂，或将其相伴施用的原理是为了提高女性的整体健康状况，因为宫颈癌作为印度女性中癌症的最常见原因排名前列，而且还由于该事实：戊型肝炎感染在孕妇中，特别是在怀孕的晚期妊娠中中导致高死亡率。HPV-HEV疫苗组合被预期为降低HPV和HEV感染引起的死亡率和发病率，并提高这部分人口的整体健康，而且如所推荐的，对孕妇接种Tdap降低了由破伤风和百日咳引起的婴儿死亡率。这些组合疫苗不仅对提供针对多种疾病的保护有用，而且是非常期望的，因为其减少所需要的免疫次数。组合疫苗还帮助降低制造和分销成本，使得疫苗具有成本效益并且可负担得起。疫苗的可负担性提高了接受度和覆盖率。在疫苗制剂中使用合适的佐剂也减少了所需抗原的量，并有助于低成本疫苗的制备，因此提供了独特的经济上的优势。对于所有前述抗原的共同施用没有观察到抗原干扰，且因此可制备不同抗原的组合物。对于重组抗原的制备，毕赤酵母(Pichia pastoris)作为重组表达宿主在工业化规模中是有优势的，因为对于大规模制造，其与其他真核表达系统相比具有成本效益。来源于毕赤酵母的重组蛋白已被成功商业化并被发现对于人类使用是安全的。因此，对于针对HPV和HEV的疫苗的生产，使用该表达系统制造HPV和HEV两个抗原是安全的和极具成本效益的。
发明目的
本发明的首要目的是提供用于预防和治疗病毒和细菌感染的疫苗组合物。
本发明的另一目的是提供针对HPV、HEV和乙型肝炎感染的组合疫苗。
本发明的另一目的是提供另外包含破伤风类毒素和/或三价破伤风类毒素和/或减少的白喉类毒素和/或百日咳疫苗的HPV-HEV-乙型肝炎抗原的组合疫苗。
本发明的另一目的是提供HPV和HEV的重组抗原和嵌合HPV-HEV抗原的序列。
本发明的另一目的是提供开发这些组合疫苗的方法。
本发明另外的目的是提供在哺乳动物中测试这些组合疫苗的方法。
本发明的另一个目的是提供前述抗原的有佐剂的疫苗组合物。
本发明另外的目的是提供用于诊断HPV和HEV病毒感染的HPV和HEV抗体。
发明概述
相应地，提供了若干种变化的DTap-HEV-HepB-HPV抗原的疫苗组合物，所述若干种变化在这些抗原与破伤风类毒素和/或三价破伤风类毒素和/或减少的白喉类毒素和/或百日咳抗原的组合方面。
本发明提供了人类乳头瘤病毒(HPV)和戊型肝炎(HEV)的抗原的组合的疫苗组合物，用于预防、治疗和诊断哺乳动物，特别是人类的HPV和戊型肝炎病毒感染。另外，将乙型肝炎抗原、破伤风类毒素和/或Tdap(破伤风类毒素，减少的白喉类毒素和无细胞百日咳)疫苗组合至前述疫苗组合物也在本发明的范围内。
前述病毒抗原的有佐剂的疫苗组合物提供了高的保护效力。该疫苗组合物可以以适合注射的单一组合制剂被提供在一个容器中或不同的这类容器中(小瓶)。这些疫苗组合物在作为注射液施用至宿主之前，通过在单独的容器中临时混合所需量的抗原施用。前述疫苗与其他病毒和细菌抗原的组合也在本发明的范围内。
在一个实施方案中，本发明提供了纯化的HPV16和HPV18 L1抗原与纯化的HEV ORF2抗原的组合疫苗。
在另一个实施方案中，本发明提供了HPV16、HPV18 L1蛋白和HPV16L2-HbsAg嵌合抗原与HEV抗原组合的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了对预防HEV和HPV两种病毒感染有用的嵌合HEV-HPVL2抗原、以及HPV16抗原和HPV18 L1抗原。
在一个示例性的实施方案中，本发明的疫苗组合物包括：白喉类毒素，'D'；破伤风类毒素，'T'；百日咳抗原；重组乙型肝炎病毒表面抗原，HBsAg；HPV16和HPV18的重组人乳头瘤病毒L1抗原；重组戊型肝炎(HEV)ORF2抗原；与HBsAg或戊型肝炎(HEV)蛋白嵌合融合的重组HPV L2表位。对于前述抗原的组合没有观察到抗原干扰。
本发明的疫苗可通过在使用时将两种组分：(a)包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Tdap的第二组分混合在一起临时制备。
这两种组分被分开装填，且因此通常，本发明提供了包含(a)包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Tdap的第二组分的试剂盒。
可选择地，Tdap可被配制在氢氧化铝中并用作单组分疫苗。
如果分开包装的话，混合步骤将一般发生在使用时。因此，本发明提供了用于制备本发明疫苗组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；和(b)提供包含Tdap抗原的第二组分；(c)混合第一组分和第二组分以提供疫苗。
附图简述
图1：通过使用实施例1中描述的基因特异性引物的PCR，PCR扩增(1A)约1.494 Kb的HEV ORF2基因；(1B)约110 bp(其包括基因序列、限制性内切酶序列和5’突出末端)的对应于HPV16 L2的氨基酸SATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG，和约60 bp(其包括基因序列，限制性序列和5’突出末端)的对应于HPV L2表位的氨基酸序列LVEETSFIDAGAP。所扩增的基因片段的大小，对于HEV ORF2相对于1Kb阶梯(ladder)展示，而对于HPVL2片段相对于100 bp阶梯展示。
图2：2A呈现了在用甲醇诱导(I)后24小时和120小时SEQ ID NO.4的HEV ORF2在毕赤酵母中的表达，示出了54kDa蛋白的表达；UI-未诱导的细胞；2B呈现了在用甲醇诱导(I)后48小时和120小时SEQ ID NO.6的HEV-HPVL2在毕赤酵母中的表达(I)，示出了56kD蛋白的表达；UI-未诱导的细胞；M-为中等范围的分子大小标志物(Genei,Bangalore)。
图3：3A呈现了通过粗箭头指示的纯化的SEQ ID NO.4的重组54kDHEV ORF2蛋白；且3B呈现了通过粗箭头指示的纯化的重组嵌合56kDHEV-HPV16 L2蛋白。显示了分子大小标志物的大小。
图4：呈现了使用醋酸铀染色的嵌合HEV-HPV16 L2蛋白的透射电子显微术(TEM)，展示了蛋白自发地组装成病毒样颗粒。如该图底部所示，尺的大小是200nm。
发明详述
本文以下公开了本发明的详细实施方案。但是，应当理解所公开的实施方案仅例示了本发明，本发明能够以多种方式呈现。本发明的范围不限于所公开的实施方案，并且本文所用的术语和短语不意在是限制性的，而是为了提供对本发明的可理解的描述。本发明由所附的权利要求书限定。
本发明涉及疫苗组合物，其包括人乳头状瘤病毒(HPV)和戊型肝炎病毒(HEV)的抗原的组合，用于预防和诊断哺乳动物特别是人类的HPV和戊型肝炎感染。向上述组合加入乙型肝炎抗原在本发明的范围内。而且，将破伤风类毒素和/或Tdap(破伤风类毒素，减少的白喉类毒素，以及无细胞百日咳)疫苗组合至前述疫苗组合物也在本发明的范围内。这些疫苗组合物在作为注射液施用至宿主之前，通过在一个单独的容器中临时混合所述抗原施用，或可以以两种或更多种单独的制剂相伴施用于人类，所述制剂可以在不同部位肠胃外注射以引发免疫应答。前述抗原的组合疫苗被提供在单独的容器中，例如疫苗小瓶，或被提供在待用于注射的预填充的注射器中。前述疫苗与其他病毒和细菌抗原的组合也在本发明的范围内。
本发明还提供了用于制备组合疫苗的方法，所述组合疫苗包括：(i)戊型肝炎(HEV)病毒样颗粒，(ii)乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg与HPV L2蛋白的嵌合蛋白(‘HbsAg-HPVL2’)，和/或嵌合的HEV–HPV L2嵌合蛋白，(iii)HPV16 L1和HPV18L1抗原，(iv)破伤风类毒素(‘T’)，(v)无细胞百日咳抗原('aP')，(vi)白喉类毒素(‘D’)并且所述方法包括以下步骤：(a)将HEV组分与嵌合HEV-HPV L2组分组合以得到二价组分；(b)将HEV抗原与嵌合HbsAg-HPVL2组合以得到二价组分；(a)将HEV组分与HPV16 L1和HPV18 L1组分组合，以得到三价的HEV-HPV16L1-HPV18L1组分；(a)将三价的HEV-HPV16L1-HPV18L1组分与单价的嵌合HEV-L2组分组合以得到四价的HEV-HPV16L1-HPV18L1-HEV-L2组分；(b)将三价的HEV-HPV16L1-HPV18L1组分与嵌合HbsAg-HPVL2组合以得到四价的HEV-HPV16L1-HPV18L1-HbsAg-L2组分；和(c)将所述的D-T-ap组分与所述二价/三价/四价组分中的任意一种混合以得到组合疫苗/或将D-T-aP疫苗连同所述病毒疫苗一起肠胃外相伴施用至哺乳动物宿主。
当组合疫苗的HPV衣壳抗原作为重组蛋白在真核表达系统中表达并从中纯化时，其是极具免疫原性的。HPV抗原是来源于被表达为病毒样颗粒(VLP)的主要衣壳蛋白L1。HPV抗原包括选自“致癌的”HPV类型的列表的两种或更多种抗原，所述列表包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等且可包括来自上述HPV类型的任意一种的HPV L2衣壳蛋白。HPV L2衣壳和HbsAg的嵌合蛋白是用于具有HEV和其他HPV抗原的组合疫苗的良好的疫苗候选物。被融合至前述疫苗抗原的异源病毒和细菌表位的加入也增大了HPV疫苗的免疫原性。
戊型肝炎疫苗抗原是包括蛋白的开放阅读框2(ORF2)的全长或截短序列的抗原，所述ORF2是戊型肝炎病毒的结构蛋白。对HEV全长ORF2蛋白进行截短以产生伴随增加的稳定性的更好表达，而并不损害装配至VPL中的候选抗原的免疫原性。HEV ORF2的截短序列，例如112-608氨基酸区域和可选地368-606氨基酸被这样设计来容纳异源病毒序列，而不损害引发强烈的免疫应答所必需的结构符合性(structural conformity)。来自例如SEQ ID NO.1中的HEV ORF2蛋白的全长序列，和例如SEQ ID NO.2中的HPV16 L2的全长蛋白的不同的截短的基因片段通过PCR产生，所述基因片段包括这两个抗原的主要中和表位，并通过将这些片段连接在一起制备了数个嵌合构建体。HEV基因序列可来源于任何HEV基因型，例如基因型1-4。嵌合抗原的不同序列在本发明的范围内。这些构建体编码具有不同分子大小的嵌合蛋白。对于前述抗原的组合未观察到抗原干扰。发现可通过在使用时临时将两种组分(a)包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Tdap的第二组分混合在一起来制备本发明的疫苗。所述两种组分为分开加入的，且因此通常，本发明提供了包括：(a)包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Tdap的第二组分的试剂盒。可选择地，Tdap可被配制在氢氧化铝中并用作单组分疫苗。如果分开包装的话，混合步骤一般发生在使用时。因此，本发明提供了用于制备本发明的疫苗组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；和(b)提供包含Tdap抗原的第二组分；(c)混合第一和第二组分以提供疫苗。
对于前述组合疫苗，获得接近或等于或超过在将抗原单独施用至动物时获得的效价的100％的针对HPV和HEV病毒的抗体效价是可能的。所述组合疫苗针对HPV和HEV感染诱发稳固的抗体水平，且未观察到抗原干扰。本发明描述的所有方法可适用于HPV和戊型肝炎病毒的任意基因型或基因变体/血清型/毒株。制备和使用具有所限定的序列的HPV和HEV抗原的组合物和方法在本发明的范围内，所述抗原在任意原核或真核表达系统中被表达为重组蛋白或重组病毒样颗粒。所述基因序列为天然的病毒序列或为了在宿主细胞中表达被密码子优化的合成基因。所选择的真核表达系统包括哺乳动物细胞；昆虫细胞中杆状病毒介导的表达，和任意种的酵母细胞，最优选毕赤酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。发现毕赤酵母高水平表达前述抗原。用于真核表达的序列优化包括存在Kozak共有序列，例如位于基因5’末端的(gcc)gccRccATGG，其中ATG为起始密码子，或使用酵母共有序列(5'-[A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]-3')。为在毕赤酵母中表达，合成基因序列被密码子优化以进一步提高表达水平。前述的蛋白可作为细胞内蛋白表达并被从中纯化。可选择地，其可被表达为分泌性蛋白并被纯化。用于在酵母细胞中表达的任何合适的表达载体选自包括但不限于下列的列表：pPIC3.5、pPIC3.5K、pA018、pPIC9、pPIC9K、PHILD2等。使用了适合在酿酒酵母或其他酵母种中表达的质粒载体。酵母细胞包括但不限于下列：毕赤酵母、酵母属(Saccharomyces spp)、Hanensulapolymorpha、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp)、酵母菌(kluveromycesspp)。毕赤酵母如GS115、KM71和蛋白酶缺陷株，例如SMD1168或SMD1163被用于重组表达。前述基因被以单拷贝或以多于一个拷贝克隆。使用针对HPV和HEV病毒抗原的抗体用于开发通过ELISA评估抗原含量的方法，并还在评估疫苗抗体效价时用作参考标准。还发现了它们在诊断方面的应用。
通过物理或化学方法且优选地通过两者的组合实现病毒的纯化。物理方法利用病毒类颗粒的物理性质，例如密度、尺寸、质量、沉降系数等，且包括但不限于下列技术中的任何一种：超速离心、密度梯度离心、超滤等。通过化学方法的纯化是指采用例如通过化学或物理化学反应例如离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石基质、用无机盐(该无机盐的一个实例是硫酸铵)盐析和通过使用拥有专利权的Himax技术、有机盐、有机溶剂、磷酸铝、氢氧化铝和有机化合物，如聚乙二醇的吸附/解吸的方法。所述病毒的重组抗原的纯化通过一种或两种或更多种上述方法的组合实现。
上述HPV-HEV疫苗以及HPV-HEV和破伤风类毒素和Tdap疫苗的抗原组合物被配制在适于对人类免疫的药学上可接受的载体中。此外，对于有佐剂的疫苗制剂，合适的佐剂选自如下列表，所述列表包括但不限于：氢氧化铝、磷酸铝；磷酸钙；任何多晶型的菊粉，优选γ菊粉；包含菊粉与其他有机和无机化合物例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸硫酸铝(aluminumsulphate phosphate)和磷酸钙；脂质体、壳聚糖和复合碳水化合物例如葡聚糖、糊精、淀粉、甘露聚糖和葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、β-葡聚糖、肝素、纤维素、果胶和果胶酸盐(pectinate)、植物凝集素和合成的或来源于任意来源的任意其他碳水化合物，任意生物可降解的和生物相容性的聚合物，例如聚交酯和聚(丙交酯共乙交酯；PLG)或PLGA；任意乳剂，包括但不限于水包油乳剂、其他基于鲨烯的佐剂、包含胆钙化醇的水包油乳剂、胆钙化醇本身作为佐剂、任意油包水乳剂；用胆钙化醇作为组分之一与其他脂溶性的组合物一同制备的脂质体；具有其他组成的脂质体；RIBI佐剂系统，皂苷，包括但不限于QS-21、QuilA、番茄苷、ISCOM、ISCOMATRIX等，脂肽、糖肽、脂多糖、胞壁酰二肽和任意基于肽的佐剂，寡核苷酸、任意TLR配基作为佐剂、任意细胞因子、维生素和无毒性的细菌毒素等。除了上述以外，具有良好的免疫增强活性(immunopotentiatingactivity)的任何其他有机或无机物质可单独地或组合地用作佐剂以增强HPV-HEV组合疫苗的免疫原性。具有矾的疫苗组合物当在哺乳动物中肠胃外施用时引发强烈的免疫应答。包含疫苗佐剂的方法和疫苗组合物在本发明的范围内。
对于疫苗的效力测试，在小鼠和豚鼠中测试疫苗制剂。通过经由ELISA评估抗体效价体外测定所得的血清。通过文献中充分描述的程序使用毒素中和测试评估破伤风类毒素和白喉类毒素的效力。在用本发明描述的疫苗制剂免疫的动物中观察到血清转化。没有观察到由于不同抗原组合或佐剂引起的抗原干扰。所述制剂中使用缓冲液是磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，或可使用具有合适pH的任何其他药学上可接受的缓冲液。2-苯氧基乙醇用作疫苗防腐剂；可使用硫柳汞或任何其他疫苗防腐剂。可选择地，疫苗组合物可被配制为不含任何疫苗防腐剂。疫苗任选地包含稳定剂等。赋形剂选自包括但不限于下列的列表：非还原糖、糖醇例如山梨糖醇及甘露糖醇，甘油、氨基酸、人血清白蛋白或从前述佐剂列表中选择的佐剂。液体形式的稳定制剂或冻干形式的稳定制剂在重构于药学上可接受的缓冲液或水中之后适合于对人类宿主肠胃外施用。更具体地，对于本发明的抗原，提供了对检测感染具有高的灵敏性和特异性的诊断测定。本发明范围内的方法可适用于HPV和戊型肝炎病毒的任何基因型/基因型变体/血清型/毒株。
实施例
下面的实施例进一步描述了本发明。
实施例-1：戊型肝炎病毒(HEV)抗原和嵌合HEV-HPV L2抗原的克隆和重组表达
具有氨基酸序列SEQ ID NO.1的戊型肝炎ORF2基因的合成基因通过用分别含有EcoRI和NotI限制性位点的5'引物和3'引物PCR扩增以获得约1494bp的PCR片段SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.3编码SEQ ID NO.4的蛋白(参见图1)。用于HEV基因的PCR扩增的引物是5'-CATTTGAATTCACCATGGCCGTTGCACCTGCTCATGATAC-3'和5'-TATCGCGGCCGCTCATTAAGCCAATGCAGAATGAGGAGC-3'。
用于PCR扩增的条件为在94℃下变性45秒，在60℃下退火40秒和在72℃下延伸2.5分钟，持续30个循环，随后在72℃下最后延伸10分钟。所述反应混合物由1×Taq DNA聚合酶缓冲液、0.25mM dNTP、20皮摩尔的各个引物和1U的Taq DNA聚合酶(Genei)以及1U的Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)组成。所述PCR片段用EcoRⅠ和NotI消化、凝胶纯化并被用于连接到EcoRI和NotI消化的酵母载体pPIC3.5K(Invitrogen，卡尔斯巴德，美国)。1494bp的PCR片段被用于与针对HPV16L2表位的基因序列嵌合融合，所述表位由SEQ ID NO.2的HPV16 L2蛋白的第14-37位氨基酸，序列为SATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG，和/或其第108-120位氨基酸，序列为LVEETSFIDAGAP组成。针对HPV16 L2表位的第14-37位氨基酸的基因序列当被连接至HEV基因的5’末端时的嵌合融合产生编码SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.5，且当其被连接至HEVORF2 PCR片段的3’末端时，产生编码SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.7。所述连接通过位于针对HEV或HPV L2序列的引物的任一末端的BamH1位点实现。使用了下面的引物扩增HPV16 L2序列的第14-37位氨基酸用于融合至HEV ORF2片段的N末端：5’-ATGTCGAATTCACCATGGCTGCAACTCAGTTGTATAAAAC-3’和5’-ATCGAGGATCCTTGAACCTTTGGGATAATGTC-3’。对于在HEV ORF2片段C末端的扩增和融合，下面的引物被用于上述区域的HPV 16 L2 PCR：5’-ATGTCGGATCCTCTGCAACTCAGTTGTATAAAAC-3’和5’-ATCGAGCGGCCGCTCATTAACCTTCAACCTTTGGGATAATGTC-3’。被设计成扩增HPV16 L2基因的5’TTGGTTGAAGAAACCTCCTTTATTGACGCTGGTGCTCCA-3’区域，其对应蛋白序列LVEETSFIDAGAP，的PCR引物还包含用于连接两个基因片段的BamH1位点。编码LVEETSFIDAGAP的基因片段与HEV ORF2的C末端的嵌合融合产生编码SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.9。SEQ ID NO.11是在N末端带有HPV L2的第14-37位氨基酸区域并在C末端带有HPV 16L2的第108-120位氨基酸的HEV ORF2的核苷酸序列。对应的蛋白序列是SEQ ID NO.12。类似地，为了产生HEV ORF2与前述HPV L2序列的嵌合构建体，用于扩增1494 bp片段的PCR引物还包括位于所述基因片段的5’区域的末端或位于3’末端的BamH1位点，以方便连接到HPV L2表位。可选择地，戊型肝炎与HPV L2蛋白的嵌合构建体的构建，ORF2的714bp片段(从368-606氨基酸)通过PCR进行了扩增，并在HEV PCR片段的N末端或C末端连接HPV16 L2表位(第14-37位氨基酸和/或第108-120位氨基酸的区域)。对于N末端处的连接，所述HEV片段用引物5’-ACGTCGGATCCATCGCCCTTACATTGTTTAATTTG-3’和5’-TATCGCGGCCGCTCATTAAGCCAATGCAGAATGAGGAGC-3’扩增，而对于在HEV片段C末端处的连接，HEV基因使用5’-AGCTCGAATTCACCATGGCCCTTACATTGTTTAATTTG-3’和5’-ACTCAGGATCCTTATCAAGCCAATGCAGAATGAGGAGC-3’扩增。PCR扩增的条件是在94℃下变性45秒，对于不同的引物组合在56℃-62℃下退火40秒，和在72℃下延伸2分钟持续30个循环，随后在72℃下最终延伸10分钟，使用如上所述的用于1494 bp HEV ORF2扩增的相同浓度的试剂。为了产生HPV L2和HEV的嵌合基因，将PCR扩增的基因在BamH1消化后连接，进一步用EcoR1和Not1消化，并连接到EcoR1和Not1消化的pPIC3.5K酵母载体中并转化到大肠杆菌DH5α中。从在50μg/ml氨苄青霉素上筛选的转化的大肠杆菌中分离重组质粒DNA。包含HEV-HPVL2嵌合基因的重组质粒用BglII线性化，并按照标准的酵母转化操作说明(Invitrogen，卡尔斯巴德，美国)转化到毕赤酵母GS115细胞中。
实施例-2：HEV和HEV-HPV L2嵌合蛋白的纯化：
使表达HEV和HEV-HPVL2嵌合蛋白的重组蛋白的毕赤酵母GS115克隆在28℃生长96小时，并每24小时用1％甲醇诱导，并在120小时结束后收集(图2)。所述细胞用50mM pH 8.0的含2mM EDTA、10mM NaCl的Tris-HCl缓冲液洗涤一次，并在含0.05％Triton X-100的相同缓冲液中裂解。细胞裂解物在4000rpm下离心20分钟，并在用相同的缓冲液平衡Q-琼脂糖柱上纯化包含所述蛋白的细胞上清液。用在相同的缓冲液中包含50mM至750mM NaCl的盐梯度洗脱所述蛋白，并收集包含蛋白的级分，并在SDS-PAGE凝胶上检验代表HEV蛋白的54kDa条带和代表嵌合HEV-HPVL2蛋白的56kDa条带的存在。使用TFF系统浓缩含HEV蛋白的级分，并将浓缩物上样到50mM pH 7.2的含154mM NaCl的磷酸盐缓冲液平衡的Captocore700凝胶过滤柱中。在流出物(flow through)中收集病毒样颗粒。在SDS-PAGE凝胶上检验蛋白纯度并发现大于95％纯(图3)。所纯化的蛋白被进一步表征。
实施例-3：透射电子显微术：
在用2％醋酸铀负染后，通过透射电子显微术(TEM)可视化纯化的病毒样颗粒(VLP)，并被描绘在图4中。
实施例-4：用于效力测试的疫苗制剂：
对于效力测试，制备了各自由下面提到的浓度的纯化的疫苗抗原和佐剂组成的疫苗组合物以对小鼠免疫：1)均吸附在1.5mg氢氧化铝上的30μg HEV ORF254kDa蛋白、40μg HPV16 L1蛋白、20μg HPV18 L1蛋白以及30μg HbsAg-HPV L2/HEV-HPV L2嵌合抗原和包含均被单独地吸附在氢氧化铝上的甲醛去毒的2.5Lf单位白喉毒素(DT)、5Lf单位破伤风类毒素(TT)和8μg去毒的百日咳毒素(PT)、8μg丝状血凝素(FHA)和2.5μg百日咳杆菌粘附素(PRN)的Tdap(破伤风类毒素，减少的白喉毒素和无细胞百日咳)。可选择地，1.5mg的磷酸铝可用于吸附除了破伤风类毒素以外的所有上述抗原，破伤风类毒素被吸附在氢氧化铝中。破伤风类毒素(TT)和去毒的百日咳毒素(PT)是获自Bharat Biotech国际有限公司的生产设施的GMP产品。无细胞百日咳抗原是从百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)培养物的上清液中通过包括下列的步骤纯化的：离心培养物上清液、盐分级分离、透析过滤、柱层析和将缓冲液交换成pH 7.2的1X PBS。HPV16和HPV18 L1抗原是从毕赤酵母细胞中表达和纯化的重组蛋白。制备重组HPV蛋白和HbsAg-HPV16 L2的方法之前被描述于WO2010/001409中。其他佐剂的加入进一步增强了所述疫苗制品的效力。多晶型形式的菊粉，特别是γ菊粉的加入增强了疫苗制品的效力。γ菊粉包含具有超过8000道尔顿的分子量的颗粒，并且在37℃几乎不溶于水。高分子量菊粉从比利时的Beneo Orafti获得。γ菊粉级分通过现有技术中概述的方法制备(US 4,954,622；PCT/AU86/00311)，且阿伽目林(algammulin)的制备按照Cooper和Steele，1991描述的方法进行。2mg/ml浓度的γ菊粉和阿伽目林制品被用于疫苗制剂中。在环境温度下将疫苗抗原与佐剂混合两小时并立即用于注射。类似的制剂还用对稳定性没有不利的影响的pH 6.8–7.2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液测试。通过离心测试矾对疫苗抗原的吸附，并通过SDS-PAGE检验上清液中具有预期大小的针对不同抗原的蛋白条带。所有前述抗原被高效地吸附至矾。在小鼠中测试疫苗制剂的效力。
实施例-5：疫苗制剂的效力测试：
使用每组六只Balb/c小鼠测试实施例4中描述的不同病毒抗原组合物。实施例4中描述了最高的疫苗抗原浓度。对18-20g体重的6-8周龄的小鼠肌肉内注射四种疫苗制剂的两倍稀释液。所述稀释液在1X PBS(50mM pH 7.2的包含150mM NaCl磷酸盐缓冲液)中制备，并且所述稀释液包含适量的佐剂以维持恒定的佐剂浓度。使用2-苯氧基乙醇作为疫苗防腐剂。对于对照动物，注射等体积的包含相同量的佐剂而不包含病毒抗原的缓冲液。在施用第一次疫苗剂量后的第14天给予加强注射。施用加强剂量7天后从后眼窝窦(retro-orbital sinus)收集血液，分离血清，在56℃灭活30分钟，并在-80℃下冷冻储藏直至被用于血清学测定。对于测试白喉毒素的效力，使用如以下实施例6中描述的豚鼠。
实施例-6：通过ELISA和毒素中和测定确定抗体效价：
为了测定针对HEV和具有HPV16 L2的HEV嵌合抗原的抗体效价，通过间接ELISA评价HEV抗体。将溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液的约1μg的54kD疫苗抗原包被到96孔平板上，并在2-8℃下过夜孵育。类似地对于评价针对HPV16和HPV18 L1抗原以及HPV16 L2表位的抗体效价，将溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液的1μg纯化的HPV16 L1和HPV18 L1以及HPV16 L2抗原分别包被在96孔平板上，2-8℃下过夜孵育。用于前述HEV和HPV抗原的其余程序与以下描述的相同。在丢弃平板内容物后，孔用3％溶于pH 7.4的磷酸缓冲盐水的脱脂奶粉封闭。在37℃孵育平板一小时，并用包含0.05％溶于PBS的吐温-20(PBST)的漂洗缓冲液洗涤五次。加入受试血清的两倍系列稀释液，在37℃孵育平板一个半小时。用漂洗缓冲液洗涤平板8次。添加1:2500稀释的小鼠抗IgG HRPO偶联物，并在37℃孵育1小时。用漂洗缓冲液洗涤孔五次并用PBS洗涤三次，并通过加入OPD(邻苯二胺，Sigma Aldrich，USA)和H2O2显色。在加入1N硫酸后10分钟读取读数。作为对动物的血清转化的量度的抗体效价被评价为高出对照动物的血清稀释度的血清稀释度+3×对照值的标准差的倒数(thereciprocal of the serum dilution that is above that of control animal+3 xstandard deviation of the control value)。使用Axsym Ausab试剂盒(AbbotLaboratories)按照制造商提供的试剂盒操作说明评价针对HbsAg的抗体效价。10mIU/mL的效价被认为是血清转化的截断值(cut-off)。抗体浓度以mIU/mL表示。在豚鼠中通过毒素中和实验(TNT)测试白喉抗毒素。每个测试组、对照组和标准参考组中使用6只动物。参考标准获自NIBSC。将病毒稀释液和参考标准皮下注射豚鼠，而对照组接受等体积的包含氢氧化铝的介质。四周后，用100LD50的白喉毒素攻击疫苗接种的动物。对照组用1LD50的毒素攻击。观察不同稀释组中动物的死亡率，并相对于参考标准组评分。效力的截断值是30IU/剂量。所有动物针对白喉毒素进行血清转化。在Balb/c小鼠中测定破伤风类毒素的效力。每个测试组、参考标准和对照组包括6只动物。对每只小鼠皮下注射0.5ml的四种破伤风类毒素(TT)的两倍系列稀释液。四周后，用0.5ml体积的100LD50的破伤风类毒素攻击疫苗接种的动物(疫苗测试组和参考标准组)。用1/50至1/200稀释的破伤风毒素刺激对照组。观察动物的死亡率。效力结果用IU/ml表示(表1)。效力的截断值是60IU/剂量。被相伴施用疫苗的所有动物进行血清转化，并且没有观察到疫苗抗原或矾的抗原干扰。通过ELISA使用来自NIBSC的参考标准针对去毒百日咳毒素产生的抗体效价测定无细胞百日咳组分的效力。还确定了针对百日咳杆菌粘附素蛋白的抗体效价。
表1：相伴施用的疫苗抗原的效力测试
*抗体效价被评价为高出对照动物的血清稀释度的血清稀释度+3×对照值的标准差的倒数。
-施用HbsAg-L2或HEV-L2中的任一种引发针对L2表位的免疫应答，而没有来自其他抗原的干扰。
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Claims (13)

1.用于对人类施用的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：
(i)白喉类毒素，′D′；
(ii)破伤风类毒素，′T′；
(iii)百日咳抗原；
(iv)重组乙型肝炎病毒表面抗原，HBsAg；
(v)重组人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的L1抗原；
(vi)重组戊型肝炎(HEV)ORF2抗原；
(vii)与HBsAg或戊型肝炎(HEV)蛋白嵌合融合的重组HPV L2表位。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中组分包括戊型肝炎ORF2，所述戊型肝炎ORF2包含由基因SEQ ID NO.3编码的蛋白SEQ ID NO.4的112-606氨基酸。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述异源HPV L2表位被融合在沿所述HEV ORF2蛋白的任何位置，优选地在例如由SEQ ID NO.5编码的SEQ ID NO.6的N末端。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述异源HPV L2表位被融合在沿所述HEV蛋白的任何位置，优选地在例如由SEQ ID NO.7编码的SEQ ID NO.8的C末端。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述重组抗原HEV和嵌合HEV-L2抗原由核苷酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11编码，所述核苷酸序列SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11被密码子优化以增强在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达并分别编码蛋白SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述重组抗原在酵母细胞，优选毕赤酵母中克隆、表达和纯化。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，还包含佐剂。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述佐剂为选自氢氧化铝或磷酸铝的矾，以及γ菊粉和阿伽目林。
9.一种用于对人类施用的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：
(a)包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；以及
(b)包含Tdap的第二组分。
10.一种组合如权利要求9中所述的疫苗抗原以用于相伴施用的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)提供包含HEV、HPV和嵌合HEV或HBsAg抗原的第一组分；
(b)提供包含Tdap抗原的第二组分；和
(c)混合所述第一组分和第二组分以提供所述疫苗。
11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中Tdap可被配制在氢氧化铝中并用作单组分疫苗。
12.一种在酵母细胞中制备权利要求5和6的重组抗原的方法，其中编码所述重组蛋白的基因被克隆到酵母表达载体中并在酵母细胞中被表达为细胞内蛋白并被从中纯化。
13.一种用于引发并测量针对一种或更多种权利要求1的抗原的免疫应答的方法，所述方法通过肠胃外施用疫苗剂量，并通过ELISA测量抗体效价进行。
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