CN104515758A - 促癌活性的定量检测方法以及促癌剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种定量检测待测物的促癌活性的方法，包括以下步骤：选择适宜细胞模型，按照需求分为供体细胞和受体细胞；在供体细胞中同时加入两种荧光探针并孵育；供体细胞和受体细胞按比例混合培养；受试组混合培养细胞中加入待测物，对照组不添加；孵育一定时间后，流式细胞计测量受试组和对照组供体细胞中一种荧光探针转移至受体细胞的单阳性细胞个数；计算两组的Te值(转移效率，Transfer effects)，分别用Te_con和Te_test表示，Te值＝单阳性细胞数/供体细胞数×100％；用Te_R表示该待测物的Te相对值，Te_R＝Te_test/Te_con×100％；根据待测物的Te_R评价待测物的促癌活性大小，Te_R越小表明该待测物的促癌活性越强。还涉及上述方法在体外筛选促癌剂中的应用，当Te_R小于90％时，鉴定为促癌剂。

Description

促癌活性的定量检测方法以及促癌剂的筛选方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别是涉及一种促癌活性的定量检测方法以及促癌剂的筛选方法。

背景技术

环境污染是当今社会倍受关注的问题。国内外的大量研究表明，在癌症发生和发展过程中，70％以上的致癌和促癌因素与环境污染和人类行为密切相关。致癌性物质污染环境是增加癌症发生的重要原因之一。导致人类癌症的环境污染物可通过空气、水和土壤对环境产生污染，致癌部位广泛，包括肺、皮肤、膀胱、喉、卵巢、乳腺、鼻咽、肾及造血系统等。世界卫生组织国际癌症研究中心的《世界癌症报告2014》，列出了18类导致人类癌症的环境污染物，如砷及其无机化合物、石棉、苯、1，3-丁二烯、六价铬化合物等。这些致癌性环境污染物，有的是在工农业生产的职业过程中有所接触，如石棉、苯、氡及其子体、；有的常见于日常生活，如家庭燃煤、室内空气污染、室外悬浮颗粒、柴油机尾气；还有个人生活行为产生的接触，如吸烟和二手烟等。

随着经济和工业化的飞速发展，新的环境化学物质还将不断涌现，人类的致癌风险仍将继续增加。如何从种类繁多的化学物质中筛选出对人体可能致癌的物质，从而做到早期预防、保障人群健康不仅是非常关键的科学问题，也是一个亟需解决的社会问题。因此，发展高效、快速的化学物质致癌活性检测技术和致癌剂筛选方法具有非常重要的科学价值和社会意义。

化学物质的致癌性包括遗传毒性致癌性(致癌性)和非遗传毒性致癌性(促癌性)。致癌剂引起细胞发生癌前病变，成为潜在的肿瘤细胞；促癌剂促进潜在的肿瘤细胞成为恶性转化细胞，促进肿瘤的发生。促癌剂促进细胞转化的机制复杂多样，可以诱导局部组织炎症、增生，促进细胞异常增殖，引起细胞增殖/凋亡平衡失调，抑制细胞通道的功能，刺激炎性细胞产生自由基等。

促癌活性/肿瘤促进作用(tumor promotion)是指能够促进启动细胞异常增殖并最终形成肿瘤的能力，表现为非遗传毒性的致癌作用，在化学致癌作用的促长阶段发挥作用。促癌作用是一个可逆的长期过程，它不同于启动作用的迅速和不可逆性，在整个肿瘤的发生过程中具有重要作用。促癌剂具有器官特异性，必须在致癌剂作用后才能发挥促癌作用。

根据促癌剂的特点及其作用机制，人们设计了多种促癌活性的检测方法，包括体内试验方法、体外试验方法及针对促癌剂作用机制的调控因子的检测方法。体内实验方法主要是采用实验动物模型，通过持续使受试动物暴露于待检测的化学物质，经过一段时间之后，观察动物中是否出现肿瘤以及肿瘤的部位、肿瘤大小、恶性程度等情况，由此判断该化学物质是否具有促癌活性及其大小；体内实验包括小鼠的二阶段致癌试验、大鼠肝癌促进模型、小鼠耳肿胀促癌模型等。虽然体内实验能够直观地观察到癌症的发生，并可以用于探索促癌的分子机理，但是需要实验动物为研究对象，研究周期相当长，并且对促癌剂具有靶器官特异性的选择，不适用于促癌剂的快速、高效的筛查检测以及不同器官组织促癌活性的检测。

体外试验方法包括c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型、人前髓自血细胞贴壁试验、培养细胞胆碱摄入试验、培养细胞放射性无机磷摄入试验。体外试验方法大多以细胞研究对象，观察在促癌剂的存在下，细胞发生的生物学改变。例如在c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型中，采用电穿孔的方法，将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38及人支气管上皮细胞BEAS-2B中，将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后，进一步用促癌剂佛波醇酯处理，并选用克隆形成率、锚着独立性生长、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测。克隆形成率增加、具有锚着独立性生长特性、血清抗体含量增加及裸鼠成瘤实验阳性表明佛波醇酯的促癌作用增强，c-Ha-rasV12G基因可使上皮细胞BEAS-2B获得对PMA的促癌作用敏感性。体外试验相比体内检测简单易行，但往往不能直接观察到肿瘤的发生，有的体外试验体系亦需培养较长的时间，且体外试验的检测原理多是促癌剂促进细胞增殖的效应，不能体现促癌剂的其他作用机制。

由于分子细胞生物学的发展，近年来发现了多种与调控细胞增殖、凋亡相关的蛋白、酶类及基因。科学家在调控细胞增殖、凋亡的蛋白、酶类及基因表达的检测方面进行了大量的研究，而且取得了非常显著地进展。近年来研究发现，胃癌、直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等多种人类恶性肿瘤中5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)的表达明显增高，而抑制5-LOX表达有可能预防和逆转恶性肿瘤的发生，这表明5-LOX在恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。5-LOX是脂氧合酶同工酶的一种，也是其中研究最为深入的一种，在人体内分布广泛，是机体催化花生四烯酸生成生物活性分子从而影响细胞信号传导及代谢的关键酶。5-LOX的促癌作用主要表现为：①细胞增殖和凋亡失衡，5-LOX的过度表达可促进恶性肿瘤细胞过度增殖，抑制其凋亡，使胞增殖和凋亡之间的平衡失调，从而促进肿瘤恶性行为的发生。②促进恶性肿瘤血管生成恶性肿瘤的生长。③与肿瘤的转移与肿瘤新生血管形成密切相关。检测化学物对5-脂氧合酶的影响可反映化学物的促癌活性。另一方面，越来越多的证据表明，促癌作用是一个渐进的过程，它通过选择性地增殖启动细胞而促进肿瘤的形成。与肿瘤发生正相关的c-myc、c-fos及与肿瘤发生负相关的Rb、αl-I3基因在细胞增殖分化调控中起重要作用。促癌剂(TPA)可诱导与肿瘤发生正相关的c-fos、c-myc的表达，同时可降低与肿瘤发生负相关的Rb、αl-I3的RNA水平。提示促癌剂可能不是非特异地诱导基因表达的因子，而是通过选择性地改变基因的表达水平而起到促癌作用。虽然在蛋白、酶以及基因水平上的检测可在一定程度上反映化学物的致癌作用，但是这些蛋白和基因等多种多样，缺乏特定的评判标准，有些并不具有引发肿瘤的特异性，因此，对于促癌剂的预测有效性欠佳。

细胞间质膜通道是相邻细胞间存在的一种直接的跨膜通道，能允许分子量小于1kD的分子或离子通过，介导相邻细胞间的物质、能量和信息的传递。细胞间质膜通道是细胞间信号传导的重要途径，对细胞生长、增殖、分化等生理过程具有调节作用，并且与癌症的发生密切相关。肿瘤被认为是一种增殖和/或分化异常的疾病，在细胞癌变过程中，细胞间质膜通道的阻断可能使开始癌变的细胞失去与周围正常细胞传输的增殖调控信息的联系而获得自主性生长，进而形成肿瘤。

评价细胞间质膜通道功能的方法有代谢协同法(metabolic co-operation)、荧光色素转移法(fluorescent dye transfer)、电偶联测定、间隙连接结构分析以及连接蛋白基因表达分析等。早期的研究中多采用电偶联法，电镜分析间隙连接结构及连接蛋白基因表达测定，这些分析方法都不能直接观察到细胞间质膜通道的偶联功能，且需要特殊的检测设备，因此细胞间质膜通道功能的检测方法不断发展。近年来评价细胞间质膜通道功能的方法主要有代谢协同法和荧光色素转移法。

细胞间通过细胞间质膜通道交换代谢产物称为代谢协同，能通过细胞间质膜通道的物质都可以被代谢协同实验所采用，例如核苷酸、碱基和离子、氨基酸等。常用的代谢协同检测体系为采用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶阳性(HGPRT+)细胞与HGPRT-细胞体系建立的核苷酸检测体系。

常见的代谢协同实验例如酶缺陷细胞代谢协同试验。在该方法中，在添加6-巯基鸟嘌呤(6-TG)的培养基中混合培养6-TG敏感细胞和6-TG耐受细胞，测定后者的细胞群落形成率。V79中国仓鼠肺成纤维细胞野生型(HGPRT+，V79+)能代谢6-TG，在含有6-TG的培养基中，V79+细胞代谢6-TG产生的有毒代谢产物异常嘌呤核苷酸可导致其本身的死亡；V79细胞突变型(HGPRT-，V79-)细胞无HGPRT基因位点，不能代谢6-TG，因而在含有6-TG的培养基中能够存活并形成克隆。当两种细胞相互接触在含6-TG的培养基中混合培养时，V79+细胞与V79-细胞间产生代谢协同，有毒的代谢产物通过细胞间质膜通道由V79+细胞进入V79-细胞引起后者的死亡，通过计数V79-细胞克隆数，了解V79细胞间代谢协同水平，评价细胞间质膜通道的功能。

从上可以看出，代谢协同法的优点是不需要特殊的仪器设备，而且能与其它体外实验方法相配合构成化学物质毒性的体外筛查系统。其缺点是测定周期较长，而且都是间接地评价细胞间质膜通道的功能。另外，此方法多使用突变细胞株，无法检测种属或组织间的差异。

荧光色素转移法是通过向细胞内导入水溶性的低分子荧光物质(如lucifer yellow，CH等)，观察荧光物质在细胞间的移动，从而评价细胞间质膜通道的功能。主要包括微注射法(microinjection)、划痕染料标记示踪法(scrape loading and dye transfer)等。在微注射法中，将荧光色素导入细胞，在显微镜下观察色素从被标记细胞向邻近细胞的转移。通过玻璃微电极将荧光物质注入细胞内，1分钟之后显微镜下观察荧光物质向周围细胞的扩散，计算周围被扩散荧光染料的细胞数与注入荧光物质的细胞数的比值，得出染料偶联率用于评价细胞间质膜通道功能，每次实验中注入荧光物质的细胞不少于10个。划痕染料标记示踪法的原理是划痕造成的细胞损伤将荧光染料导入细胞内，小分子的荧光染料可通过细胞间质膜通道在细胞间扩散，而细胞间质膜通道功能下降的细胞荧光染料就较为局限在损伤细胞内，细胞间荧光染料的扩散情况用荧光显微镜观察，测定荧光染料沿划痕边缘垂直扩散的距离，评价细胞间质膜通道功能。

与代谢协同法相比，荧光色素转移法能更为直接地评价细胞间质膜通道的功能。它可以使用不同来源的细胞株或原代细胞，有利于研究细胞间质膜通道在不同种属、组织及细胞间的差异。另外，此方法的测定周期较短，并能够观察测试物暴露不同时间后细胞间质膜通道的变化，有助于对细胞间质膜通道调节机制的探讨。但是微注射法需要显微操作系统，对操作的精确度要求高；划痕染料标记示踪法对细胞划痕的要求较高，样品多时费时费力。

以上的方法相互之间虽互有补充，但都有各自的缺点，受测定周期、检测体系、仪器设备和/或操作人员技术的限制，每种方法中细胞间质膜通道功能的检测需要对样本进行逐个分析，检测时间大大延长，不能满足快速、大样本的实际检测的需要，因此，发展快速、高通量的细胞间质膜通道功能的定量检测方法和促癌剂筛选方法十分必要，对于评价环境化学物的促癌活性的实际应用具有重要价值。

本发明的申请人在此方面进行了深入的研究。通过大量的科学实验，申请人通过将荧光测定的高灵敏度与流式细胞技术定量检测有机结合起来，并将其应用于细胞间质膜通道的检测中，可以实现对细胞间质膜通道功能的定量检测，大大缩短了样品测定的时间，并首次将该方法用于检测促癌活性，实现了对促癌剂促癌活性的定量检测。本发明提供的方法对于检测和筛查促癌物的促癌活性以及基层检测工作的开展具有重要意义。

发明内容

基于现有技术中在促癌活性以及细胞间质膜通道检测方面存在的缺陷，本申请提供了一种快速、定量检测促癌活性的方法。该方法将流式细胞术应用至细胞间质膜通道功能的检测中，从而实现了快速、准确、定量地检测促癌活性。

本发明提供的检测技术以相邻细胞的质膜通道间物质的转移为原理，因此需要对相邻细胞进行不同的标记以区分供体细胞和受体细胞，在本申请中主要应用荧光探针，观察供体细胞和受体细胞之间所发生的荧光探针的转移，通过衡量实验组(或受试组)和对照组细胞间转移的荧光探针的多少，观察处理因素对细胞间质膜通道的影响，由此衡量其促癌活性的大小并实现对促癌剂的定量筛选。

一方面，本发明提供了一种定量检测待测物的促癌活性的方法，其包括以下步骤：

1)选择适宜的细胞模型，按照相应细胞培养条件培养细胞；

2)之后用消化液消化细胞，按照所需量分为供体细胞和受体细胞培养箱静置备用；

3)在供体细胞中同时加入两种荧光探针，孵育一段时间；在供体细胞中同时加入两种荧光探针，受体细胞静置备用；同时，在受试组的供体细胞和受体细胞中加入待测物；两组供体细胞在室温下孵育一段时间；

4)将受试组和对照组的供体细胞和受体细胞分别按比例混合培养于培养板中；在受试组的混合培养细胞中加入待测物；经过一段时间孵育，使受试组和对照组的待测细胞分别流经流式细胞计，通过流式细胞计分别测量受试组和对照组的供体细胞将其中一种荧光探针转移至受体细胞的单阳性细胞个数；

5)分别计算受试组待测物和对照组的Te值(转移效率，Transfer effects)，分别用Te_test和Te_con表示，Te值＝单阳性细胞数/供体细胞数×100％；

6)计算该待测物的Te相对值，用Te_R表示，Te_R＝Te_test/Te_con×100％；根据待测物的Te_R评价其促癌活性大小，Te_R越小表明该待测物的促癌活性越强。

本发明通过比较Te值，或者单位供体细胞内发生荧光探针转移的细胞数，可以实现促癌活性的定量检测并且实现对促癌剂的快速筛选。

在步骤1)中，可以选择任何适当的贴壁生长的细胞系，包括不同靶器官来源的细胞，例如来源于肾脏的293细胞系、来源于皮肤的HaCat细胞、来源于肝脏的HepG2细胞和IAR20细胞、来源于神经系统的SH-SY5Y细胞等；也可以是不同分化程度的细胞，如原代培养的正常心肌细胞、皮肤角阮细胞或成纤维细胞、肝脏细胞，或人肺腺癌成纤维细胞A549细胞株、人皮肤鳞癌细胞株A431等。在本申请中选择了Hacat细胞，原因在于：Hacat细胞的细胞间质膜通道蛋白表达量高，功能强，可获得较强检测信号，且Hacat细胞贴壁紧密，利于建立方法及优化条件，293细胞系作为肾来源的细胞系，可以用于验证特定类型的细胞系是否适用于本发明的方法。Hela细胞作为常见的研究肿瘤发生的细胞系，在本申请的研究过程中证实了Hela细胞不具有细胞间质膜通道物质传递的功能。对选择的细胞系，将混合培养的细胞分为对照组、溶剂对照组(水/有机溶剂/其他)、受试组、每组至少3个平行样。

在步骤2)，先对细胞进行消化，之后培养细胞。本申请对细胞不同处理方式对结果的影响进行了深入研究，这两种处理方式即先消化后装载探针再共培养以及先装载探针后消化再共培养。申请人通过实验确定了先消化后装载探针再共培养细胞的方式。这样处理的优势在于：可使细胞与荧光探针充分接触，装载更多探针，获得更强检测信号，提高检测灵敏度；并可降低流式细胞计激发光强度，减少荧光探针淬灭。

在细胞间质膜通道功能检测技术中，对荧光探针的选择条件为：①一种荧光探针可通过细胞间质膜通道连接通讯向周围细胞自由扩散，作为细胞间物质转移的指示荧光探针；②另一种荧光探针可稳定的与细胞某一部位结合而作为标记以区分供体细胞和受体细胞，作为供体/受体细胞的标记荧光探针；③两种荧光探针的最大激发波长应有一定的差异，以获得敏感特异的检测信号。

目前，在本领域内依据与细胞结合靶部位的特异性，可将荧光探针分为细胞膜探针、细胞质探针和细胞核探针；其中，细胞膜标记荧光探针包括：Dil荧光探针、Dio荧光探针、DiD荧光探针、DiR荧光探针等；细胞质标记荧光探针包括：荧光黄(Lucifer Yellow，LY)荧光探针、二醋酸羧基荧光素(Carboxyfluorescein diacetate，CFDA)荧光探针、钙黄绿素AM(CalceinAM)荧光探针、异硫氰酸荧光素FITC荧光探针、异硫氰酸罗丹明TMRITC荧光探针等；细胞核标记探针包括：Hoechst荧光探针、DAPI荧光探针、碘化丙啶PI荧光探针等。

根据本方法需要探针在供受体细胞之间转移的特点，可选择细胞膜荧光探针和细胞质荧光探针组合进行细胞间质膜通道功能的检测。具体可以有下列几种荧光探针组合：Dio荧光探针与CFDA荧光探针组合、Dil荧光探针与CFDA荧光探针组合、DiD荧光探针与CFDA荧光探针组合、DiR荧光探针与CFDA荧光探针组合、Dio荧光探针与CFDA荧光探针组合、Dil荧光探针与Calcein AM荧光探针组合、、DiD荧光探针与Calcein AM荧光探针组合、DiR荧光探针与Calcein AM荧光探针组合等多种组合。

在上述多项组合中，优选Calcein AM和DiI探针组合。Calcein AM荧光探针的分子量994.9，最大激发波长490nm，最大发射波长520nm，该探针可通过细胞膜，进入细胞质后被细胞酯酶降解成不渗透细胞膜的绿色荧光性钙黄绿素，该绿色荧光产物可通过细胞间质膜通道在细胞间自由扩散，该探针满足细胞间物质转移的细胞间质膜通道功能指示荧光探针的条件。Dil荧光探针的分子量933.88，最大激发波长549nm，最大发射波长565nm，该探针为亲细胞膜探针，进入细胞后可侧向扩散使整个细胞膜被染为红色，可被激发出很强的红色荧光，并可长期与细胞膜稳定结合而不向周围细胞扩散，该探针满足对细胞膜进行标记的荧光探针的条件。Calcein AM和DiI荧光探针组合可在最大程度上凸显红色和绿色荧光的较大的色差对比，使得无论是在荧光显微镜下还是流式细胞计数仪工作条件下都能较快识别荧光探针在相邻细胞质膜通道的传递情况。

申请人通过对不同探针标记模式的深入研究，选择了Calcein AM和DiI探针对供体细胞进行双标记而对受体细胞无标记作为共培养的细胞标记模式。

其中在步骤3)中，Calcein AM探针的浓度为1-10μM，优选5μM；DiI探针的浓度为1-15μM，优选4μM。

在步骤4)中，供受体细胞的比例在1∶25-1∶100之间，优选1∶50。为了提高细胞贴壁效率，可提前对培养板进行细胞粘附剂的预处理。

在步骤5)中，用流式细胞计收集细胞，其FL1通道测定Calcein AM信号，FL2通道测定DiI信号。通常而言，总计数1,0000个细胞，每个样品的分析时间为20～50秒，以供体细胞将Calcein AM荧光探针传递至受体细胞的确定为单阳性细胞，根据各细胞的比例计算Te值，Te值＝单阳性细胞数/供体细胞数×100％。以Te值表示结果的绝对值，在步骤6)中以受试组与对照组Te值的百分比表示结果的相对值Te_R。通过所述绝对值或者相对值可以筛选可疑促癌剂，并可以定量比较不同促癌剂的促癌活性的大小。

本申请中之所以采用流式细胞计对阳性细胞计数，其原因是流式细胞计快速、高效、准确。申请人通过实验发现，采用常规荧光酶标仪无法区分受体细胞Calcein AM荧光强度的增强，不适于在荧光探针转移机理上测定细胞间质膜通道的功能。而流式细胞计能够准确地显示受体细胞Calcein AM荧光强度的增强，由此能够实现对促癌活性的定量检测。

另一方面，本发明提供了一种待测物是否为促癌剂的体外筛选方法，包括以下步骤：

1)适宜的细胞模型，按照相应细胞培养条件培养细胞；

2)之后用消化液消化细胞，按照所需量分为供体细胞和受体细胞培养箱静置备用；并分别将供体细胞和受体细胞分为受试组和对照组；

3)在供体细胞中同时加入两种荧光探针，受体细胞静置备用；同时，在受试组的供体细胞和受体细胞中加入待测物；两组供体细胞在室温下孵育一段时间；

4)将受试组和对照组的供体细胞和受体细胞分别按比例混合培养于培养板中；在受试组的混合培养细胞中加入待测物；经过一段时间孵育，使受试组和对照组的待测细胞分别流经流式细胞计，通过流式细胞计分别测量受试组和对照组的供体细胞将其中一种荧光探针转移至受体细胞的单阳性细胞个数；

5)分别计算对照组和受试组的Te值，分别用Te_con和Te_test表示，Te＝单阳性细胞数/供体细胞数×100％；

6)计算受试组待测物的Te相对值，用Te_R表示，Te_R＝Te_test/Te_con×100％；根据待测物的Te_R评价期是否为促癌剂以及促癌活性大小。

在本发明中，对照组可以包括阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可以选择本领域公知的促癌剂，例如佛波酯(TPA)、二噁英(TCDD)。阴性对照可以为空白对照或者溶剂对照。

通过测量阳性对照组、空白对照、溶剂对照以及受试组的Te值，比较各组Te的大小，就可以定量获得待测物质促癌活性的大小。所述待测物可以是本领域任何可疑的促癌剂，例如金属、霉菌、化合物、蛋白、农药等，所述金属例如镉、砷；化合物可以为例如多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯醚等；蛋白可以为例如LPS、TNF-α、IL-6等；霉菌可以为例如黄曲霉、赫曲霉、硫色曲霉等；农药可以为例如有机氯农药、有机磷农药等。

通过Te的相对值可以获知待测物相对于阳性对照的促癌活性的大小，由此确定该待测物是强致癌物、可疑致癌物、非致癌物等。其中当Te_R＜90％、80％、70％、60％、50％至更低时，表明该待测物具有促癌活性，即该待测物为致癌物。

下文将结合附图对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过下文的描述，本发明的各个方面将变得显而易见，其中附图并不是对本发明的限制，而是通过举例的方式描述本发明的实施。

附图说明

图1的图形显示了不同荧光探针浓度对细胞的毒性作用；

图2A-2D显示了用不同浓度的Calcein AM荧光探针对细胞进行标记并随时间变化的荧光图像，其中图2A为标记后0小时的荧光图像，图2B为标记后8小时的荧光图像，图2C为标记后24小时的荧光图像，图2D为标记后48小时的荧光图像；

图3A-3D显示了采用5μM Calcein AM荧光探针、不同浓度的DiI荧光探针对细胞进行双探针标记并随时间变化的荧光图像，其中图3A为标记后0小时的荧光图像，图3B为标记后8小时的荧光图像，图3C为标记后24小时的荧光图像，图3D为标记后48小时的荧光图像；

图4A和4B显示了不同荧光探针标记方式标记细胞后4和24小时的荧光图像(100X)，其中图4A为细胞培养结束后直接标记荧光探针，消化后混合培养；图4B为细胞培养结束后消化细胞，标记探针后混合培养；

图5A-5D荧光探针标记细胞模型后供/受体细胞不同比例混合培养后不同时间的荧光图像(200X)，图5A的细胞密度为1.5×10⁵/cm²，图5B的细胞密度为2×10⁵/cm²，图5C的细胞密度为3.0×10⁵/cm²，图5D为不同密度培养体系经24小时后的荧光图像；

图6为流式细胞仪分析结果图，其中包括了时间、供受体细胞比例的因素；

图7为促癌剂佛波酯的荧光图像，其中分为三组，包括阴性对照、200ng/ml、500ng/ml；

图8A和8B的图形显示了不同浓度TPA对HaCat细胞的促癌活性检测；其中图8A为不同浓度TPA对HaCaT细胞间质膜通道的影响，以Te值表示，n＝12；图8B为该测试结果的拟合标准曲线；与对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；

图9A和9B显示了采用293细胞系作为研究细胞，在不同供受体细胞比例的情况下，不同时间之后的荧光显微镜下荧光图像；图9A为8小时之后的荧光图像，图9B为12小时之后的荧光图像；

图10的图形反应了荧光探针标记293细胞共培养10小时后流式细胞仪分析结果，其中n＝3；

图11A和11B的图形显示了亚砷酸对HaCat细胞的促癌活性检测；其中图11A为不同浓度亚砷酸对HaCaT细胞间质膜通道的影响，以Te值表示，n＝12；图11B为图11A检测结果的拟合标准曲线；与对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；

图12A和12B的图形显示了二甲基胂酸对HaCat细胞的促癌活性检测；其中图12A为不同浓度亚砷酸对HaCat细胞间质膜通道的影响，以Te值表示，n＝12；图12B为图12A检测结果的拟合标准曲线。

具体实施方式

1.建立稳定的荧光探针标记细胞模型

1.1细胞培养

选择人永生化表皮HaCat细胞(CCTCC，中国典型培养物保藏中心)，用含10％胎牛血清和青链霉素双抗(青霉素100U/mL；链霉素100μg/mL)的MEM培养基，于37℃、5％CO₂条件下培养。用0.25％胰蛋白酶(含0.03％EDTA)消化对数期生长期的细胞，2～3天传代一次。

1.2荧光探针准备

Calcein AM(C-3099，Molecular Probes)溶液(1mM)分装后于-20℃避光保存备用。DiI(D-282，Molecular Probes)粉剂用DMSO配置成2mM的储备液，分装后于-20℃避光保存备用。

探针稀释液：葡萄糖溶于灭菌双蒸水中配置成0.3M的葡萄糖使用溶液，4℃保存备用。1.3荧光探针标记

按照以下步骤对供体细胞进行荧光探针标记：

①按照相应细胞培养条件培养细胞生长至80％～90％融合；

②弃培养液，PBS清洗细胞2次，用消化液消化细胞，培养液收集细胞后，调整细胞浓度为1×10⁶细胞/mL，按照所需量分为供体细胞和受体细胞(供体细胞：受体细胞≥1∶50)；供体细胞经1000r/min离心3min，弃上清液；受体细胞培养箱静置备用；

③PBS缓冲液清洗供体细胞2次，1000r/min离心3min，弃上清液；

④用0.3M葡萄糖溶液稀释探针，供体细胞中同时加入两种荧光探针。每1×10⁶个细胞中加入1mL荧光探针染色液，轻轻混匀，37℃孵育30min，避光并不时摇动。

⑤孵育结束后，1500r/min离心3min，弃染色液；

⑥PBS清洗供体细胞2次，1500r/min离心3min，离上清；

⑦培养液重悬供体细胞，并使其浓度为1×10⁶细胞/mL。

1.3.1荧光探针标记细胞的存活率测定

在荧光探针标记细胞过程中，本申请的申请人研究了采用不同浓度的荧光探针，检测了细胞存活率，由此分析荧光探针浓度对细胞是否具有毒性。具体方法如下：

按照上述荧光探针标记方法标记细胞，采用正交实验测定不同浓度的荧光探针对细胞存活率的影响。浓度及分组为：阴性对照组、5μM Calcein AM、10μM Calcein AM、5μM DiI、10μM DiI、5μM Calcein AM+5μM DiI、5μM Calcein AM+10μM DiI、10μM Calcein AM+5μMDiI、10μM Calcein AM+10μM DiI。标记完成后每1×10⁶个细胞加入500μL PBS重悬细胞，取100μl细胞悬液1∶1加入0.4％的胎盘蓝染液，计时染色3min。取适量染色的细胞悬液滴加于细胞计数板上，拍照计算并统计结果。图1显示了不同探针处理方式对细胞存活率的影响(n＝6)，从中可以看出，各荧光探针的单独标记组均没有明显的细胞毒性，两种荧光探针共同标记时，高剂量组(10μM Calcein AM+10μM DiI)呈现出明显的细胞毒性，细胞存活率降至89.65％，经LSD分析，*P＜0.05。

1.3.2选择荧光探针标记浓度

1.3.2.1 Calcein AM探针浓度选择

对于Calcein AM探针，根据相关的现有技术，选择5μM和10μM两个浓度对其荧光强度和细胞状态进行观察，以选取合适的Calcein AM荧光探针浓度。按照上述方法给细胞标记Calcien AM荧光探针，浓度分别为5μM和10μM。标记完成后，分别于0、8、24、48小时，使用荧光显微镜观察细胞与荧光探针的结合状况。结果参见图2A-2D，从中可以看出，10μM比5μM Caicein AM组细胞的荧光强度略有增强，但5μM和10μM Caicein AM组均在24小时后荧光强度明显衰减，10μM的Calcein AM与5μM相比在荧光强度的稳定时间上无明显优势；故选择5μM作为优先使用的Calcein AM探针浓度。

1.3.2.2 DiI荧光探针浓度的选择

本申请还研究了在5μM Calcein AM探针浓度下，采用不同浓度的DiI荧光探针对细胞进行荧光标记的效果。

对DiI探针浓度的考察依次选择10、8、6、4、2、1μM六个浓度，并分别与5μM的CalceinAM同时进行双标记。按照1.3中的方法给细胞标记Calcein AM和DiI探针，5μM的CalceinAM分别与10、8、6、4、2、1μM的DiI同时标记。标记完成后，分别于0、8、24、48小时，使用荧光显微镜观察细胞与荧光探针的结合状况。

从图3A至3D的荧光图像可以看出，随着时间的延长，Calcein AM荧光强度逐渐减低，而DiI荧光强度依然较强，两种荧光探针双标记后的细胞叠加荧光信号由黄(Calcein AM与DiI叠加信号)转红(DiI信号为主)。0、8和24小时时间点的结果显示，六个DiI浓度中，10、8、6μM DiI组DiI信号较强，2、1μM DiI组Calcein AM信号较强，4μM DiI组Calcein AM与DiI信号相当，细胞显示均一的黄色(叠加信号)；故选择4μM的DiI作为技术建立使用的DiI探针浓度。

综上所述，本发明中优选采用的探针浓度为：Calcein AM荧光探针5μM，DiI荧光探针4μM；每1×10⁶个细胞中加入1mL荧光探针染色液，37℃避光孵育30min。从图1中可以看出，在上述浓度下荧光探针单标或双标对细胞均不产生任何毒性作用。

1.3.3荧光探针标记方式

对细胞的处理方式有以下两种：方式一，为细胞培养结束后直接标记荧光探针，消化后混合培养；方式二，为细胞培养结束后消化细胞，标记探针后混合培养。以下研究对这两种探针标记方式进行考察。

1.3.3.1细胞标记探针(方式一)

①按照HaCat细胞培养条件培养细胞生长至80％～90％融合；

②弃培养液，PBS清洗细胞3次；

③用0.3M葡萄糖溶液稀释探针，使得Calcein AM的终浓度为5μM，DiI的终浓度为4μM；每1×10⁶个细胞中加入1mL荧光探针染色液，轻轻混匀，37℃孵育30min，避光并不时摇动；

④弃培养液，PBS清洗细胞2～3次；

⑤0.25％胰酶(含0.03％EDTA)消化细胞，培养液收集细胞后，按1.5×10⁵/cm²的密度将细胞接种于培养板中培养；

⑥分别于4和24小时使用荧光显微镜观察结果。

1.3.3.2细胞标记探针(方式二)

①按照HaCat细胞培养条件培养细胞生长至80％～90％融合；

②弃培养液，PBS清洗细胞2次，用0.25％胰酶(含0.03％EDTA)消化细胞，培养液收集细胞后，1000r/min离心3min，弃上清液；

③PBS缓冲液清洗细胞2次，1000r/min离心3min，弃上清液；

④用0.3M葡萄糖溶液稀释探针，使得Calcein AM的终浓度为5μM，DiI的终浓度为4μM；每1×10⁶个细胞中加入1mL荧光探针染色液，轻轻混匀，37℃孵育30min，避光并不时摇动。

⑤孵育结束后，1500r/min离心3min，弃染色液；

⑥PBS清洗细胞2次，1500r/min离心3min，离上清；

⑦培养液重悬细胞后，按1.5×10⁵/cm²的密度将细胞接种于培养板中培养；

⑧同一条件下，分别于4和24小时使用荧光显微镜观察结果。

在图4A和4B中，A1-D1为方式一结果；A2-D2为方式二结果。从中看出，在装载探针浓度与时间相同的条件下，无论是用单个探针标记还是用双探针标记，方式二均较方式一的荧光强度强，原因可能与细胞消化后与探针接触充分有关；技术建立选择探针标记的方式为方式二，即消化细胞后标记荧光探针再进行混合培养。

1.4细胞对照

以2.5×10⁵/cm²的密度分别接种供体细胞和受体细胞，制备细胞对照组，用于仪器分析信号的调试。

1.5混合培养

培养液重悬细胞后，按2.5×10⁵/cm²的密度，将供体细胞和受体细胞按1∶50的比例混合培养于24孔培养板中。为了提高细胞贴壁效率，可提前对培养板进行细胞粘附剂的预处理。1.6选择荧光探针标记细胞共培养细胞密度、比例和最佳检测时间

根据以上研究结果，两种荧光探针标记细胞模型共培养体系中Calcein AM探针浓度为5μM，DiI探针浓度为4μM，采用先消化细胞后标记荧光探针的方式，同时Calcein AM和DiI对供体细胞进行双标记，而受体细胞为裸细胞。按照以上研究建立荧光探针标记细胞模型并进行供/受体细胞的共培养，优化选择荧光标记细胞模型的共培养体系条件，包括共培养细胞的密度、供/受体细胞的比例及最佳的检测时间。

按照1.3.3.2方法给细胞标记荧光探针，供体细胞双标记Calcein AM(5μM)和DiI(4μM)，受体细胞不做标记。细胞标记结束后，分别按1.5×105/cm2、2×105/cm2、3×105/cm2的密度，每个密度中供体细胞与受体细胞分别按1∶10、1∶20、1∶50的比例，将细胞接种于培养板中混合培养。分别于4、8、12、24小时使用荧光显微镜观察结果。

在图5A至5D中，每张图均为叠加Calcein AM和DiI信号的结果，其中，黄色的双阳性(Calcein AM和DiI叠加信号)细胞为供体细胞，无荧光信号的为受体细胞，绿色的单阳性(Calcein AM信号)细胞为供体细胞传递Calcein AM进入受体细胞的阳性细胞，表明相邻细胞间存在荧光探针的转移。

在图5A至5C中看出，在三个检测时间点中，随着共培养体系细胞密度的增加，供体细胞向受体细胞传递Calcein AM荧光探针的细胞数量依次增加；1.5×10⁵/cm²密度下，共培养后的Calcein AM单阳性细胞明显小于2×10⁵/cm²和3×10⁵/cm²密度的细胞组；2×10⁵/cm²和3×10⁵/cm²密度细胞组，供体细胞与周围细胞密切接触，能向周围多个受体细胞传递绿色荧光信号。故该建立技术的细胞密度可选在(2～3)×10⁵/cm²之间。

在三种比例的共培养体系中，在4小时观察时均出现Calcein AM荧光探针转移的现象；随着时间的延长，供体细胞中的荧光探针向受体细胞中的转移逐渐增多；8小时和12小时的结果发现，一个供体细胞可向周围多个细胞传递(至少20个)绿色荧光探针，距离供体细胞越近的细胞其Calcein AM绿色荧光越强，随着距离的增加，绿色荧光强度逐渐降低，呈现出具有层次感绿色荧光分布图像；24小时由于细胞分裂等因素的影响，所有细胞均呈现均匀一致的弱绿色荧光信号，由供体细胞传递的层次分布的绿色荧光分布现象消失。故最佳检测时间在8～12小时之间。

在最佳检测时间(8小时或12小时)时，三种细胞密度共培养体系下，一个供体细胞均可向周围多个(至少20个)受体细胞传递Calcein AM绿色荧光信号。故该技术的较好供/受体细胞比例大于1∶20。

综上所述，荧光探针标记细胞模型的共培养细胞密度选择在(2～3)×10⁵/cm²之间；荧光探针标记细胞模型的最佳检测时间选择在8～12小时之间；荧光探针标记细胞模型的供/受体细胞比例选择在1∶20以上。

2.待测物处理

(1)细胞分组：将混合培养的细胞分为对照组、溶剂对照组(水/有机溶剂/其他)、受试组、每组至少3个平行样。

(2)剂量选择：受试组的剂量选用以不引起一般细胞毒性反应为原则。细胞培养液将受试物稀释至所需浓度，溶剂对照组以受试组含有的溶剂量为准。

(3)受试物处理：以上混合培养的细胞经3小时培养后，进行受试物处理。弃细胞培养液，每孔加入1mL制备好的处理液。

(4)处理时间：根据不同的受试物，设定处理时间为3～10小时。

3.仪器定量分析

(1)收集细胞

①弃培养液，PBS清洗细胞2次，用0.25％胰酶(含0.03％EDTA)消化细胞(供体细胞、受体细胞、混合培养各组)，PBS缓冲液收集细胞，经1000r/min离心3min，弃上清液；

②PBS缓冲液清洗供体细胞1～2次，1000r/min离心3min，弃上清液；

⑧加入0.5mL PBS缓冲液重悬细胞，冰上保存，待机检测。

(2)仪器检测

FL1通道采用氩离子激光(488nm)，测定Calcein AM(激发波长490nm)信号；FL2通道采用氦氖激光(633nm)，测定DiI(激发波长549nm)信号；FL1和FL2荧光测量使用对数放大器。设置细胞进样流速为300～400细胞/秒，总计数10000个细胞，每个样品的分析时间为20～50秒，采用二维点图表示不同荧光信号细胞的分群结果。

(3)结果处理

图6显示的结果为二维点图分析结果，每张二维点图的横坐标为FL1通道(Calcein AM信号)，纵坐标为FL2通道(DiI信号)。以供体细胞和受体细胞的结果为标准，对不同荧光信号的细胞进行划分。图6中的划分结果为：左下象限为受体细胞，右上象限为供体细胞，右下象限为供体细胞传递Calcein AM荧光探针至受体细胞的单阳性细胞。

根据各细胞的比例计算Te值：Te值＝单阳性细胞数/供体细胞数×100％。

以Te值表示结果的绝对值，以受试组与对照组Te值的百分比表示结果的相对值。必要时进行相应的统计学处理，如T检验或方差分析。

3.1供受体细胞比例、检测时间的优化

在图6所示的图中，采用了四种供受体细胞比例，对于每一个比例的细胞，在0～12小时之内，随着检测时间的延长，双阳性供体细胞向周围受体细胞传递的Calcein AM荧光探针逐渐增多，单阳性细胞数目逐渐增多，Calcein AM荧光强度逐渐增强。但24小时的检测结果显示，双阳性供体细胞与单阳性细胞的强度均下降，单阳性细胞的数目不增反减，表明24小时探针稳定性降低，结果不可靠。最佳检测时间在8～12小时。

时间/比例	1∶5	1∶10	1∶20	1∶50
					4h	4.98	9.00	10.47	9.14
8h	5.15	9.87	19.16	38.09
					12h	5.15	9.89	19.11	39.95
24h	5.16	9.85	16.80	17.93

表1荧光探针标记法测定细胞间质膜通道的Te值(％)

表1显示了不同供受体细胞比例随时间变化的Te值。从该表中看出，在不同的供/受体细胞比例下，在4小时处，1∶5和1∶10比例的受体细胞已饱和，8小时1∶20比例的受体细胞已饱和，直至12小时1∶50的受体细胞仍未饱和，传递效率Te值(transfer effects)为39.95，说明一个供体细胞可通过细胞间质膜通道向周围约40个细胞传递荧光探针，而样品分析时供/受体细胞比例应大于Te值，对于HaCat细胞，观察时间为8～12小时时，1∶50为最佳比例。若观察时间缩短，则可适当降低供/受体细胞的比例。同时需要注意的是，不同细胞的细胞间质膜通道不同，功能弱的细胞可降低供/受体细胞比例，功能强的可增加供/受体细胞比例。

从以上结果分析可知，流式细胞计可以实现细胞间质膜通道的定量检测，分析时间小于1min，实现快速促癌活性检测技术的建立。仪器分析的最佳检测时间为8～12小时；供/受体细胞(HaCat细胞)的较好比例为1∶50。

而且从图6中可以看出，即使采用不同的供受体细胞比例，在各个比例组在4h，8h处，随着时间的延长，单阳性细胞数目逐渐增多，Te值逐渐增加，具有较好的时间反应关系，其说明流式细胞术能够较好的检测细胞间质膜通道(促癌活性)。

4.促癌剂佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)的促癌活性检测

TPA为皮肤癌症促癌剂，能够抑制皮肤细胞等多种细胞的细胞间质膜通道，研究选用TPA作为阳性对照，使用该技术检测TPA对HaCat细胞间质膜通道功能的抑制效应。

按照之前获得的各参数条件，采用1.3.3.2方式二的方法给细胞标记荧光探针，给供体细胞双标记Calcein AM(5μM)和DiI(4μM)，受体细胞不做标记。细胞标记结束后，按2×105/cm2的密度、供/受体细胞1∶30的比例，将细胞接种于培养板中混合培养；待细胞贴壁2小时后进行染毒，剂量分别为0、200、500ng/mL，每1.5～2小时换一次染毒液，2次换液后于6小时使用荧光显微镜观察结果。

图7中的图像通过荧光显微镜观察，其均为Calcein AM和DiI信号叠加的结果，图中黄色的细胞为双阳性供体细胞，无荧光信号的细胞为受体细胞，绿色的细胞为供体细胞传递Calcein AM至受体细胞的单阳性细胞。从图7中可以看出，不同剂量TPA作用于HaCat细胞后，观察到TPA对细胞间质膜通道具有抑制作用，200ng/mL与500ng/mL的TPA能够抑制HaCat细胞的细胞间质膜通道，表现为供体细胞向周围受体细胞传递的荧光探针减少，单阳性细胞的数量和荧光强度均有所减弱，并呈现出随剂量增高抑制效应增强的结果，说明建立荧光探针细胞模型可用于促癌活性的测定。

之后，用流式细胞仪检测Te值，以评价是否可以通过Te值来评价其促癌活性。按照以上方法给细胞标记荧光探针，供体细胞双标记Calcein AM(5μM)和DiI(4μM)，受体细胞不做标记。细胞标记结束后，按2×10⁵/cm²的密度，1∶30的比例，将细胞接种于培养板中混合培养；待细胞贴壁2小时后进行染毒，剂量分别为0、50、100、200、400、800ng/mL，每1.5～2小时换一次染毒液，2次换液后于6小时采用胰酶消化法收集细胞，使用流式细胞仪测定结果。

图8A和8B显示了不同剂量TPA对供受体的细胞间质膜通道的影响情况，用Te值表示。图8A和8B的结果与荧光显微镜观察的结果相一致，不同剂量TPA作用于HaCat细胞后，对细胞间质膜通道具有抑制作用，经流式细胞仪检测，其Te值随着剂量的升高逐渐降低，随着TPA浓度的增加，对HaCat细胞间质膜通道的抑制作用增加，提示其促癌活性越强；TPA浓度大于100ng/ml时，其Te绝对值与对照组相比，已经表现出显著性差异，提示该化学物质对皮肤来源的HaCat细胞具有明显的促癌活性，根据公式Te_R＝Te_test/Te_con×100％，计算其Te相对值即Te_R，为90.1％。

而且图8B显示了TPA对Te值具有良好的剂量-反应关系，即其能够反映出TPA对细胞间质膜通道的影响同样具有剂量-反映关系，进一步验证了TPA作为已知促癌剂在细胞水平上表现的细胞毒性，由此导致肿瘤的发生。

可见该检测方法对能够较好的检测促癌物对细胞间质膜通道的抑制作用，即实现对促癌活性的定量检测，同时能够根据Te尤其是Te相对值的大小对待测物是否为促癌剂及其促癌活性大小进行定量检测。

5.肾上皮细胞(293细胞)检测技术建立

293细胞为人肾上皮细胞系，研究中选用该细胞系作为肾癌促癌活性检测的靶细胞，建立针对肾癌促癌活性的荧光探针标记细胞模型及促癌活性检测技术，获得Te值等技术参数。环境污染物中的重金属镉和铅等与肾癌的发生有关，检测技术在293细胞中的验证，适用于与肾癌有关的污染物促癌活性的检测。

5.1荧光显微镜观察法

(1)准备荧光探针标记细胞模型

①293细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基(含青、链霉素双抗)，在37℃、5％CO₂条件下培养，0.25％胰酶消化液消化。按照293细胞培养条件培养细胞生长至80％～90％融合；

②弃培养液，PBS清洗细胞2次，用0.25％胰酶(含0.03％EDTA)消化细胞，培养液收集细胞后，1000r/min离心3min，弃上清液；

⑧PBS缓冲液清洗细胞2次，1000r/min离心3min，弃上清液；

④用0.3M葡萄糖溶液稀释探针，供体细胞双标记Calcein AM(5μM)和DiI(4μM)，每1×10⁶个细胞中加入1mL荧光探针染色液，轻轻混匀，37℃孵育30min，避光并不时摇动。

⑤孵育结束后，1500r/min离心3min，弃染色液；

⑥PBS清洗细胞2次，1500r/min离心3min，离上清；

⑦培养液重悬细胞后，按2×10⁵/cm²的密度，每个密度中供体细胞与受体细胞分别按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的比例，将细胞接种于培养板中混合培养；

⑧分别于8、12小时使用荧光显微镜观察结果。

(2)观察结果

图9A显示了在不同供受体细胞比例的情况下，经8小时后的荧光显微镜下荧光图像，图9B显示了在不同供受体细胞比例的情况下，经12小时后的荧光显微镜下荧光图像。从中可以看出，293细胞的供/受体细胞按照不同比例混合培养后，均表现出少量的Calcein AM荧光探针转移现象，12小时的1∶5组转移最多。

5.2流式细胞仪分析法

(1)建立荧光探针标记细胞模型

按照5.1中的方法给细胞标记荧光探针，给供体细胞双标记Calcein AM(5μM)和DiI(4μM)，受体细胞不做标记。细胞标记结束后，按2×10⁵/cm²的密度，每个密度中供体细胞与受体细胞分别按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的比例，将细胞接种于培养板中混合培养；于10小时采用胰酶消化法收集细胞，使用流式细胞仪分析结果。

(2)仪器分析结果

图10显示了荧光探针标记293细胞共培养后10小时流式细胞仪分析结果，在相同供/受体细胞比例时(1∶50)，293细胞的10小时最大Te值为18.56，而HaCat细胞的12小时Te值达到39.95。由此可以得出，293细胞的细胞间质膜通道功能弱于HaCat细胞；即不同的细胞系其检测到的Te值不同，因此，在评价可疑促癌物的促癌活性时，较好是采用Te的相对值变化，由此对作用于不同靶器官或靶细胞的促癌剂能够客观地评价其促癌活性的相对强弱。检测实际环境样品时，可参考该检测时间和Te值设计检测时间和共培养细胞比例，完成实际环境样品促癌活性的检测。

对293细胞系的研究表明，本申请建立的促癌活性检测技术不受细胞类型的限制，可用于表达细胞间质膜通道的不同靶细胞；可以根据待测物的可疑靶器官选择特定的细胞类型，由此能够更加准确地鉴定或者筛选待测物是否为特定组织或器官的促癌剂及其活性大小。

6.亚砷酸和二甲基胂酸的促癌活性检测

砷是一种类金属元素，其广泛存在于自然界的土壤、水、空气和食物中。大量的流行病学及临床资料表明，砷及其化合物具有明确的致癌作用，长期低剂量砷暴露可导致皮肤癌、肺癌以及膀胱癌等的发生。国际癌症机构(IARC)于1979年将无机砷正式确认为人类致癌物，但有关砷致癌的机制一直不很清楚。近年来，有研究指出，砷可能是一种促癌物或助癌物，其中无机砷如亚砷酸的促癌活性较强，但是无机砷在人体内的代谢产物二甲基胂酸的遗传毒性如导致DNA损伤的能力较强，而其非遗传毒性如促癌活性较弱。本申请选用不同浓度亚砷酸和二甲基胂酸作为受试物，使用本申请建立的技术检测亚砷酸和二甲基胂酸对HaCat细胞间质膜通道的抑制效应。

(1)制备荧光探针标记细胞模型

采用1.3.3.2中方式二的方法给细胞标记荧光探针，供体细胞双标记Calcein AM(5μM)和DiI(4μM)，受体细胞不做标记。细胞标记结束后，按2×10⁵/cm²的密度，1∶30的比例，将细胞接种于培养板中混合培养；待细胞贴壁2小时后进行染毒，对于亚砷酸，其剂量分别为0、0.005、0.05、0.5和5umol/l；对于二甲基胂酸，其剂量分别为0.001、0.01、0.1和1.0mmol/L，每1.5～2小时换一次染毒液，2次换液后于6小时采用胰酶消化法收集细胞，使用流式细胞仪测定结果。

(2)仪器分析结果

图11A和11B显示了不同剂量亚砷酸对HaCat细胞供受体的细胞间质膜通道的影响情况，用Te值表示，其中n＝12。当亚砷酸的浓度为0.05μmol/1时，其Te值相对于对照组具有显著性变化，此时，Te_R为83.3％；从图11B中可以看出，随着亚砷酸浓度的升高，其Te相对值呈现良好的剂量-反应关系(浓度1μmo/1以下)；不同剂量的亚砷酸作用于HaCat细胞后，对细胞间质膜通道功能具有程度不同的抑制作用。

图12A和12B显示了不同剂量二甲基胂酸对HaCat细胞供受体的细胞间质膜通道的影响情况，用Te值表示，其中n＝12。可以看出，二甲基胂酸在各个剂量水平Te_R没有显著变化，即对HaCat细胞的细胞间质膜通道功能几乎没有影响。从图12B的拟合曲线可以看出，不同剂量之间不存在明显的剂量反应关系。

(3)结论

根据文献报道，无机砷在人体内的代谢产物二甲基胂酸的遗传毒性如导致DNA损伤的能力较强，而其非遗传毒性如促癌活性较弱。

根据本发明分别对亚砷酸和二甲基胂酸对细胞间质膜通道的影响的研究发现，随着亚砷酸浓度的增加，其对HaCat细胞的细胞质膜通道功能的抑制作用增加，提示其促癌活性越强，当亚砷酸浓度大于0.05μmo/l时，其对皮肤来源的HaCat细胞具有明显的促癌活性，而且该促癌活性具有明显的剂量反应关系，其验证了亚砷酸在细胞水平上的非遗传毒性，而且通过对该剂量反应关系的进一步研究，本领域技术人员可以得到亚砷酸产生细胞毒性的最小浓度或者阈值。

另一方面，本发明的研究表明不同浓度二甲基胂酸对HaCat细胞的细胞质膜通道功能没有明显的影响，提示二甲基胂酸的致癌作用可能与细胞间质膜通道介导的促癌机制无关。

综上所述，本发明的所述方法验证了现有技术中对无机砷和有机胂的促癌机制的论述。即本发明的方法不仅能够鉴定或者评价可疑促癌物其非遗传毒性的促癌活性大小，还能鉴定其促癌机制。

从上文的各个具体实施方式中可以看出，本发明建立的促癌活性检测方法具有以下优点：

(1)仪器分析样品条件一致、稳定；每个样品的分析时间小于1min，提高了检测的速度，克服了人工计数或人工处理样品的不确定性。

(2)仪器分析可获得各个象限的细胞数，通过计算单阳性细胞与供体细胞的比例，获得Te值，实现定量测定。

(3)所用细胞可根据受试物的促癌活性靶器官选择，范围较广，克服了代谢协同法受特性细胞系限制的不足。

(4)经过对亚砷酸和二甲基胂酸的实际测试，本申请所建立的方法可特异地用于检测化学物质的促癌活性检测，并可通过可疑促癌剂抑制细胞间质膜通道的Te值明确该促癌剂的促癌活性大小，因此，本申请所建立的方法可作为化学促癌剂的筛选方法。

(5)该方法检测快速、可定量，可为工业化学品、环境污染物以及合成药物的促癌活性的筛查及环境毒理学基础研究提供技术支持。

上述具体实施方式仅仅是用来描述本发明的实施，并不是对本发明范围的限制，本领域技术人员很容易想到对其进行简单的变形、修改，而这些变形、修改均在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种定量检测待测物的促癌活性的方法，包括以下步骤：

1)选择适宜的细胞模型，按照相应细胞培养条件培养细胞；

2)之后用消化液消化细胞，按照所需量分为供体细胞和受体细胞培养箱静置备用；

3)在供体细胞中同时加入两种荧光探针，孵育一段时间；在供体细胞中同时加入两种荧光探针，受体细胞静置备用；同时，在受试组的供体细胞和受体细胞中加入待测物；两组供体细胞在室温下孵育一段时间；

4)将受试组和对照组的供体细胞和受体细胞分别按比例混合培养于培养板中；在受试组的混合培养细胞中加入待测物；经过一段时间孵育，使受试组和对照组的待测细胞分别流经流式细胞计，通过流式细胞计分别测量受试组和对照组的供体细胞将其中一种荧光探针转移至受体细胞的单阳性细胞个数；

5)分别计算受试组待测物和对照组的Te值(转移效率，Transfer effects)，分别用Te_con和Te_test表示，Te值＝单阳性细胞数/供体细胞数×100％；

6)计算该待测物的Te相对值，用Te_R表示，Te_R＝Te_test/Te_con×100％；根据待测物的Te_R评价待测物的促癌活性大小，Te_R越小表明该待测物的促癌活性越强。

2.如权利要求1所述的方法在体外筛选促癌剂中的应用，其中当Te_R＜90％时，该待测物被鉴定为促癌剂。

3.权利要求1或2所述的方法，其中细胞模型采用适合贴壁生长的任何细胞系。

4.如权利要求3所述的方法，其中细胞模型选自以下任一个：源于肾脏的293细胞系、来源于皮肤的HaCat细胞、来源于肝脏的HepG2细胞和IAR20细胞、来源于神经系统的SH-SY5Y细胞、原代培养的正常心肌细胞、皮肤角阮细胞或成纤维细胞、肝脏细胞、人肺腺癌成纤维细胞A549细胞株、人皮肤鳞癌细胞株A431。

5.如权利要求4所述的方法，其中细胞模型为选自HaCat细胞或293细胞。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中两种荧光探针组合选自以下任意一种组合：Dio荧光探针与CFDA荧光探针组合、Dil荧光探针与CFDA荧光探针组合、DiD荧光探针与CFDA荧光探针组合、DiR荧光探针与CFDA荧光探针组合、Dio荧光探针与CFDA荧光探针组合、Dil荧光探针与Calcein AM荧光探针组合、DiD荧光探针与Calcein AM荧光探针组合、DiR荧光探针与Calcein AM荧光探针组合。

7.如权利要求6所述的方法，其中两种荧光探针分别为Calcein AM和DiI探针，Calcein AM探针的浓度为1～10μM，DiI探针的浓度为1～15μM。

8.如权利要求7所述的方法，其中CalceinAM探针的浓度为5μM，DiI探针的浓度为4μM。

9.如权利要求1或2所述的方法，其中供受体细胞的比例在1∶25-1∶100之间。

10.如权利要求9所述的方法，其中供受体细胞的比例为1∶50。