CN104388538A - 一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法 - Google Patents

一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：将包含6个串联重复TCF4转录因子的7TFP质粒采用慢病毒转移的方式转染宿主细胞形成稳定细胞株，并种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样品，取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素酶基因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。本发明可以有效的准确的检测出组蛋白去乙酰化酶抑制剂，解决了了假阴性和假阳性的问题，降低了成本，具有简单，高效、低成本的特点。

Description

一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂是一类新型的药物，在肿瘤、心血管等疾病的治疗中存在重要的应用前景。一些重要的抑制剂业已进入临床阶段研究。比如，SAHA和FK228已经被美国FDA批准用于CTCL的治疗，VPA也已进入临床Ⅱ/Ⅲ研究阶段。然而，要想获得更多、更为有效的新型药物，必须有更加有效的筛选方案。
在特定的结肠癌细胞中，HDAC可影响转录因子TCF4的转录活性。当采用小分子化合物抑制HDAC活性时，TCF4的转录活性明显升高，其转录活性可以通过报告基因(荧光素酶或者EGFP)加以测定。对一些已知HDAC抑制剂的分析均获得了一致的结果。此外，我们采用RNAi技术干扰HDAC基因表达(同样达到抑制HDAC活性的目的)，TCF4的转录活性也明显升高。然而，在其它细胞如食管癌细胞中则没有这个效应。因此，在这个特定的结肠癌细胞中，TCF4基因的表达可以反映出HDAC抑制剂的效应。
目前获准的专利或发表论文中，在对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选时直接采用的组蛋白去乙酰化酶基因的启动子驱动报告基因(荧光素酶)或者是采用p21基因启动子驱动报告基因来进行筛选。尽管目前已知的多数抑制剂可以激活p21基因启动子的转录，但这不是全部抑制剂均有的共同之处。因此，采用p21启动子筛选可能出现假阴性问题。另外，和p21启动子一样，采用组蛋白去乙酰化酶基因的启动子也可能不是特异的表现，存在假阳性的问题。因此，这些方法均有一定的局限，本发明将TCF4反应元件分别与荧光素酶基因(可通过法学反应测定荧光素酶基因表达强度)连接构建慢病毒报告载体，同时构建不含TCF4反应元件的对照载体。将两种报告载体通过慢病毒转移至特定的结肠癌细胞中，获得稳定表达报告基因的细胞株。在对(小分子)药物库进行筛选时，利用荧光素酶基因报告体系进行精确筛选，可获得具有抑制HDAC活性的抑制剂。
发明内容
本发明的目的就是要解决临床对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的需求，针对现有筛选利用p21基因启动子驱动报告基因来进行筛选，存在假阴性和假阳性的可能，旨在提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，具有简单，高效、低成本的特点。
本发明通过以下技术方案实现：
一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：
1)将质粒转染宿主细胞形成稳定细胞株；
2)将获得的细胞株种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样品；
3)取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素酶基因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
所述的质粒为7TFP质粒，包含6个串联重复TCF4转录因子；
所述的质粒转染采用慢病毒转移的方式；
所述的宿主细胞为结肠癌细胞HCT116，同时还可以为EK293细胞或SW480细胞；
所述的结肠癌细胞株可以稳定表达荧光素酶基因；
本发明所述的结肠癌细胞中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂与TCF4基因表达呈负相关，即当高表达HDAC时，TCF4转录活性降低，而当HDAC活性被抑制后，TCF4转录活性显著增加。
本发明的有益效果为：
1)特异性，在特定的结肠癌细胞中，HDAC与TCF4基因表达呈负相关：即抑制HDAC后TCF4的转录活性明显上升，而对TCF4的转录活性检测可以采用其特异的反应元件来驱动报告基因来加以展示。因此，我们的筛选方案具有特异性。
2)成本低，由于阳性药物可改变荧光素酶报告基因表达强度至上百倍，因此在检测时可将十个药物分别处理细胞后合并检测，仍可以有效判断是否存在阳性药物。合并检测可以达到降低成本的目的。
附图说明
图1抑制剂对TCF4转录活性的影响；
图2嘌呤霉素筛选的细胞克隆；
图3基因组DNA中7TFP整合的PCR证实。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)的筛选方法，用曲古柳菌素(TSA)作为阳性对照。
实验材料：7TFP质粒来自Addgene，其序列60-161为TCF4反应元件。
试验方法：分别将质粒7TFP通过慢病毒转移的方式转染结肠癌细胞形成稳定细胞株TCF4+Luc，将所获得的TCF4+Luc细胞种植于96孔板，104细胞/孔，过夜贴壁后更换培养基，加入含NaB(浓度分别为0.2,1.0和5.0mM)和TSA(浓度分别为0.1,0.4和1.0μM)进行处理24小时，以未加药物处理的细胞为对照。取出培养板，吸取培养基，加入细胞裂解液，37°裂解30分钟后取裂解液上清进行测定。采用化学发光方法测定荧光素酶活性。
实验结果：经过测定发现荧光素酶活性明显增强，说明TCF4的转录活性增强，根据当高表达HDAC时，TCF4转录活性降低，而当HDAC活性被抑制后，TCF4转录活性显著增加的机理，表示抑制剂NaB和TSA对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)具有很好的抑制作用，其对TCF4转录活性抑制影响如图1。
实施例2 慢病毒的包装及细胞感染
将7TFP质粒利用PstI(35)和NheI(174)双酶切再后利用核酸酶切平自连，转化大肠杆菌，利用PCR方法筛选获得去除TCF4反应元件从而获得对照质粒7TFP-Con。
常规方法培养包装细胞人胚肾293FT。将其种植于6孔板，待60％满底时进行脂质体转染。质粒组合A:7TFP+pMD2.G+psPAX2；B:7TFP-Con+pMD2.G+psPAX2。三种质粒按1:1:1混合进行转染。转染48小时后收集培养上清液(含慢病毒颗粒)备用。
常规方法培养结肠癌HCT116细胞。将其种植于6孔板，待60％满底时加入含病毒的上清液感染4小时，换液后继续培养24小时。将培养基更换为含嘌呤霉素(2μg/mL)的完全培养基，继续培养至细胞克隆团块出现图2。培养单个细胞克隆，分别命名为TCF4+Luc细胞和Con-Luc细胞，各四个克隆株。为了证实慢病毒介导的外源DNA整合，提取细胞基因组DNA进行PCR检测，结果发现病毒感染后所获得的HCT116细胞能扩增出特异条带图3。
实施例3 已知HDAC抑制剂的效应
分别将TCF4+Luc细胞和Con-Luc细胞种植于96孔板，待60％满底时加入TSA(1μM)处理24小时。去培养基后裂解细胞测定荧光素酶活性。以每个细胞的TSA/N确定细胞对药物的反应性，结果显示TCF4+Luc细胞均可被TSA激活，而Con-Luc细胞无显著反应，如表1所示：
表1 荧光素酶活性测定
  N TSA TSA/N
TCF4+Luc克隆1 3834 945477 246.6
TCF4+Luc克隆2 589 32769 55.7
TCF4+Luc克隆3 19419 5286774 272.3
TCF4+Luc克隆4 12345 3883116 314.5
Con-Luc克隆1 469 586 1.2
Con-Luc克隆2 737 703 1.0
Con-Luc克隆3 806 1488 1.8
Con-Luc克隆4 657 1622 2.5
实施例4 小分子化合物的筛选
实验目的：TCF4+Luc细胞中HDAC活性被药物抑制后，TCF4转录活性增加导致其荧光素酶活性极大的增加，而对照细胞Con-Luc则无任何表现。因此，可以利用这两株细胞来对药物进行筛选。
试验方法：先利用TCF4+Luc细胞细胞获得阳性药物，再利用Con-Luc细胞去除假阳性药物。我们首先对502个从天然植物等来源中分离的单体化合物进行了筛选，药物购自国家小分子化合物中心(编号A10.Natural Products Library)。
将TCF4+Luc细胞种植于96孔板，过夜贴壁后加入药物。同时设置阳性对照TSA(1μM)和不加药物处理的阴性对照。24小时后测定荧光素酶。由于阳性药物刺激效应在几十倍以上，在样本检测时，我们将10个样本混合后进行检测，经分析显示只要10个样本中有一个阳性药物均可被发现。结果如表2表所示。
表2 TCF4的转录活性筛选结果
实验结果：从表2可以看出，混合样本的测定显示在5-B2～B9中存在一个阳性药物，再将其单个样本测定后显示待检测药物5-B3能显著刺激TCF4的转录活性。在整个480个样本的检测中，我们共发现了2个这样的药物。为了排除假阳性，我们将Con-Luc细胞种植于96孔板，然后再用这两个药物处理细胞，24小时后测定荧光素酶活性。以未处理细胞为阴性对照，以TSA为阳性对照。结果如下：2个待测药物与TSA一样，不能刺激Con-Luc细胞的荧光素酶活性，是真正的阳性药物。

Claims (5)

1.一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将质粒转染宿主细胞形成稳定细胞株；
2)将获得的细胞株种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样品；
3)取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素酶基因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述的质粒为7TFP质粒，包含6个串联重复TCF4转录因子。
3.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步骤(1)所述的质粒转染采用慢病毒转移的方式。
4.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述的宿主细胞为结肠癌细胞HCT116、细胞EK293或SW480。
5.根据权利要求4所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述的结肠癌细胞株HCT116用于稳定表达荧光素酶基因的用途。
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