CN104491844A - 一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明以聚乙二醇化壳聚糖（PEG-CS）作为包封材料，采用离子凝胶法制备载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，即先将一定浓度的PEG-CS溶液和胰岛素溶液混合，在磁力搅拌下滴加低浓度的三聚磷酸钠（TPP），用盐酸调节pH至5.5，反应完成后，将悬浊液离心，收集微球即可。本发明制备方法简单，条件温和，所得微球生物相容性好，可在模拟肠液中稳定释放7天，具有缓释功能，且可保证药物的生物活性，有望实现胰岛素的口服给药。
Description
技术领域
本发明涉及一种包封胰岛素的方法，尤其是涉及一种关于胰岛素缓释口服制剂的制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
基础胰岛素是治疗糖尿病的主要药物，在1型和2型（也包括其他类型）糖尿病患者的治疗中均起到重要作用，美国糖尿病协会指南中对基础胰岛素治疗的评价是“最有效”。自从基因重组人胰岛素技术使胰岛素的广泛应用成为可能以后，胰岛素皮下注射一直是糖尿病患者的主要给药途径。但皮下注射会造成皮下脂肪萎缩，给患者带来不便与痛苦。为了克服皮下注射的缺点，提高患者的顺应性，改善患者的生活质量，研制使用方便、疗效确切、安全可靠的胰岛素非注射给药剂型，是当前国内外医药界共同关注的课题。
口服给药途径是最传统、方便和易于被患者接受的理想给药方式。但胰岛素口服给药需要克服以下主要问题：①制备、储存和使用过程中如何保持胰岛素的生物活性，稳定胰岛素构型；②如何减少胰岛素分子多聚体形成，促进胰岛素的吸收利用；③如何减轻消化道酶对胰岛素的降解作用等。因此，提出一种可以稳定地包封胰岛素的口服制剂，提高其生物利用度，具有很大的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服治疗糖尿病的药物胰岛素在使用过程中的不足，从而提出一种可以稳定包封胰岛素，实现其口服给药的胰岛素缓释口服制剂的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
（1）将PEG-CS和TPP分别溶于蒸馏水中,得到PEG-CS溶液和TPP溶液；
将胰岛素粉末用盐酸溶解，再用NaOH溶液调节pH至中性，最后用磷酸盐缓冲溶液定容，得到胰岛素溶液；
（2）将PEG-CS溶液和胰岛素溶液混合，并在磁力搅拌下滴加盐酸直至溶液澄清透明；
（3）再将TPP溶液缓慢滴加到步骤（2）澄清透明的溶液中，得到最终反应液；用盐酸调节最终反应液的pH值，滴加完成后继续反应20min，得到悬浊液；
（4）将最终得到的悬浊液离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得到载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，即胰岛素缓释口服制剂。
步骤（1）中PEG-CS的取代度为11.52%，PEG-CS溶液的浓度为2mg/mL。
步骤（1）中TPP溶液的浓度为1mg/ml。
步骤（1）中胰岛素溶液的浓度为5mg/ml。
步骤（1）中，溶解胰岛素粉末的盐酸pH=2，NaOH溶液的浓度为0.1M，磷酸盐缓冲溶液的pH=7.4。
步骤（2）中滴加1M盐酸直至溶液澄清透明。
步骤（3）中PEG-CS溶液和TPP溶液的质量比为2:1；调节最终反应液pH值的盐酸浓度为1M，经盐酸调节后的最终反应液的pH值为5.5。
步骤（4）中悬浊液离心速度为11000r/min。
步骤（1）中PEG-CS是按以下步骤合成的：
称取1g CS（分子量500000）溶解于6 ml的醋酸中，用20ml TEMED·HCL稀释，并加入到三口烧瓶中，测pH值为5；然后加入EDC和NHS，30min后按摩尔比为mPEG-COOH:CS=1:1的比例称取mPEG-COOH，加入三口烧瓶中，恒温水浴35℃，搅拌反应36h，反应过程中控制pH为4-6；将得到的粗产物置于透析袋中透析4天，冷冻干燥得到PEG-CS。
所述醋酸的体积浓度为2 %。
本发明以水溶性聚乙二醇化壳聚糖（PEG-CS）作为包封材料，中性环境有利于胰岛素活性的稳定与保持。采用温和的离子凝胶法制备载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，即先将一定浓度的PEG-CS溶液和胰岛素溶液混合，在磁力搅拌下滴加低浓度的三聚磷酸钠（TPP），用盐酸调节pH至5.5。反应完成后，将悬浊液离心，收集微球即可。
本发明提供了一种可以稳定包封胰岛素，实现其口服给药的制剂的制备方法，制备方法简单，条件温和。所得微球生物相容性好，性能优异，形貌可控，分散性良好，并且可以通过改变相关实验条件进行调节；包封率达50%以上，可实现对胰岛素的有效包封；用聚乙二醇化壳聚糖作为包封材料，其生物相容性和水溶性都很好，能提高胰岛素的生物利用度；所得载胰岛素微球具备缓释功能，可在模拟肠液中稳定释放7天，且可保证药物的生物活性(可保持胰岛素活性不变)，有望实现胰岛素的口服给药。本发明的制备方法简便可靠，实验周期较短，可望批量生产以实现应用。
附图说明：
图1为本发明中载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的TEM图；
图2为本发明中胰岛素的标准曲线；
图3为本发明中载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球在模拟肠液中的控制释放曲线；
图4为本发明中胰岛素的圆二色光谱图。
具体实施方式：
一、 制备工艺
1. 聚乙二醇化壳聚糖的合成
称取1g CS (CS为壳聚糖,分子量500000) ,溶解于6 ml 醋酸中, 醋酸体积浓度(v/v)为2 %，用20 ml TEMED·HCL稀释，加入到三口烧瓶中，测pH值为5左右，然后加入一定量EDC和NHS，30min后按摩尔比为mPEG-COOH:CS=1:1的比例称取mPEG-COOH，加入三口烧瓶中，恒温水浴35℃，搅拌反应36h，反应过程中控制pH 4-6。
将得到的粗产物置于透析袋中透析4天，冷冻干燥得到聚乙二醇化壳聚糖。
2. 载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的制备
(1)分别称取一定量的PEG-CS(聚乙二醇化壳聚糖)和TPP(三聚磷酸钠)溶于蒸馏水中，得到PEG-CS溶液、TPP溶液，使PEG-CS溶液的浓度为2mg/ml，PEG-CS的取代度为11.52%，TPP溶液的浓度为1mg/ml；
称取一定量的胰岛素粉末，用pH=2的盐酸溶解，再用0.1M NaOH溶液调节pH至中性，用pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）定容，使其浓度为5mg/ml；
（2）将PEG-CS溶液和胰岛素溶液混合，磁力搅拌下滴加浓度为1M的盐酸直至溶液澄清透明；
（3）再将TPP溶液缓慢滴加到上述澄清透明的溶液中，得到最终反应液，用浓度为1M的盐酸调节最终反应液的pH值至5.5，滴加完成后继续反应20min，得到悬浊液，其中，PEG-CS溶液和TPP溶液的质量比为2:1；
（4）将最终得到的悬浊液离心20min（离心速度为11000r/min），收集沉淀，冷冻干燥（-20℃），即可得到载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，即胰岛素缓释口服制剂。
二.载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的表征
1. 形貌及分散性
（1）透射电镜
微球的形貌通过Tecnai-12透射电镜（TEM）进行观察。首先将分散在蒸馏水中的微球滴在铜网上，红外灯下干燥10min后用磷钨酸（PTA）负染，再在红外灯下干燥，之后进行观察。
图1为载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的TEM图(放大倍数13500)，从图中可看出微球呈球形或类球形。
（2）动态光散射
用动态光散射5022F（Germany）检测样品的分散系数。以He-Ne激光为光源，波长671 nm，室温下散射角90°。测得的分散系数为0.374，说明分散性良好。
2. 胰岛素的标准曲线
逐级稀释法配置一系列不同浓度的胰岛素溶液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS7.4）定容，再用UV-2501型紫外分光光度计测定，以胰岛素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
图2为胰岛素溶液的标准曲线，y=0.033x-0.0009,其中x为胰岛素浓度，y为吸光度；线性回归方程为R2=0.9999，说明该标准曲线线性关系良好，可作为标准工作曲线使用。
3. 包封率
收集离心后的上清液，用0.22μm的水系针头滤器过滤数遍，再用UV-2501型紫外分光光度计测定，根据标准曲线计算出载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的包封率。
本发明所制备出的载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的包封率可达50%以上。
4. 控制释放
精确称取一定量干燥了的载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，置于截留分子量为5万的透析袋中，加入2ml pH=6.8的模拟肠液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲溶液），透析袋置于装有10ml释放介质的离心管中，放在170rpm，37℃的水浴摇床中释放。每隔一段时间取一次样，每次取1mL释放介质再补充相同量的新鲜介质。取出的释放介质用UV-2501型紫外分光光度计测定，根据标准曲线计算出胰岛素释放量。
从图3看出载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球在模拟肠液中释放出的胰岛素高达85%。
5. 圆二色光谱图（CD光谱）
用J-810型圆二色光谱仪测定胰岛素的二级结构：1nm光程差的圆柱形石英比色皿，恒温4℃下测定。
在圆二色光谱中，蛋白质在208 nm和222 nm处的两个负峰分别是α螺旋和β折叠的特征峰。从图4可看出，载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球在模拟肠液中释放出的胰岛素的构象和纯胰岛素溶液的构象基本一致，说明胰岛素结构没有发生改变，该微球可保持胰岛素原有生物活性。
三、总结
本发明制备出的载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，其PDI值在0.3-0.4，分散性良好；药物包封率在50%以上，可在模拟肠液中稳定释放7天，控制释放百分率高达85%，且可保持胰岛素活性不变。因此，本发明有望实现胰岛素的口服给药。
Claims (10)
1.一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
（1）将PEG-CS和TPP分别溶于蒸馏水中,得到PEG-CS溶液和TPP溶液；
将胰岛素粉末用盐酸溶解，再用NaOH溶液调节pH至中性，最后用磷酸盐缓冲溶液定容，得到胰岛素溶液；
（2）将PEG-CS溶液和胰岛素溶液混合，并在磁力搅拌下滴加盐酸直至溶液澄清透明；
（3）再将TPP溶液缓慢滴加到步骤（2）澄清透明的溶液中，得到最终反应液；用盐酸调节最终反应液的pH值，滴加完成后继续反应20min，得到悬浊液；
（4）将最终得到的悬浊液离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得到载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球，即胰岛素缓释口服制剂。
2.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中PEG-CS的取代度为11.52%，PEG-CS溶液的浓度为2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中TPP溶液的浓度为1mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中胰岛素溶液的浓度为5mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，溶解胰岛素粉末的盐酸pH=2，NaOH溶液的浓度为0.1M，磷酸盐缓冲溶液的pH=7.4。
6.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中滴加1M盐酸直至溶液澄清透明。
7.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中PEG-CS溶液和TPP溶液的质量比为2:1；调节最终反应液pH值的盐酸浓度为1M，经盐酸调节后的最终反应液的pH值为5.5。
8.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中悬浊液离心速度为11000r/min。
9.根据权利要求1所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中PEG-CS是按以下步骤合成的：
称取1g CS溶解于6 ml的醋酸中，用20ml TEMED·HCL稀释，并加入到三口烧瓶中，测pH值为5；然后加入EDC和NHS，30min后按摩尔比为mPEG-COOH:CS=1:1的比例称取mPEG-COOH，加入三口烧瓶中，恒温水浴35℃，搅拌反应36h，反应过程中控制pH为4-6；将得到的粗产物置于透析袋中透析4天，冷冻干燥得到PEG-CS。
10.根据权利要求9所述的一种胰岛素缓释口服制剂的制备方法，其特征在于，所述醋酸的体积浓度为2 %。
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