CN104508487B - 用于通过质谱法高度多路复用地定量肽类的方法以及用于其的标记试剂 - Google Patents

用于通过质谱法高度多路复用地定量肽类的方法以及用于其的标记试剂 Download PDF

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Abstract

在此披露了对于肽类的多路复用定量有用的同量异位标记试剂组。这些同量异位标记试剂组包括至少两种同量异位标记试剂的一个集合，该集合具有相同标称质量但不同同位素取代以及因此不同精确质量的第一和第二信息基团。这些标记的样品的质谱分析使用能够充分分辨该第一和第二信息基团的离子的质量分析器，如轨道阱质量分析器，来进行。以上说明的试剂组可以提供相对于常规标记试剂组扩展的、在信息离子定量试验中的一定程度的多路复用，从而减少分析所要求的色谱运行的次数并且改进样品处理量。

Description

用于通过质谱法高度多路复用地定量肽类的方法以及用于其 的标记试剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年10月5日提交的美国临时专利申请系列号61/645,311“用于通过质谱法高度多路复用地定量肽类的方法以及用于其的质量标记(Method for HighlyMultiplexed Quantitation of Peptides by mass Spectrometry and Mass LabelsTherefor)”的优先权权益，这个临时专利申请通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明总体上涉及用于利用同量异位质量标记通过质谱法多路复用地定量肽类的方法，并且更具体地涉及对于提供改进的样品多路复用能力而言有用的一组同量异位质量标记和使用此类质量标记组的方法。
发明背景
同量异位质量标签或标记是一种用于通过质谱法确定跨过多个样品的一种给定的肽的相对丰度的方法。每个样品，典型地代表一个独特的生物条件，与一种标记试剂的一个不同的同量异位变体进行反应。将这些样品混合在一起并且通过MS/MS进行分析。当将一种给定的肽(从所有条件收集的同量异位分子)分离并且碎裂时，从这些不同的标记试剂产生的信息离子(reporter ions)具有不同的标称质量，这鉴别每种肽的来源并且允许跨过样品的肽的相对定量。同量异位质量标记试剂组是从赛默飞世尔科技公司以商品名串联质量标签(TMT)、并且从AB Sciex公司以商品名用于相对和绝对定量的同量异位标签(iTRAQ)可商购的。同量异位质量标签的结构和利用已经广泛地描述于现有技术专利(参见，例如，Schmidt等人的美国专利号7,816,304和Thompson等人的美国专利号7,732,378，这些专利的披露内容均通过引用结合在此)以及科学文献(参见，例如，Ross等人，“使用胺反应性同量异位标记试剂的酿酒酵母中的多路复用蛋白质定量(Multiplexed ProteinQuantitation in Saccharomyces cerevisiaie Using Amine-reactive IsobaricTagging Reagents)”，分子与细胞蛋白组学(Molecular&Cellular Proteomics)，3(12),pp.1154-1167(2004)；和Dayon等人，“使用6路同量异位标签通过MS/MS的人类脑脊髓液中蛋白质的相对定量(Relative Quantification of Proteins in Human CerebrospinalFluids by MS/MS Using6-Plex Isobaric Tags)”，分析化学(Analytical Chemistry)，Vol.80,pp.2921-2931(2008))中。
相当多的努力已经投入到增加该同量异位质量标签系统的“多路复用”能力中。例如，该“六路复用TMT”试剂组具有超过“四路复用iTRAQ”试剂组的额外价值，因为它允许用户用更少的色谱运行来比较更多的样品。该系统的多路复用能力最终受限于可供用于同位素取代的同量异位试剂的信息区域中的原子数量和与引入大量的同位素取代相关联的困难和成本。
授予Schaefer的美国专利申请公开号2010/0029495描述了一种途径，通过提供包括具有相同质量但不同分子结构的信息基团的多种试剂的一组标记试剂来扩展多路复用能力。其技术包括进行一个第二阶段的碎裂(MS3)以导致这些信息离子的碎裂，这样使得每个相同质量信息基团产生在质谱中可以区别的特征产物离子，从而允许将相关强度指定给相应的标记的样品。虽然这种方法可以提供更大程度的多路复用，但进行MS3以区别具有相同质量的不同信息离子的要求使该分析变得复杂，并且可能减少灵敏度和处理量。
发明概述
根据本发明的实施例，提供一组同量异位标记试剂，其中这些标记试剂中的至少两种具有信息基团，这些信息基团具有相同的元素成分和标称(整数)质量但不同的同量异位取代以及因此不同的精确质量；例如，一个信息基团可以具有用13C同位素取代的一个或多个碳，而其他信息基团可以具有用15N同位素(或13C和15N同位素的组合)取代的相应数量的氮。由用这些至少两种试剂标记的肽的电离和碎裂产生的信息离子(例如，在MS/MS分析过程中)具有的精确质量为足够不同的以使得它们在使用轨道阱、傅里叶变换/离子回旋共振(FT/ICR)或其他能够进行高分辨率、精确质量操作的仪器获得的质谱中与彼此分辨。包括具有相同标称质量但不同同位素取代的信息基团的两种或更多种标记试剂可以显著增加具有一种指定的信息基团结构的标记试剂的多路复用能力，从而使得更大数量的样品能够在单一色谱运行内进行分析并且避免了从运行到运行(run-to-run)的变化产生的不确定性，这些不确定性损害直接比较从不同的样品获得的数据的能力。通过本发明的实施例实现的增加的多路复用能力还呈现了增加总样品处理量的优势，因此减少完成一个实验要求的时间量和/或增加在给定时间内可以分析的样品数量。
本发明还提供一种用于多个样品的高度多路复用的MS/MS分析的方法。在某些说明性实现方式中，这些样品可以对应于生物学重复、在一个时间进程中的点、不同的细胞系、该生物系统的各种扰动等等。该方法包括提供一组同量异位标记试剂，其中这些试剂中的至少两种具有信息基团，这些信息基团拥有相同的标称质量和元素成分但具有不同的同位素取代(如在此使用的，如果一个信息基团相对于另一个信息基团具有不同数量的一种取代基，例如13C或15N，那么两个信息基团具有不同的同位素取代)。这些样品中的每一个与该标记试剂组的一种不同试剂反应以产生标记的分析物(例如，包括键合至一种标记试剂的感兴趣的肽的分子)。然后将这些样品组合并且使其经受MS/MS分析，由此将这些标记的分析物(优选)例如通过碰撞活化解离(CAD)在受控条件下分离并且碎裂。由这些标记的分析物的解离产生的产物离子包括信息离子，每种信息离子具有一个特征质量。操作质量分析器以在足够高的分辨率下获取一个MS/MS质谱以使得具有相同标称质量但不同同位素取代的信息离子能够作为分开的峰进行分辨。然后感兴趣的一种或多种分析物的相对量可以从该MS/MS谱中的信息离子强度来确定，由此每个信息离子峰对应于一个不同的样品。
附图简要说明
在附图中：
图1是描绘一种一般的同量异位标记试剂的组分基团的符号图；
图2描绘了六路复用TMT试剂组的成员的同位素变体；并且
图3是描绘了一种使用根据本发明的一个实施例组成的一个同量异位标记试剂组，通过质谱法确定跨过多个样品的给定肽的相对丰度的方法的图。
示例性实施例的详细说明
以下参照某些具体实施例对本发明进行描述。应该认识到，以下描述的实施例通过说明的方式来呈现，并且本发明不应被解释为局限于所披露的实施例，而相反应被给予以下呈现的权利要求书的完整范围。
同量异位标记试剂的结构和合成在本领域中是已知的并且不必在此详细进行讨论。典型地，一种同量异位标记试剂从三个连接的基团或部分形成，如图1中描绘的，由一个信息基团、一个质量归一化基团、和一个反应性基团组成。每种标记试剂具有不同于该组的其他标记试剂的一个信息基团质量(在常规的标记试剂组中，这些信息基团具有不同的标称质量)；这些标记试剂的同量异位特征通过提供一个质量归一化基团来进行，该质量归一化基团具有“抵消”该信息基团的差异质量的一个质量，使得所有复合标称质量是相同的。信息基团和质量归一化基团质量的调整是通过同位素取代实现的，如以下所描述的。该反应性基团与肽的游离氨基末端反应以形成一种标记的分析物，该标记的分析物在质谱仪中进行电离，典型地通过电喷射电离技术。该信息基团通过一个可切割的接头被附接至该质量归一化基团，该可切割的接头在CAD或等价条件下碎裂以释放该信息基团，该信息基团保持电荷并且因此在产物离子谱中是可观察的。
现有可商购的六路复用TMT体系(被称为“TMT-6”并且由赛默飞世尔科技公司的皮尔斯蛋白质生物产品事业部(Pierce Protein Biology Products business)出售)产生具有相同的信息基团C8H16N的六个同位素变体，如图2中示出的。这六个变体对应于具有0、1、2、3、4和5个额外中子的信息基团，分别对应于126、127、128、129、130、和131的标称质量。当将一个额外的中子放置在一个碳原子(12C→13C)上时，质量上的增加(1.00335道尔顿(Da))与当将它放置在一个氮原子上时(14N→15N，0.99703Da)略微不同。例如，以上示出的具有标称质量127的基团是一个13C取代的变体。可替代地，一个具有标称质量127的信息基团可以通过取代15N而不是13C来形成。13C形式比15N形式重6.32毫道尔顿(mDa)。
对于不能精确地将相隔不到一个质量单位的一对离子进行定量的一个质谱系统，该组同量异位标记试剂将结合该信息离子的13C或15N取代的形式，但不是两者一起。然而，如果使用能够精确定量具有6.32mDa的精确质量差的两种种类的质谱仪，那么有可能使用这两种信息离子(13C和15N取代的形式)来编码样品信息。定量在这个实例中给出的信息离子要求分析器的“定量分辨能力”超过20,000(20K)。我们可以定义定量分辨能力为m/dm，其中dm是具有质量m和m+dm的相异离子种类可以精确进行定量的最小质量分离。我们观察到大多数商用仪器对于精确定量要求相邻离子的基线分离。这意味着该定量分辨能力可以是分辨率规格的1/2-1/5。包括轨道阱质谱仪和FT-ICR MS仪器的可商购的FTMS分析器在分辨率上能够远远超过100K，使得该定量分辨能力显然超过20K。某些飞行时间(TOF)仪器也具有超过20K的分辨率，但不清楚它们对于所提出的应用是否具有足够的定量分析能力。
已知轨道阱或其他傅里叶变换分析器的定量分析能力与获取质谱的瞬态持续时间(在此被称为扫描时间)大致成比例。换言之，精确定量相邻的信息离子峰所要求的扫描时间与在这些相邻的信息离子峰之间的精确质量差成反比(应指出，在质谱分析的讨论的背景下，术语“质量”和其变体在此用作所测量的质荷比(m/z)的简写)。诸位发明人已经证实了在用小于32毫秒(ms)的扫描时间进行操作的可商购的轨道阱仪器中精确定量具有6.32mDa精确质量差的峰的能力。在这个实例中，非常高的MS/MS扫描速率，高达30Hz，将是可能的，而不失去分辨和精确定量这些信息离子的相对丰度的能力。如以下将讨论的，更紧密间隔的信息离子峰的精确定量是可行的，但需要更长的扫描时间和因此更低的扫描速率。虽然可商购版本的轨道阱分析器足以提供在可接受的扫描速率下的所要求的分辨能力，但扫描速率和处理量可以通过使用数据采集和处理技术如匹配的滤波线性去卷积而进一步增加。
根据本发明的实施例，具有给定的信息基团结构的一个同量异位试剂组的多路复用能力可以通过包括具有相同的元素成分和标称质量、但不同数量的15N和13C取代(以及因此不同的精确质量)的信息基团来扩展，并且仍可以通过包括具有不同数量的15N、13C和2H取代的标称地同量异位信息基团来进一步扩展。以下给出的表列出了总计36种候选信息基团，每个具有在可商购的TMT-6标记试剂中利用的分子结构并且具有(除了具有126的标称质量的信息离子之外)一个或多个同位素取代。该表表明了对于每个信息基团的标称和精确质量，15N、13C和2H取代的数量，以及差异质量(被指定为Δ质量)，该差异质量代表相对于在具有相同标称质量的信息基团的一个集合内的较低质量的相邻信息基团(即，在该表中上方紧接着出现的信息基团)的精确质量差。当前用于该TMT-6组的信息基团在注释栏中被标记为TMT-6。如该表中所表明的，有可能选择一个11个信息基团的组，该组包括标称质量126的信息基团、加上各自在标称质量127-131下的两种信息基团的一个集合，其中在标称质量127-131下的信息离子中的每一个代表零或与一个或多个13C取代组合的一个15N取代，其中在该组中的每个信息离子与在该组内的相邻信息离子分开至少6.3mDa。如以上所指出的，有可能用具有20K的标称分辨能力的质量分析器定量具有6.3mDa的精确质量差的峰。这五个额外的(相对于该TMT-6组)信息基团在该表的注释栏中被标记为“TMT-11”。
2H取代还可以用于形成一个大得多的信息基团组。添加一个中子到1H来形成2H使它的质量增加1.00628Da。原则上，我们可以形成(8+1)*(16+1)*(1+1)＝306种不同同位素形式的C8H16N，代表所有可能的取代模式。然而，如果我们限制于标称质量126-131的取代(类似于该TMT-6组)，那么存在36种不同的同位素形式。这36种形式包括在以下表中列举出的候选信息基团。
在总计36种候选信息基团之外，可以选择由三十种基团组成的一个组以便所有基团分开2.93mDa或更大；存在六对仅分开0.46mDa。我们从包括到一个30种信息基团的组内的这些对的每一个中选择一种代表性形式。从考虑中排除的六种同位素形式如此指示在该表中。
将要求约40K的标称定量分辨能力来定量具有2.93mDa间隔的信息离子；对于0.46mDa，要求的定量分辨能力大了多于六倍。这个定量分辨能力在轨道阱分析器中是可实现的，但要求的瞬态持续时间(扫描时间)相对于在40K的分辨能力下获得的一个谱长了多于六倍。这样做将显著减少扫描速率(例如，每单位时间获得的质谱的数量)，并且因此在更高的分辨能力下操作质量分析器可能不是使该多路复用能力从30至36增加额外的20％的一个可接受的折中。对应于这三十种剩余信息离子的峰(未由于它们的质量接近在一个标称质量组内的相邻信息离子被排除的那些)可以在用约64ms的扫描时间操作的轨道阱质量分析器中充分分辨。这与高达15Hz的MS/MS扫描速率相兼容。
有可能的是在该表中列出的包括该30种信息基团的组的这些同位素形式中的某些可能是难以合成的，并且因此不能按一种商业上实用的方式来实现。然而，在任何情况下，与能够足够高分辨率地分辨这些标称地同量异位信息离子的通过质谱仪的MS/MS分析组合，使用具有一种或多种信息基团(这些信息基团具有相同的标称质量但不同的同位素取代)的标记试剂，使得比用单位分辨率将可能的高得多的多路复用能力成为可能。
应理解的是，本发明不应被理解为局限于任何具体的信息基团结构。以上讨论的信息基团结构(其用于可商购的TMT-6同量异位标记试剂组，并且具有分子式C8H16N)仅通过一种示意性实例的方式来提供。本发明的原理(其中多路复用能力通过包括具有标称地同量异位信息基团的标记试剂来扩展)可以应用于任何数量的信息基团结构。可以适用于本发明的其他信息基团的实例包括在美国专利号7,294,456、7,732,304、7,816,304、和7,825,069，以及美国专利申请公开号2010/0178710、2010/0029495、2010/0167267、和2011/0111513中描述的那些，这些专利的全部披露内容通过引用结合在此。此外，该新证实的在高扫描速率下精确定量同重素的能力可以激励该TMT试剂的信息区域的重新设计以提供甚至更多同位素组合以进一步增加多路复用能力。
应该进一步认识到，在此描述的高度多路复用的标记试剂组不要求对这些标记试剂的质量归一化和肽反应性基团的任何特殊的适配或修改。更具体地，在这些质量归一化基团上的同位素取代仅需要抵消在这些信息基团之间或之中的标称质量上的差异，而不是补偿精确质量上的差异。应指出这些标记的分析物因此可以展现在它们的精确质量上的差异，但此类差异将是足够小以便不具有对用于MS/MS分析的色谱停留时间或标记的分析物的共分离的实质性影响。
以上说明的标记试剂组可以按与可商购的标记试剂组如TMT-6基本上相同的方式来使用。如图3中所描绘的，该分析包括一个初始步骤310：通过适合于在这些样品中存在的分析物蛋白质和/或肽的纯化和/或衍生化的已知技术分开地并且相同地制备多个样品中的每一个，该步骤还包括免疫亲和性捕获/富集、变性、离心/过滤、和蛋白水解消化。在一个典型的实验中，每个样品可以对应于使用这些标记试剂中的一种对应试剂的一个时间序列的一个不同点以便形成标记的分析物，例如肽。
接下来，将这些制备的样品中的每一个与该同量异位标记试剂组的标记试剂中的一种不同试剂进行混合以产生标记的肽分析物，例如经由将该标记试剂附接到存在于该样品中的肽的氨基末端上，步骤320。如以上所讨论的，该同量异位试剂组将包括至少两种标记试剂的一个集合，其中这两种标记试剂具有的信息集团具有相同的标称质量但不同的同位素取代；这些标记试剂中的其他的将具有不同标称质量的信息基团。将这些制备的和标记的样品混合在一起成为一个单一的组合的样品，步骤330。离线和/或在线色谱分离技术，例如强阳离子交换色谱法，可以用于彼此分离组分或组分的基团以简化质谱分析，根据步骤340。然后使该组合的样品(或其色谱级分)经受使用合适的质谱仪(例如赛默飞QExactive质谱仪或轨道阱Elite质谱仪)的MS/MS分析。如本领域中已知的，此类分析由首先电离该样品混合物，步骤350组成，该步骤例如通过电喷射电离来完成。然后对所产生的离子进行质量选择(使用，例如，一个四极滤质器或离子阱)以分离一种或多种感兴趣的前体离子(即，对应于一种标记的肽分析物的那些)，并且通过CAD或其他技术来将这些前体离子碎裂以产生产物离子，步骤360，该步骤将包括由这些标记的分析物的碎裂产生的信息离子。在步骤370中，信息离子在每个质荷比的特征值处的丰度通过获得在步骤360中产生的产物离子的质谱来确定。如以上所讨论的，该产物离子质谱使用能够并且在足够高以分辨不同同位素成分的标称地同量异位信息离子的一个分辨能力下操作的质谱仪来获得。该质量分析器可以是，例如，轨道阱或FT/ICR分析器。对于每个上述实例，20K的定量分辨能力足以分辨在以上表中鉴定的11种试剂组中的所有信息离子(具有在相邻信息离子之间的6.32mDa的最小间隔)，并且40K的分辨能力足以分辨在30种试剂组中的所有离子(具有2.93mDa的最小间隔)。在该谱中的每个信息离子峰代表并且可指定到一个不同样品，并且在这些样品中存在的一种感兴趣的分析物的相对量可以从在每个特征m/z值处出现的信息离子峰的相对强度来确定，按本领域中所述的方式。
可以利用本领域已知的各种数据处理方法来增加所测量的峰的信噪比并且从而改进该相对定量的精确度。此外，所测量的强度可以进行调整(根据已知方法，如Pappin等人的美国专利号7,105,806中描述的)以将这些标记试剂中的同位素杂质考虑在内，这导致了质量上升和质量下降的侧峰的产生。

Claims (11)

1.一种用于通过质谱法定量测量肽类的同量异位标记试剂组，包括：
多种同量异位标记试剂，每一种试剂包括一个信息基团、一个质量归一化基团、一个肽反应性基团、和一个将该信息基团附接至该质量归一化基团的可切割的接头，该多种同量异位标记试剂中的每一种试剂具有相同的标称质量；
这些同量异位标记试剂中的每一种试剂具有一个信息基团，该信息基团具有的质量不同于其他同量异位标记试剂中的每一种试剂的信息基团的质量，每个信息基团具有相同的元素成分；
其中这些同量异位标记试剂中的至少两种试剂的一个第一集合具有相同标称质量但不同同位素取代的信息基团；
该第一集合的同量异位标记试剂具有相同标称质量但不同数量的13C取代、15N取代和2H取代中至少一个的信息基团；
在该第一集合中的同量异位标记试剂的信息基团的质量彼此相差至少2.93mDa。
2.如权利要求1所述的同量异位标记试剂组，其中这些同量异位标记试剂中的至少两种试剂的一个第二集合具有相同标称质量但不同同位素取代的信息基团，该第二集合的信息基团的标称质量不同于该第一集合的信息基团的标称质量；
该第二集合的试剂具有相同标称质量但不同数量的13C取代、15N取代和2H取代中至少一个的信息基团；
该第二集合的试剂的信息基团的质量彼此相差至少2.93mDa。
3.如权利要求1所述的同量异位标记试剂组，其中该多种同量异位标记试剂中的每一种的信息基团具有以下结构：
4.一种通过质谱法测量肽分析物的相对丰度的方法，包括：
制备多个含肽样品；
使每个样品与多种同量异位标记试剂中的一种不同的试剂进行反应以产生标记的肽，其中：
每一种同量异位标记试剂包括一个信息基团、一个质量归一化基团、一个肽反应性基团、和一个将该信息基团附接至该质量归一化基团的可切割的接头，该多种同量异位标记试剂中的每一种试剂具有相同的标称质量；
这些同量异位标记试剂中的每一种试剂具有一个信息基团，该信息基团具有的质量不同于其他同量异位标记试剂中的每一种试剂的信息基团的质量；并且
这些同量异位标记试剂中的至少两种试剂的一个第一集合具有相同的元素成分和标称质量但不同同位素取代的信息基团；
将这些样品进行组合；
将这些组合的样品电离以产生标记的肽离子；
使这些标记的肽离子碎裂以产生信息离子，这些信息离子具有一个独特地表征这些样品之一的质荷比；并且
使用质量分析器测量这些信息离子在每个特征质荷比处的丰度；
该第一集合的同量异位标记试剂具有相同标称质量但不同数量的13C取代、15N取代和2H取代中至少一个的信息基团；
在该第一集合中的同量异位标记试剂的信息基团的质量彼此相差至少2.93mDa。
5.如权利要求4所述的方法，其中该质量分析器在至少40K的定量分辨能力下是可操作的。
6.如权利要求5所述的方法，其中该质量分析器包括一个轨道阱质量分析器。
7.如权利要求4所述的方法，其中该使这些标记的肽离子碎裂的步骤包括使这些标记的肽离子经受碰撞活化解离(CAD)。
8.如权利要求4所述的方法，其中该制备该多个含肽样品的步骤包括蛋白水解消化每个样品。
9.如权利要求4所述的方法，进一步包括一个通过色谱法来将这些组合的样品色谱分离的步骤。
10.如权利要求4所述的方法，其中这些同量异位标记试剂中的至少两种试剂的一个第二集合具有相同标称质量但不同同位素取代的信息基团，该第二集合的信息基团的标称质量不同于该第一集合的信息基团的标称质量；
该第二集合的试剂具有相同标称质量但不同数量的13C取代、15N取代和2H取代中至少一个的信息基团；
该第二集合的试剂的信息基团的质量彼此相差至少2.93mDa。
11.如权利要求4所述的方法，其中该多种同量异位标记试剂中的每一种试剂的信息基团具有以下结构：
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