CN104436323B - 一种负载t-PA基因的生物支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种负载t-PA基因的生物支架及其制备方法。本发明负载t-PA基因的生物支架包括支架、覆盖在支架表面的基底层，覆盖在基底层表面的基因层，以及在支架外表面的封涂层。其不锈钢支架表面层模拟血管基底膜物质，可诱导血管内皮快速匍匐支架表面，防治血栓形成；纳米基因层起到缓释和控释基因药物作用；两层纳米粒之间的透明质酸层起到连接层作用，因其带负电荷，纳米粒在酸性环境表面呈正电，通过电荷吸引作用将两层纳米粒牢固结合在一起。最外层为支架纳米基因转染提供良好的微环境。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种负载t-PA基因的生物支架及其制备方法。
背景技术
目前临床使用的支架主要有裸金属支架(baremetalstents，BMSs)和药物洗脱支架(drugelutingstents，DESs)两种。药物洗脱支架主要构成包括：裸金属骨架、大分子多聚物以及抗增生药物如everolimus，biolimus或sirolimus等。多项随机调查显示，与单独球囊成形术相比，BMSs可明显减少介入治疗的并发症以及后期再狭窄发生；与BMSs相比，DESs明显减少再狭窄，但支架内血栓形成令人担忧。第一代DESs含有sirolimusorpaclitaxel，可明显减少支架内血管内膜增生，使临床再狭窄发生率明显减少。然而，由于血管对聚合物过敏和慢性炎症刺激导致动脉局部愈合延迟特别是内皮化过程受阻，加速了新的粥样硬化斑块形成并增加了支架内血栓形成的机会，尤其是后期(1个月至1年)和更后期(1年以上)血栓形成，使临床抗血栓治疗的期限明显延长。第二代和第三代DESs主要针对上述不足，设计采用了更细的支撑骨架、更耐久和生物相容性更好甚至生物可吸收的聚合物以减轻炎症并减少过敏反应，并且采用了新的抗增生药物，使支架内血栓形成率显著降低，其效果有待临床验证。
预防支架内血栓形成尤其是后期血栓形成，临床主要采取术后抗凝治疗。常用的抗凝药物包括warfarin，heparin，aspirin等，但长期抗凝治疗可能导致出血等并发症；一旦停药可能出现血栓再生。组织型纤溶酶原激活物(T-PA)是另一类溶血栓药物，它是由527个氨基酸构成的丝氨酸蛋白酶，主要功能是溶解纤维蛋白，不发生凝血和没有纤维蛋白产生，T-PA几乎内有活性。肝脏是其主要代谢场所，循环中的半衰期只有5-10分钟。临床上已使用重组t-PA有效地治疗急性心肌梗死和缺血性中风，但肺出血和颅内出血是主要问题，甚至危及生命。自t-PA的cDNA的成功克隆，人们已成功构建其逆转录病毒载体并在体外转染内皮细胞和高表达t-PA蛋白，将这种内皮细胞贴附于冠脉支架或冠状动脉搭桥吻合口表面获得了预防血栓或再狭窄的效果。
基因治疗提供了局部高表达t-PA的方法并避免了全身出血和血栓反弹。我们曾经构建了高表达t-PA基因质粒，用外科缝线携带转染猪心肌并成功预防了心脏二尖瓣膜置换术后血栓形成和冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄。尽管这种载体是安全、方便和有效的，但外科缝线是异物且方法具创伤性，不适于药用。
应用高分子聚合物制备纳米粒作为转基因载体已成为一种较新的方法。白蛋白以其生物相容、可降解、无免疫源性和没有毒性，是一种较理想的制备纳米载体原料。白蛋白纳米粒直接通过表面静电吸附基因DNA携载基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种抑制内膜增生、血栓形成和预防再狭窄的负载t-PA基因的生物支架。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
提供一种负载t-PA基因的生物支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：白蛋白纳米溶液的制备：以白蛋白和t-PA基因质粒为原料制备t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液；
涂层支架的制备：a、按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制支架表面涂层液；
b、将支架经无菌处理后，置于经超声波震荡处理的支架表面涂层液中，于25℃条件下孵育1h后无菌风干，在直径3mm的球囊上压模成型，得涂层支架；
步骤2：将步骤1所得涂层支架浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤3：将步骤2所得涂层支架浸于透明质酸液中孵育30-40min，晾干，浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤4：将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述支架为316L不锈钢支架网。
优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述白蛋白纳米溶液的制备具体为：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1MHCI调整pH值至5.5，得溶液A，将1mgt-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。
优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述步骤4具体为：重复步骤3的方法1-3次，将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
本发明的另一技术方案为提供一种负载t-PA基因的生物支架，包括支架、覆盖在支架表面的基底层，覆盖在基底层表面的基因层，以及在支架外表面的封涂层；
所述基底层由溶液A组成，所述溶液A为：每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制；
所述基因层由透明质酸涂层隔开的白蛋白纳米粒层组成，所述白蛋白纳米粒层由t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液组成；
所述封涂层由含5％胎牛血清的RPMI1640培养液组成。
优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架中，所述白蛋白纳米粒层为两层。
优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架中，所述白蛋白纳米溶液有如下方法制备而成：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1MHCI调整pH值至5.5，得溶液A，将1mgt-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明负载t-PA基因的生物支架的不锈钢支架表面层模拟血管基底膜物质，可诱导血管内皮快速匍匐支架表面，防治血栓形成；纳米基因层起到缓释和控释基因药物作用；两层纳米粒之间的透明质酸层起到连接层作用，因其带负电荷，纳米粒在酸性环境表面呈正电，通过电荷吸引作用将两层纳米粒牢固结合在一起。最外层为支架纳米基因转染提供良好的微环境。本发明的负载t-PA基因的生物支架在通过机械力扩张狭窄腔道的同时，抑制SMC增生、血栓形成和预防再狭窄。其制备方法采用溶液浸渍，操作简单，稳定可控，适合规模化生产。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中的负载t-PA基因的生物支架的结构示意图；
图2为本发明具体实施方式中的用Zetasizer3000仪粒度分析载t-PA基因白蛋白纳米粒粒径的结果图；
图3为本发明具体实施方式的实施例3中的各情况下pDNA的0.9％琼脂糖凝胶电泳结果图；
图4为本发明具体实施方式的实施例3中的对照组血管显微图；
图5为本发明具体实施方式的实施例3中的实验组血管显微图；
图6为本发明具体实施方式的实施例3中的实验组血管显微图；
标号说明：
1、支架；2、基底层；3、白蛋白纳米粒层；4、透明质酸涂层；5、封涂层。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：本发明构建高表达t-PA基因质粒，选用白蛋白为原料制备白蛋白纳米t-PA基因质粒载体，选用不锈钢金属支架为龙骨，模拟血管基底膜主要成分并按一定比例配制涂层液涂于金属支架表面，再将制备的纳米基因载体连接于涂层表面制成白蛋白纳米t-PA基因支架。
主要试剂和仪器：质粒pSecTag2B、感受态细胞E.ColiJM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术(深圳)有限公司提供；限制性内切酶HindIII，KpnI，BamHI和XhoI购自宝生物工程有限公司；VentDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs公司；超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品。
实施例1
本发明提供一种负载t-PA基因的生物支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：白蛋白纳米溶液的制备：以白蛋白和t-PA基因质粒为原料制备t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液；
涂层支架的制备：a、按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制支架表面涂层液；
b、将支架经无菌处理后，置于经超声波震荡处理的支架表面涂层液中，所述超声波震荡处理的条件为40KHz，50W，40-60分钟；于25℃条件下孵育1h后无菌风干，在直径3mm的球囊上压模成型，得涂层支架；；
步骤2：将步骤1所得涂层支架浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤3：将步骤2所得涂层支架浸于透明质酸液中孵育30-40min，晾干，浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤4：将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
所述支架为316L不锈钢支架网。
所述白蛋白纳米溶液的制备具体为：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1MHCI调整pH值至5.5，得溶液A，将1mgt-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。
优选的，上述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法中，所述步骤4具体为：重复步骤3的方法1-3次，将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
请参阅图1，本发明提供一种负载t-PA基因的生物支架，包括支架1、覆盖在支架表面的基底层2，覆盖在基底层表面的基因层，以及在支架外表面的封涂层5；
所述基底层由溶液A组成，所述溶液A为：每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制；
所述基因层由透明质酸涂层4隔开的白蛋白纳米粒层3组成，所述白蛋白纳米粒层由t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液组成；所述白蛋白纳米粒层为两层。
所述封涂层由含5％胎牛血清的RPMI1640培养液组成。
实施例2
本发明提供一种负载t-PA基因的生物支架的制备方法，包括如下步骤：
基因质粒的构建和表达：根据三个EST序列及t-PA基因序列设计3对引物以之将t-PA的三断序列从三个EST克隆质粒中扩增出来，并且在三对引物末端分别引入酶切位点。分别用含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基扩增培养三个EST克隆菌株，提取三个EST克隆质粒作为PCR扩增模板并扩增三条t-PA片断，回收扩增产物并测序鉴定。质粒pSecTag2B和三条t-PA片断t-PA-1、t-PA-2、t-PA-3分别经HindIII和XhoI，HindIII和KpnI，KpnI和BamHI，BamHI和XhoI双酶切消化，经QIAGENPCRProductPurificationKit纯化，T4DNA连接酶14℃连接过夜，将连接产物转化E.ColiJM109感受态细胞，经含氨苄青霉素LB平板挑出抗性菌落，PCR检测重组质粒，提取重组质粒测序鉴定。重组质粒经磷酸钙共沉淀法转染至CHO细胞，用间接免疫荧光法检测t-PA表达。带t-pa基因的质粒可以正常表达。
一步法制备载基因白蛋白纳米粒：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1MHCI调整pH值至5.5。将已构建的1mgt-PA质粒加入上述白蛋白溶液中孵育30min后，在超声场中缓慢滴入乙醇(乙醇：水＝2：1)，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，适当搅拌，室温下静置2h。减压使残余的乙醇挥发后，所得溶液17000r/min离心30min以除去游离的白蛋白和多余的交联剂。沉淀用双蒸水重悬并用超声波(条件：180W，固定频率20kHz，30sec)分散成乳胶状，4℃下储存备用。取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、包封率检测和凝胶阻滞实验，并用Zetasizer3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
白蛋白纳米t-PA基因支架设计与制备方法：
(1)无菌配制血管基底膜涂层液：按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白/层粘连蛋白/纤维连接蛋白＝200μg/100μg/50μg配制支架表面涂层液；
(2)常规316L不锈钢支架网经无菌处理后置于经超声波震荡处理的涂层液中于室温(25℃)下孵育1h，将涂层钢网无菌常温风干、4℃保存备用；
(3)将上述涂层的支架在直径3mm的球囊上压模成型；
(4)无菌下将压模成型支架浸于制备的纳米液中孵育30min进行表面连接涂层，经室温晾干后浸于透明质酸液中孵育30min。根据所需涂层厚度可交替涂层，形成多层结构(layerbylayer)，最外层为基因纳米粒层。本实施例的负载t-PA基因的生物支架为两层基因纳米层。
(5)负载t-PA基因的生物支架外表用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并自然晾干待用。
实施例3动物实验
1.材料
1.1动物：纯种新西兰白兔18只，雄性，体重2.3-2.5kg，南方医科大学动物中心提供。
1.2主要试剂和仪器：质粒pSecTag2B、感受态细胞E.ColiJM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术(深圳)有限公司提供；限制性内切酶HindIII，KpnI，BamHI和XhoI购自宝生物工程有限公司；VentDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs公司；兔抗人t-PA多克隆抗体、鼠抗平滑肌α-肌动蛋白和PCNA单克隆抗体、牛血清白蛋白、t-PAELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品。
2动物模型和支架术
2.1将18只兔随机分成两组：实验组(n＝10)和对照组(n＝8)。兔用25mg/kg苯巴比妥钠经静脉全身麻醉后，暴露一侧股动脉并将直径2.5mm球囊导管插入至腹主动脉，充气(5-8个大气压)后回拉将髂外动脉内膜剥脱；继续插入直径3mm球囊支架行髂动脉支架术。实验组置入的为上述实施例制备的白蛋白纳米t-PA基因支架；对照组置入的为相同材料和规格的金属裸支架。所有动物术后不用抗凝剂，观察其4周。各组动物分别于术前、术后1、2和4周抽取静脉血检测t-PA和D-二聚体含量并观察凝血酶原时间观察全身凝血状态。
2.2标本制备和检测
实验动物4周观察期结束后处死并立即用4％多聚甲醛加压固定，取出髂动脉并大体观察动脉腔通畅情况、支架内血栓形成状态。支架动脉段用多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片和病理检查。应用病理图像分析仪直接测量支架动脉横切面内膜厚度和内膜面积判断血管内膜增生；采用免疫组化标记链菌素生物素法检测动脉壁t-PA表达；判断平滑肌细胞及其增生采用抗平滑肌细胞α-actin单抗和抗PCNA单抗免疫组化标记。取其它重要脏器包括肺脏、肝脏、肾脏组织判断基因转染特异性和毒性评价。
2.3统计学处理
应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。实验结果以均数±标准差(χ±s)表示，采用t检验和Χ2检验检测各组间差异。以P＜0.05认为差异有显著性。
2.4结果
2.4.1pSecTag2B-t-PA重组质粒的构建与表达：重组t-PA质粒经磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞，用间接免疫荧光法检测t-PA表达结果，被转染的CHO细胞胞浆荧光素呈强阳性反应，对照组一抗用β-caterin抗体荧光反应为阴性。
2.4.2载t-PA基因白蛋白纳米粒粒径、形态和包封率的测定：扫描电镜结果显示，白蛋白纳米粒球形，大小较均匀且分散良好。Zetasizer3000仪粒度分析显示，白蛋白粒径大小呈正态分布，平均粒径大小为234.8nm，多分散指数平均0.311(如图2为Zetasizer3000仪粒度分析载t-PA基因白蛋白纳米粒粒径)。表面Zeta电位+4.17至+31.33mV。紫外分光光度计进行检测并计算纳米/质粒DNA的包封率。首先测量加入的总的质粒DNA含量，再将纳米包裹基因后的溶液离心并测量上清液中游离质粒DNA，计算方法入下：包封率(％)＝(W总-W游)/W总×100％(W总：的加入量；W游：上清液中质粒DNA测得量)。测定结果显示包封率平均为82.10％，符合实验要求。BCA蛋白实验检测白蛋白实际转为纳米粒的量(r2＞0.9168)。细胞培养条件观察纳米溶液浊度和粒径大小未发现明显改变表明纳米粒稳定性良好。T-pa质粒与白蛋白结合成纳米粒。
2.4.3凝胶阻滞分析和DNaseⅠ保护实验：图3所示为0.9％琼脂糖凝胶电泳结果。其中1、pDNA用DNA酶消化；2、nano-pDNA以DNA酶消化(本发明t-PA基因质粒的白蛋白纳米粒，pDNA:质粒DNA；Nano-pDNA:纳米粒包裹的质粒DNA)；3、pDNA；4.Marker。可见质粒DNA经白蛋白纳米包裹后完全阻滞于加样孔中未能移动(DNA：白蛋白为1/100)。未被纳米粒质粒DNA经DNaseⅠ消化后完全降解，电泳未见条带显现。而包裹纳米粒的质粒DNA则保持完好，被完全阻滞于加样孔内，表明纳米粒对质粒DNA具有保护作用。
2.4.4体外t-PA活性实验
用构建的纳米t-PA质粒转染人脐静脉内皮细胞，经体外培养后取上清液用产色底物实验方法(chromogenicsubstrateassay)检测t-PA活性。上清t-PA活性随着加入的质粒DNA含量的增加而逐渐增高(DNA/IU：0μg/7.64，1μg/64.12，2μg/107.86，4μg/138.48and8μg/156.22)，根据体外t-PA活性实验结果推算体内实验所需质粒DNA含量。
2.4.5支架血管病理改变和体内t-PA表达
观察期结束时所有实验动物均健康存活。肉眼观察各组实验血管，对照组8例血管支架内均明显可见血栓，血栓形成率100％，管壁亦明显较厚，高低不平。实验组10例中2例有肉眼可见血栓，其余见管壁光滑，无明显狭窄。血栓形成率20％。两组比较血栓形成率有显著性差异(P＜0.01)。显微镜下，对照组血管内膜明显较厚，内膜中增生的细胞呈梭形或不规则形，排列多层且紊乱，细胞间基质堆积较多，可见散在炎性细胞，管腔内可见血栓形成(图4：对照组血管内膜明显较厚，内膜中增生的细胞呈梭形或不规则形，排列多层且紊乱，细胞间基质堆积较多，可见散在炎性细胞，管腔内可见血栓形成。HE200×)；实验组内膜明显较薄，内膜细胞多为长梭形并与管腔平行(图5：实验组内膜明显较薄，内膜细胞多为长梭形并与管腔平行。HE200×)。表1显示两组支架动脉内膜厚度和面积比较以及内膜SMC表达PCNA状况。可见t-PA纳米基因支架通过减缓内膜SMC增殖限制血管内膜增生。免疫组化分析显示在实验组，t-PA基因转染阳性主要分布在增生的血管内膜，在血管中膜亦可见散在和较弱阳性信号分布(图6：实验组t-PA基因转染阳性主要分布在增生的血管内膜，在血管中膜亦可见散在和较弱阳性信号。免疫组化200×)(定向转染成功)；对照组血管壁t-PA表达为阴性。此外，其他组织包括肝脏、心脏、肾脏和肺脏等均没有发现t-PA反应阳性信号。
2.4.6血液t-PA和D-二聚体含量
表2显示置入支架前和置入支架后1周、2周及4周静脉血t-PAandD-二聚体含量的变化。与术前相比实验组于术后1周血液两项指标明显增高并一直持续至第4周观察结束；而对照组于术后1周两项指标轻微增高，之后一直维持在正常水平。与此同时检测血凝血酶原时间和计算INR，两组于术前、术后1、2和4周均未见显著改变。
表1为术后4周血管内膜厚度、面积和血管内膜PCNA阳性表达(x±s)
| 分组 | 例数 | 厚度(μm) | 面积(mm2) | PCNA-阳性细胞数 | 血栓率(％) |
| 对照组 | 8 | 110.54±16.24 | 32.12±14.56 | 56.20±8.30 | 100.00 |
| 实验组 | 10 | 15.10±11.78** | 2.18±1.54 | 4.46±3.38** | 20.00** |
**p＜0.01。
表2为术前和术后不同时间静脉血液t-PA和D-二聚体含量变化(x±s)
*p＜0.05，**p＜0.01，与术前相比。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：
白蛋白纳米溶液的制备：以白蛋白和t-PA基因质粒为原料制备t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液；
涂层支架的制备：a、按每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制支架表面涂层液；
b、将支架经无菌处理后，置于经超声波震荡处理的支架表面涂层液中，于25℃条件下孵育1h后无菌风干，在直径3mm的球囊上压模成型，得涂层支架；
步骤2：将步骤1所得涂层支架浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤3：将步骤2所得涂层支架浸于透明质酸液中孵育30-40min，晾干，浸于所述白蛋白纳米溶液中，孵育30-40min，晾干；
步骤4：将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
2.根据权利要求1所述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在于，所述支架为316L不锈钢支架网。
3.根据权利要求1所述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在于，所述白蛋白纳米溶液的制备具体为：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1MHCl调整pH值至5.5，得溶液A，将1mgt-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。
4.根据权利要求1所述的负载t-PA基因的生物支架的制备方法，其特征在于，所述步骤4具体为：重复步骤3的方法1-3次，将所得涂层支架外表面用含5％胎牛血清的RPMI1640培养液薄层封涂并晾干，得负载t-PA基因的生物支架。
5.一种负载t-PA基因的生物支架，其特征在于，包括支架、覆盖在支架表面的基底层，覆盖在基底层表面的基因层，以及在支架外表面的封涂层；
所述基底层由溶液A组成，所述溶液A为：每毫升透明质酸含Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白分别为200μg、100μg和50μg的比例配制；
所述基因层由透明质酸涂层隔开的白蛋白纳米粒层组成，所述白蛋白纳米粒层由t-PA基因质粒的白蛋白纳米溶液组成；
所述封涂层由含5％胎牛血清的RPMI1640培养液组成。
6.根据权利要求5所述的负载t-PA基因的生物支架，其特征在于，所述白蛋白纳米粒层为两层。
7.根据权利要求5所述的负载t-PA基因的生物支架，其特征在于，所述白蛋白纳米溶液由如下方法制备而成：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1MHCl调整pH值至5.5，得溶液A，将1mgt-PA质粒加入溶液A中孵育30min后，在超声场中滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，搅拌，静置2h，减压使残余的乙醇挥发，所得溶液17000r/min离心30min，所得沉淀用双蒸水重悬并用超声波分散成乳胶状，所得为白蛋白纳米溶液。
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