CN104436231A - 一种有机无机复合型超声成像微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有机无机复合型超声成像微球的制备方法。该微球为中空型无机/有机/无机三层结构，位于微球中心的是空腔，内部填充空气；空腔外层为-Fe₂O₃磁性粒子；中间层为聚甲基丙烯酸甲酯-聚丙烯酸无规共聚物与聚丙烯酸、二乙烯基苯通过自由基共聚得到的核/壳聚合物纳米微球，共聚物与内层-Fe₂O₃磁性粒子之间通过内表面羧基与铁盐可形成配位键或离子键而稳定；外层为二氧化硅，通过微球的表面的羧基与二氧化硅表面的硅羟基产生氢键作用而连接。该材料优点是：聚合物微球属于纳米级粒子；内层-Fe₂O₃磁性粒子使造影剂可靶向定位；二氧化硅空心微球具有很好的生物相容性和机械稳定性，内部空腔在造影模式下可以产生强的回波信号。

Description

一种有机无机复合型超声成像微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种医疗检测用造影剂，尤其涉及一种具有磁性功能的多层有机/无机复合结构的纳米微球，属于医学技术领域。

背景技术

近年来，分子影像技术由于其能够为活体组织的疾病诊断和监控提供重要的信息而得到广泛的关注（Campbell R. E., Chang C. J. Curr Opin Chem Biol, 2010, 14(1):1-2.）。在众多成像模式中，超声成像作为一种无创伤的生物医学成像模式，由于其具有成像和诊断安全及时、价格低廉、轻便快捷、运用广泛等优点而具有重要的研究价值。然而不同生物组织之间回波信号的不同常常会妨碍诊断的准确性，为了更好地得到特定组织的准确信息，人们通常采用加入超声成像造影剂的方法来实现（R. Díaz-LóPMMAz, Tsapisa N., Libong D., et al. Biomaterials, 2009, 30(8):1462-1472.）。

通常所用的造影剂主要为微泡，其外壳为糖类、蛋白质等两亲性小分子或多聚物构成，内部填充C₃F₈、SF₆等气体形成囊泡(Ferrara K. W., Borden M. A., Zhang H. Acc Chem Res, 2009, 42(7):881-892.)。这些造影剂可以改变或者增强超声回波信号以及提供更好的表面或者组织信息。然而由于拉普拉斯压力、血压、氧化新陈代谢以及超声波的作用，这些气体微泡在注入血液中几秒钟之后就被溶解和破裂，且粒径难以控制(Schutt E. G., Klein D. H., Mattrey R. M., et al. Angew Chem Int Ed, 2003, 42(28):3218-3235.)。二氧化硅空心微球具有很好的生物相容性和机械稳定性，且具有较大的空腔，在造影模式下可以产生较强回波信号，可解决上述问题。Hall等(Lin P. L., Eckersley R. J., Elizabeth A. H. Adv Mater, 2009, 21(38-39):3949-3952.)以PMMA球为模板，用聚烯丙基酸盐酸盐(PAH) 改变表面电荷制备了粒径为2.8μm的空心微球，壳层厚度小于30nm，并研究了其在不同机械指数条件下的超声成像效果。线性超声成像( B-model) 结果显示，这种中空SiO₂小球在水环境下具有很强的超声信号。然而这类方法仍具有一定的局限，如中空SiO₂小球的尺寸太大，并没有达到纳米级结构，难于用于活体成像，且未进行官能团修饰难以进行进一步连接。因此，目前临床中使用的造影剂还不能同时兼顾良好生物相容性、机械稳定性、靶向性能、纳米结构、可进行官能团修饰等要求。

发明内容

本发明针对以上问题，本文提供了一种有机无机复合型超声成像微球的制备方法，其是一种多层有机/无机复合结构磁性纳米微球，具有中空型无机/有机/无机三层复合结构：

位于微球中心的是空腔，内部填充空气；

中间层为高分子层，为聚丙烯酸与二乙烯基苯的共聚物；

空腔与中间层之间为 -Fe₂O₃磁性纳米粒子，通过配位键或离子键沉积于高分子层内表面；

外层为有介孔的二氧化硅纳米粒子，通过氢键作用吸附与高分子层外部。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

1 ）核 / 壳聚合物微球双层纳米微球的制备

该微球是基于一种核/壳聚合物微球双层纳米微球而制备的。首先利用甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸进行共聚得到单分散纳米微球，其为以下化学式所示结构：

其中x为5~50的整数；

y为0~15的整数；

2 ）制备双层纳米微球外层交联结构

然后将上述单分散纳米微球与聚丙烯酸、二乙烯基苯，通过溶液自由基共聚方法，得到微球外层结构，其为以下化学式所示结构：

其中n为0~50的整数

3 ）通过“自分散”聚合反应制备核 / 壳聚合物微球双层纳米微球

利用双层纳米微球的表面的羧基可与二氧化硅表面的硅羟基产生氢键作用，使二氧化硅在聚集体表面水解并缩聚形成壳层结构。其相互作用化学式如下所示：

4 ）空心高分子 - 二氧化硅纳米微球的制备

利用丙酮抽取内核形成空心高分子-二氧化硅纳米微球结构。在反应体系中加入三氯甲烷溶解，搅拌数小时，利用三氯甲烷溶解PMMA核后得到SiO₂空心微球，其形态了保持稳定并且结构完整，具有良好的球形结构。制备过程示意图如说明书附图4所示；

5 ）磁性高分子微球的制备

由于上述步骤中所制备的纳米微球内部存在大量的羧基，同时在二氧化硅表面有大量微孔。因此，可利用此微孔作为通道，将Fe³⁺加入反应体系后，利用微通道进入空心球内部，同时加入PEG，NaOH，调节pH值，使内层结合-Fe₂O₃磁性粒子。纳米微球内层高分子在-Fe₂O₃表面形成了Fe-O-C键，而形成内部磁性粒子层。

通过以上技术方案，本发明具有如下优点： 1）该有机无机复合型超声成像微球具有良好的生物相容性；

2）该有机无机复合型超声成像微球具有体积小，具有纳米级结构，可以通过各种人体屏障；

3）该有机无机复合型超声成像微球由于含有超顺磁性的-Fe₂O₃，因此具有靶向性能；

4）该有机无机复合型超声成像微球结构稳定、机械稳定性高。

此类有机无机复合型超声成像微球可以克服传统造影剂稳定性差、回声信号弱、生物相容性差等问题。

附图说明

图1为该磁性纳米微球的结构示意图；

图2为该磁性纳米微球的粒径测试图；

图3为该磁性纳米微球的AFM扫描图；

图4为空心高分子微球的制备流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的实施目的、技术方案和优点更为清楚，下面结合本发明的附图和具体实施例对本发明进行详细说明：

如图1所示，为该有机无机复合型超声成像微球的结构示意图。该纳米微球具有中空型机/有机/无机三层复合结构，依次具有：最外层为二氧化硅纳米粒子①；中间层为高分子层②；内层为-Fe₂O₃磁性纳米粒子③；位于微球中心的是空腔④，内部填充空气。其中二氧化硅纳米粒子层①中应具有介孔结构。

聚丙烯酸-二乙烯基苯共聚交联高分子作为高分子层②，同时外部吸附二氧化硅粒子①，而内层结合-Fe₂O₃磁性纳米粒子③作为一个较佳的实施方式：利用甲基丙烯酸甲酯与聚丙烯酸进行共聚得到内层微球，然后将内层通过聚丙烯酸与二乙烯基苯进行共聚，得到双层实心纳米高分子微球。利用双层纳米微球的表面的羧基可与二氧化硅表面的硅羟基产生氢键作用，使二氧化硅在聚集体表面水解并缩聚形成壳层结构①。同时，利用二氧化硅纳米粒子的介孔结构，使用有机溶剂法（丙酮）抽取内核形成空心高分子-二氧化硅双层纳米微球结构。最后，利用微球内表面羧基与铁盐可形成配位键或离子键，通过吸附渗透进入空心球内部的Fe²⁺和Fe³⁺等反应物，使内层结合-Fe₂O₃磁性粒子③。

图2所示为利用动态光散射方法对磁性纳米微球的粒径测试图，可以看出，纳米微球粒径小于1微米，粒径分布较窄，证明该纳米微球体积小、分散性好。

图3所示为该有机无机复合型超声成像微球的AFM扫描图像。证明高分子所形成球状胶束结构均一，分散性好，在水溶液中不发生团聚。有利于造影剂在体液中的靶向定位和分散。

下面给出实施例以对本发明进行具体描述，但值得指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1：

①核/壳聚合物纳米微球的制备

步骤一：首先采用“自分散”聚合的方法制备单分散（PMMA-PAA）共聚物微球。于500mL三口圆底反应瓶中加入甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸各0.2mol、AIBN（偶氮二异丁氰）0.98g、乙酸丁酯280 mL，在氮气保护下，恒温70℃反应12小时，产物于55℃烘箱中烘干，得到单分散（PMMA-PAA）共聚物微球。

步骤二：用种子“自分散”聚合反应制备核/壳聚合物微球。将（PMMA-PAA）共聚物微球3.65g、丙烯酸和二乙烯基苯各0.038mol、AIBN 0.09 g、乙酸丁酯100 mL、正己烷35 mL，加入反应瓶中，在氮气保护下，恒温75℃反应13小时，得到双层核/壳聚合物纳米微球。

②二氧化硅在微球表面进行聚集形成壳层结构

以上述步骤中制备的双层核/壳聚合物纳米微球为模板，通过溶胶-凝胶法在PAA表面原位生成厚度均一且形貌规整的SiO₂壳层。采用Stöber方法（Stöber W., Fink A., Bohn E. J Colloid Interface Sci, 1968, 26(1):62-69.），加入55mL氨水为催化剂，利用正硅酸乙酯(TEOS)16.5g，经过水解和缩聚反应后合成SiO₂。

用PAA表面PMMA核作为模板沉积SiO₂时，一般可生成35nm左右的独立SiO₂粒子。由于PMMA核对SiO₂ 的吸附性弱，如果直接用PMMA作为模版沉淀SiO₂，很难得到均匀的SiO₂壳层结构。而当PMMA核表面共聚PAA后，因PAA链上的羧基或羧酸根能与正硅酸乙酯的水解产物和SiO₂粒子表面的羟基形成氢键，从而诱导SiO₂成核生长，最后形成规整的壳层结构。

③中空型聚合物- SiO₂纳米微球的制备

取2.7g上述步骤中制备的SiO₂核/壳聚合物纳米微球，在反应体系中加入15mL三氯甲烷溶解，搅拌7小时，利用三氯甲烷溶解PMMA核后得到SiO₂空心微球，其形态了保持稳定并且结构完整，具有良好的球形结构。

④中空型磁性纳米微球造影剂的制备

于250mL三口圆底反应瓶中加入上述反应步骤中所得的空心聚合物微球1g、FeCl3·6H₂O 6g、去离子水150mL，再加入5 mL PEG-400，在磁力搅拌下，用稀NaOH溶液将混合溶液的pH值调至3。反应结束后，产物经离心分离，并用蒸馏水和乙醇洗涤多次，于60 ℃真空箱中烘干。将上述微球加入透析袋中，用1000 mL纯水透析，定期换水。透析液用滤膜过滤后，冷冻干燥得到中空型磁性纳米微球造影剂。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应理解，可以对分发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种有机无机复合型超声成像微球，其特征在于具有中空型无机/有机/无机三层复合结构：

1） 位于微球中心的是空腔，内部填充空气；

2） 中间层为高分子层，为聚丙烯酸与二乙烯基苯的共聚物；

3） 空腔与中间层之间为 -Fe₂O₃磁性纳米粒子；

4） 外层为二氧化硅纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的一种有机无机复合型超声成像微球，该材料是通过如下步骤进行制备的：

1） 制备聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸无规共聚单分散核/壳聚合物纳米微球；

2） 二氧化硅在微球表面进行聚集；

3） 制备中空型聚合物-SiO₂纳米微球；

4） 中空型磁性纳米微球造影剂的制备。

3.根据权利要求1或2所述的一种有机无机复合型超声成像微球，其特征还在于上述步骤1）中所形成的核/壳聚合物纳米微球为双层结构，并且都是采用聚丙烯酸作为亲水部分，其特征在于：

1） 其内层为聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸无规共聚物；

2） 其外层为聚丙烯酸与二乙烯基苯交联聚合物。

4.根据权利要求1或2所述的一种有机无机复合型超声成像微球，其特征还在于：最外层的二氧化硅纳米粒子中具有介孔结构。

5.根据权利要求1或2所述的一种有机无机复合型超声成像微球，其特征还在于：高分子层为聚丙烯酸与二乙烯基苯的共聚物，高分子具有双层聚丙烯酸结构，分子之间利用二乙烯基苯桥联。