CN104450619B - 大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法：1)取状态良好的对数生长期细胞；2)以10‑30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内；3)间隔培养一天后，以4℃1000 rpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新干细胞培养基；4)干细胞培养2‑3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；5)培养一周，可见状态好的小细胞球出现；6)培养一周，待干细胞球初步形成，细胞增殖停滞；7)继续培养二周，使干细胞球基本形成。本发明从大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出来肿瘤干细胞样细胞，从而解决了肿瘤干细胞样细胞来源少的问题，能大量提供用于进一步研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤干细胞样细胞的培养方法，尤其涉及一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法。
背景技术
垂体腺瘤为颅内良性肿瘤，按照内分泌激素水平分为：泌乳素腺瘤(prolactinoma)，生长激素腺瘤(GH adenoma)，促肾上腺皮质激素释放激素腺瘤(ACTHadenoma)，促甲状腺激素腺瘤(TSH adenoma)，促性腺激素腺瘤(LH/FSH adenoma)和无功能腺瘤(NFPA)。
肿瘤干细胞报道主要关注恶性肿瘤，对于良性肿瘤干细胞样细胞(tumor stem-like cell)报道很少。
目前SCI收录论文关于垂体腺瘤干细胞样细胞培养的报道有4篇，3篇从人垂体腺瘤标本中分离培养，其中2篇为同一个课题组发表的类似结果，另一篇是从小鼠垂体腺瘤中分离培养，但上述报道均未区分或考虑垂体腺瘤的类型。国内论文报道有2篇，但按照目前肿瘤干细胞鉴定标准来看并不完全符合规范，均未做裸鼠种植成瘤实验。目前尚未有从垂体腺瘤细胞株中成功分离培养肿瘤干细胞样细胞的报道。
垂体泌乳素腺瘤约占垂体瘤的30％，大部分首选药物治疗(国际垂体协会泌乳素腺瘤诊疗指南，Guidelines of the Pituitary Society for the diagnosis andmanagement of prolactinomas.Clin Endocrinol(Oxf),2006,65:265-273.)，接受手术的病例相对少，同时垂体泌乳素腺瘤为良性肿瘤，手术中获取的标本体外培养，细胞生长缓慢，且一般传3-4代后就出现生长停滞，而垂体泌乳素腺瘤干细胞样细胞需从肿瘤细胞分离培养，这样就出现标本来源少且培养困难的问题。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提出一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法，该方法从垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出肿瘤干细胞样细胞，从而为肿瘤干细胞样细胞的进一步大量研究奠定基础。
为达到上述技术目的，本发明采用了大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法，具体包含下列步骤：
1)取状态良好的对数生长期细胞，用PBS洗涤2-3次，用上述干细胞培养基重悬；
2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用24孔板培养；
3)间隔培养一天后，以4℃1000rpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新干细胞培养基；
4)干细胞培养2-3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；
5)培养一周，使状态好的小细胞球出现；
6)继续培养一周，等干细胞球初步形成，细胞增殖停滞；
7)继续培养二周，使干细胞球基本形成。
在本发明的步骤2)中，以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用6孔板培养。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的培养基以去内毒素型DMEM/F-12培养基为基础培养基，含有无维生素A型B-27添加剂、青霉素-链霉素抗生素、碱性重组大鼠成纤维细胞生长因子以及重组大鼠表皮细胞生长因子。
在一个优选的实施方式中，其特征在于每500mL基础培养基中加入8-12mL无维生素A型B-27添加剂、20000-3000U青霉素-链霉素抗生素、5000-15000ng碱性重组大鼠成纤维细胞生长因子以及5000-15000ng重组大鼠表皮细胞生长因子。
本发明从垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出来肿瘤干细胞样细胞，解决了来源的问题，能大量提供用于进一步研究。
附图说明
图1：大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞培养过程中细胞形态变化
(图A)状态良好的对数生长期细胞；(图B)细胞行干细胞培养2-3天后；(图C)细胞行干细胞培养1周后；(图D)细胞行干细胞培养2周后；(图E)细胞行干细胞培养4周后。
图片2大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞鉴定
(图A)细胞行干细胞培养后，流式鉴定结果显示，-SC细胞CD133干细胞标志物阳性比例较细胞增加；(图B)蛋白免疫印迹法结果显示，-SC细胞CD133以及NESTIN干细胞标志物蛋白表达水平较细胞有所增加；(图C)免疫荧光染色结果显示，-SC细胞CD133蛋白主要表达在细胞膜上，且表达量较细胞有所增加。
具体实施方式
下面采用具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
实施例1
1、干细胞培养基配方：
2、培养条件：5％CO2，37℃；
3、培养方法及要点：
1)取状态良好的对数生长期细胞(图A)，用PBS洗涤2-3次，用上述干细胞培养基重悬；
2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，推荐使用24孔板培养，其效率最高，6孔板次之；
3)间隔培养一天后，以4℃1000rpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新干细胞培养基；
4)干细胞培养2-3天后，可见大量细胞凋亡(图B)，培养基出现细胞碎片，继续隔天半换液；
5)1周后状态好的小细胞球开始出现(图C)；
6)2周后干细胞球初步形成，细胞增殖停滞(图D)；
7)4周时干细胞球基本形成(图E)，保持细胞数与培养基比例，细胞密度过高则容易出现集体性凋亡，干细胞最长可养至2个月。
以Nest in及CD133作为标准，对培养的-SC细胞是否具有干细胞样特性进行鉴别：
A、采用流式细胞鉴定法，对普通细胞以及-SC干细胞样细胞针对CD133进行流式检测，结果如图2A所示，结果显示相对于普通细胞，-SC细胞其CD133阳性表达率增高，以此认为干细胞样培养方法能促进干细胞形成。
B、蛋白免疫印迹法，提取细胞以及-SC干细胞样细胞蛋白，加入PMSF终浓度为1mmol/L的4℃预冷细胞裂解液中。冰上孵育30分钟后，4℃，10000g，离心15分钟，取上清进行BCA蛋白定量，100℃加热15分钟使蛋白变性。配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，取30-40ug蛋白样本于点样孔中，电压80V，电泳30分钟后电压120V，电泳60分钟使蛋白分离。在170mA恒流下湿转120分钟，使蛋白转移至0.22um的PVDF膜，取出膜放入5％的脱脂牛奶中，室温封闭90分钟。移去脱脂牛奶，TBST洗涤三次。将膜放入用5％BSA配制好的一抗稀释液中，4℃孵育过夜。移去一抗，TBST洗涤三次后加入1：2000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育60分钟，洗涤数次，将膜放入ECL发光液中，在LAS-4000成像仪中显色成像。其结果如图2B所示，结果显示，Nestin及CD133在-SC干细胞样细胞内表达量较普通培养的细胞，有显著升高。
C、免疫荧光法，将形成的肿瘤细胞球贴附于涂有25ug/ml多聚赖氨酸包被的盖玻片上，继续培养2h，用4％多聚甲醛固定15min，PBS液冲洗3次，每次5min；0.1％Triton穿孔3次，每次5min，PBS漂洗2次，每次5min，10％山羊血清封闭30min；加入兔抗人nestin IgG(1：100)4℃过夜，PBS液冲洗3次，每次5min；加入FITC标记羊抗兔IgG室温孵育2h，PBS液冲洗3次，每次5min，甘油封片后在荧光显微镜下观察。CD133免疫荧光染色操作同上。结果如图2C所示，CD133在-SC干细胞样细胞上呈阳性表达，而在普通细胞上则未见明显表达。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取状态良好的对数生长期细胞；2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内；3)间隔培养一天后，以4℃1000rpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新干细胞培养基；4)干细胞培养2-3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；5)培养一周，可见状态好的小细胞球出现；6)培养一周，待干细胞球初步形成，细胞增殖停滞；7)继续培养二周，使干细胞球基本形成；
步骤2)中，以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内，使用24孔板培养；
所述的培养基以去内毒素型DMEM/F-12培养基为基础培养基，含有无维生素A型B-27添加剂、青霉素-链霉素抗生素、碱性重组大鼠成纤维细胞生长因子以及重组大鼠表皮细胞生长因子；
所述大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株为MMQ。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，每500mL基础培养基中加入8-12mL无维生素A型B-27添加剂、20000-3000U青霉素-链霉素抗生素、5000-15000ng碱性重组大鼠成纤维细胞生长因子以及5000-15000ng重组大鼠表皮细胞生长因子。
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