CN104357551B - TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良制品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良诊断制品中的应用，本发明提供了TMCO3基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性Fuchs角膜内皮营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TMCO3基因突变位点的快速检测。

Description

TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良制品中的应用

技术领域

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种跨膜与卷曲螺旋域3(TMCO3)在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良(滴状角膜)基因诊断制品中的应用。

发明背景

Fuchs角膜内皮营养不良又叫滴状角膜，Fuchs于1910年首先描述这一临床现象，随后认识到它与原发性角膜内皮营养不良有关，角膜上皮和基质的改变为继发的。本病有一定的遗传性，遗传方式尚不十分清楚，有些病例已证实为常染色体显性遗传。病因不明，可能是多方面的一些尚未被认识到的因素干扰了角膜内皮细胞的结构与功能，最终导致了内皮泵功能的失代偿。

Fuchs内皮营养不良开始表现为角膜滴状变性，最后导致角膜基质层及上皮层水肿、混浊。上皮下出现水泡，形成所谓大泡性角膜病变。当水泡破裂后，出现眼疼、怕光、流泪、异物感等症状，视力明显减退或丧失。组织学检查，可发现后弹力层变肥厚，内皮细胞变薄，并伴有色素沉着。据统计显示，中国人的患病率约为0.7％，欧洲国家统计显示，在全部角膜移植手术中，约10％系Fuchs角膜内皮营养不良，术后约80％移植片2年内保持清亮但移植片长期存活率低。即使手术时机选择适当，移植片亦仅能在有限期间内保持清亮。由于缺乏对本病的认识，在行眼内手术，如白内障摘除术，手术之前未行角膜内皮检查，术中损伤角膜内皮细胞导致角膜水肿，丧失视力。

Fuchs角膜内皮营养不良的病因病理尚不清楚，目前世界上研究较少。国内外的遗传学研究结果表明该病为常染色体显性遗传，也有散发病例的报道。迄今为止，科学家们已经定位了8个Fuchs角膜内皮营养不良疾病基因的位点：20p13，9p24.1-p22.1，5q33.1-q35.2，10p11.22，18q21.2-q21.3，13pter-q12.13，15q25.3，1p34.3。

到目前为止对Fuchs角膜内皮营养不良的致病基因的了解仍然有限，迄今为止的已知基因仅能解释一小部分的患者的发病。这已经成为Fuchs角膜内皮营养不良的发病机制的研究以及针对病因的诊断和治疗研究的瓶颈。这种现状促使进一步去发现和了解该病新的致病基因，为后续的基因诊断、产前诊断及基因治疗提供基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。

申请人从一个4代呈常染色体显性遗传的Fuchs角膜内皮营养不良家系中，对该家系全部成员进行了全基因组连锁分析，寻找可能的连锁区域；同时，进一步对该家系的核心成员进行了外显子组测序，结合连锁分析的结果，找到了该家系的致病基因跨膜与卷曲螺旋域3(TMCO3)存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。

本发明首先提供TMCO3基因新的用途，是在制备用于检测Fuchs角膜内皮营养不良诊断制品中的应用；

上述的诊断制品，作为实施例的优选，是检测Fuchs角膜内皮营养不良的引物或探针。

上述的引物对，其引物信息如下：

TMCO3-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCTSEQIDNO:1

TMCO3-E1R：CCAGGGAGGGAGGGAAGGASEQIDNO:2

TMCO3-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAASEQIDNO:3

TMCO3-E2R：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGATSEQIDNO:4

TMCO3-E3F：ACATATGAACAGGGACATTTSEQIDNO:5

TMCO3-E3R：TACACGTGAACAATTTCAACSEQIDNO:6

TMCO3-E4F：GCAGAAATCCTAAACCTATCSEQIDNO:7

TMCO3-E4R：AAGATAAAGCTCGGTCATASEQIDNO:8

TMCO3-E5F：CCCAGAATACACTCTTCATSEQIDNO:9

TMCO3-E5R：GTTTATACGAAGCTGGTATCSEQIDNO:10

TMCO3-E6F：TCGAAGTACACTGTGTGATSEQIDNO:11

TMCO3-E6R：AACATCAAACCGAAATATCSEQIDNO:12

TMCO3-E7F：GTGAGGATTCACCATGTTSEQIDNO:13

TMCO3-E7R：TGGTTAGGAAAGTCCTAAGASEQIDNO:14

TMCO3-E8F：GTTGTCGTAGACCTGTCTTSEQIDNO:15

TMCO3-E8R：ACAGGACTGAGGAACTGTSEQIDNO:16

TMCO3-E9F：GCTCAACACAACTTAATTTCSEQIDNO:17

TMCO3-E9R：TTGATGGGTAGTATAAGAAAGSEQIDNO:18

TMCO3-E10F：CTAATAGCAGCCTCCACATSEQIDNO:19

TMCO3-E10R：GCTGGACAGAAGAAACAGTASEQIDNO:20

TMCO3-E11F：TTCCTGTATTGAAGCAAGTSEQIDNO:21

TMCO3-E11R：GCTCAATTCTGAAACAATCSEQIDNO:22

TMCO3-E12F：TTTGCCTTATTGTTCAGTGSEQIDNO:23

TMCO3-E12R：CTAACTGCAACTTTCCTCTGSEQIDNO:24

TMCO3-E13-1F：GTGCTAGTCCTGACAGTCTCSEQIDNO:25

TMCO3-E13-1R：AAACATAGGCTTTAAGAATCAASEQIDNO:26

TMCO3-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGTSEQIDNO:27

TMCO3-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAGSEQIDNO:28

本发明还提供一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良的试剂盒，包含有上述的引物对中的任一种或几种。

本发明还提供一种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点，为TMCO3基因编码区域由起始密码子起第41位，其碱基为C或T。

其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：

TMCO3-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAASEQIDNO:3

TMCO3-E2R：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGATSEQIDNO:4。

本发明还提供另外一种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点为TMCO3基因编码区域由起始密码子起上游第129位，其碱基为G或A。

其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：

TMCO3-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCTSEQIDNO:1

TMCO3-E1R：CCAGGGAGGGAGGGAAGGASEQIDNO:2。

本发明还提供第三种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点为TMCO3基因编码区域由终止密码子起下游第268位，其碱基为G或A。

其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：

TMCO3-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGTSEQIDNO:27

TMCO3-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAGSEQIDNO:28。

本发明提供了TMCO3基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行Fuchs角膜内皮营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TMCO3基因突变位点的快速检测。

附图说明

图1：实施例1的Fuchs角膜内皮营养不良家系内患者及正常人TMCO3测序图，其中A：患者；B：正常人。该家系中八名患者TMCO3基因编码区域由起始密码子起第41位发生了杂合突变，其碱基由C为突变为T。

图2：实施例2的Fuchs角膜内皮营养不良患者及其母亲TMCO3测序图，其中A：患者；B：母亲。该患者TMCO3基因编码区域由起始密码子起上游第129个碱基发生了杂合突变，由G突变为A。

图3：实施例2的另一名Fuchs角膜内皮营养不良患者及其母亲TMCO3测序图，其中A：患者；B：母亲。该患者TMCO3基因编码区域由终止密码子起下游第268个碱基发生了杂合突变，由G突变为A。

具体实施方式

申请人在一个Fuchs角膜内皮营养不良家系中发现TMCO3基因的突变位点，并证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。

TMCO3基因位于染色体13q34，可转录成大约2034bp的mRNA(NCBI登录号为NM_017905.4)，直接翻译形成677个氨基酸组成的蛋白质。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：从Fuchs角膜内皮营养不良综合征家系中筛选TMCO3基因的突变位点

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取该家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。

加入180μLTE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、连锁分析：由北京怡美通德科技发展有限公司通过OmniZhonghua8芯片对该家系内成员进行连锁分析，显示可能连锁的区域为：Chr1:11060075-13954853，Chr5:75590805-103478518,Chr11:122477025-128196675，Chr13:112195456-115086044，Chr17:36975-1244992，Chr18:2335224-2634943，Chr19:56583279-56924761，Chr19:57771883-58572500，Chr19:56419263-58439306，Chr21:15493361-16958251。

3、外显子组测序：外显子组测序(ExomeSequencing)是一种新型的基因组分析技术，只需针对全基因外显子(exon)区域的DNA即可，取该家系中3名患者的基因组DNA，由北京贝瑞和康生物技术有限公司应用AgilentHumanAllExon50M芯片捕获人类基因组的外显子区域，然后对富集的外显子文库进行高通量测序。将突变滤过4个正常人数据库：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，进一步筛选出5名患者共有的位于可能连锁区域的非同义突变位点4个，应用直接测序法在该家系内筛选到与致病单倍体型共分离的致病基因TMCO3，并在正常人群外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

4、直接测序法验证该家系内患者TMCO3基因的突变

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，55±3℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。

(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该TMCO3引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对TMCO3-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAA，TMCO3-E2R：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGAT，在该家系中八名患者TMCO3基因编码区域由起始密码子起第41位发生了杂合突变，其碱基由C为突变为T(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。应用点突变预测程序SIFT预测均发现，该突变导致了TMCO3蛋白功能“damaging”级的损坏，从而引起了患者Fuchs角膜内皮营养不良的发生。而在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

通过上述的分析，证明TMCO3基因可以用来检测患者是否具有潜在患Fuchs角膜内皮营养不良的危险。通过将检测者的TMCO3基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。

根据TMCO3的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：

TMCO3-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCT

TMCO3-E1R：CCAGGGAGGGAGGGAAGGA

TMCO3-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAA

TMCO3-E2R：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGAT

TMCO3-E3F：ACATATGAACAGGGACATTT

TMCO3-E3R：TACACGTGAACAATTTCAAC

TMCO3-E4F：GCAGAAATCCTAAACCTATC

TMCO3-E4R：AAGATAAAGCTCGGTCATA

TMCO3-E5F：CCCAGAATACACTCTTCAT

TMCO3-E5R：GTTTATACGAAGCTGGTATC

TMCO3-E6F：TCGAAGTACACTGTGTGAT

TMCO3-E6R：AACATCAAACCGAAATATC

TMCO3-E7F：GTGAGGATTCACCATGTT

TMCO3-E7R：TGGTTAGGAAAGTCCTAAGA

TMCO3-E8F：GTTGTCGTAGACCTGTCTT

TMCO3-E8R：ACAGGACTGAGGAACTGT

TMCO3-E9F：GCTCAACACAACTTAATTTC

TMCO3-E9R：TTGATGGGTAGTATAAGAAAG

TMCO3-E10F：CTAATAGCAGCCTCCACAT

TMCO3-E10R：GCTGGACAGAAGAAACAGTA

TMCO3-E11F：TTCCTGTATTGAAGCAAGT

TMCO3-E11R：GCTCAATTCTGAAACAATC

TMCO3-E12F：TTTGCCTTATTGTTCAGTG

TMCO3-E12R：CTAACTGCAACTTTCCTCTG

TMCO3-E13-1F：GTGCTAGTCCTGACAGTCTC

TMCO3-E13-1R：AAACATAGGCTTTAAGAATCAA

TMCO3-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGT

TMCO3-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAG

分别应用上述的每一对引物进行TMCO3基因的检测。

实施例2：从先天性散发Fuchs角膜内皮营养不良患者中筛选TMCO3基因的突变位点

收集散发Fuchs角膜内皮营养不良患者：在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院收集诊断明确的Fuchs角膜内皮营养不良散发患者。

提取外周血基因组DNA：

分别抽取Fuchs角膜内皮营养不良患者及其母亲的外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从家系内各成员外周血中提取基因组DNA。

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，55±3℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。

(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)

应用该反应体系分别进行每名患者的基因组DNA模板分别与TMCO3基因的14对引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对该2名患者及其母亲的基因组DNA模板分别与TMCO3基因的14对引物的扩增产物进行测序，其中用引物对TMCO3-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCT和

TMCO3-E1R：CCAGGGAGGGAGGGAAGGA，在散发患者中检测到了TMCO3基因的杂合突变：TMCO3基因编码区域由起始密码子起上游第129个碱基发生了杂合突变，由G突变为A(图2)，该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，另外，该突变位于TMCO3基因的5’UTR区域，可能通过影响该基因的表达而致病。并在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。

另外用引物对TMCO3-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGT和

TMCO3-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAG，在另一名散发患者中检测到了TMCO3基因的杂合突变：TMCO3基因编码区域由终止密码子起下游第268个碱基发生了杂合突变，由G突变为A(图3)，该突变存在于单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)数据库中，其中A的最小等位基因频率为A＝0.000/1，表明该突变非常罕见，另外，该突变位于TMCO3基因的3’UTR区域，可能通过影响该基因的表达而致病。并在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。

上述的检测结果表明TMCO3基因的突变位点能够用于检测Fuchs角膜内皮营养不良。

Claims (4)

1.一种TMCO3基因在制备用于检测Fuchs角膜内皮营养不良诊断制品中的应用，其特征在于，所述的检测为检测TMCO3基因编码区域是否存在由起始密码子起第41位的碱基为C到T的突变；或是否存在由起始密码子起第129位的碱基G到A的突变；或是否存在由起始密码子起第268位的碱基G到A的突变。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断制品为PCR检测引物或探针。

3.一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良的引物对，所述的引物对的信息如下：

TMCO3-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCTSEQIDNO:1、

TMCO3-E1R：CCAGGGAGGGAGGGAAGGASEQIDNO:2、

TMCO3-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAASEQIDNO:3、

TMCO3-E2R：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGATSEQIDNO:4、

TMCO3-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGTSEQIDNO:27、

TMCO3-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAGSEQIDNO:28。

4.一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求3所述的引物对中的任一种或几种。