CN104353112B - 一种骨支架复合材料的制备方法 - Google Patents
一种骨支架复合材料的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104353112B CN104353112B CN201410513528.9A CN201410513528A CN104353112B CN 104353112 B CN104353112 B CN 104353112B CN 201410513528 A CN201410513528 A CN 201410513528A CN 104353112 B CN104353112 B CN 104353112B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bone
- antigen
- solution
- preparation
- scaffolds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明属于组织工程学领域，主要涉及一种骨组织工程支架复合材料的制备方法。具体步骤如下：a)去抗原松质骨的制备；b)壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液表面修饰的去抗原松质骨支架的制备。本发明采用物理化学结合(超声结合冻干)的方法较好的解决了松质骨支架的去抗原问题，尤其是超声处理，通过超声溶液与超声条件的配合最大限度的减少了抗原的存在，并且使去抗原的松质骨支架具备较好的力学性能。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学领域，主要涉及一种骨组织工程支架复合材料的制备方法。
背景技术
骨是一族生物矿物材料的总称，主要发育于脊椎动物中。虽然每一种类型的骨的结构和组成稍有变化，但都有一个共同的特点：它们主要成分都是由I型胶原纤维、碳羟磷灰石和水组成。骨是最复杂的生物矿化系统之一，也是最典型的天然有机-无机复合材料。骨中的碳羟磷灰石晶体都是板形的，平均长度和宽度分别为50nm和25nm；晶体厚度极薄，且非常一致，一般1.5nm至4.0nm。骨的主要有机相为胶原纤维，另外还有少量骨涎酸蛋白、硫酸软骨素、脂类、肽类等。胶原纤维中的原胶原分子具有三重螺旋结构，骨中的矿物相位于原胶原分子间的间隙孔内，排列成层，构成骨的基本结构。
骨损伤是目前常见的疾病。由于风湿、类风湿等各种骨关节疾病或运动创伤所造成的关节骨损伤给许多病人带来痛苦。迄今为止，临床上仍然缺少有效的方法修复大尺寸的骨缺损。应用再生医学的方法和原理来进行骨组织的修复是目前的一个重要手段，且取得了良好的效果。其中，骨修复支架在骨再生中起着十分重要的作用。
研究表明，一种适于骨修复的支架材料应具备以下特点1、与人体组织具有良好生物相容性，无免疫源反应；2、与人骨力学性能相近似，且具有一定的强度和支撑力；3、优良的三维微观结构，保证培养液及血液能够进入骨支架内部，且易于成型；4、良好的成骨诱导性；5、具有合适的表面理化性质，且能被宿主骨组织吸收替代；6、取材方便，易于大量制作。因此，在保证人工骨的承载功能(弹性模量)满足要求的前提下，人工骨需要制成多孔结构，即满足一定的孔隙率，从而促进人工骨体内生物相容性，保证骨细胞和营养液物质在支架内的传输。目前，常用的骨支架材料包括：骨水泥，聚合材料(如PLGA，钛合金等)等，但上述材料都或多或少地存在细胞相容性差及因降解造成局部炎症等问题。
另外，在骨修复治疗中会在骨修复材料中加入种子细胞辅助治疗，但是种子细胞与支架复合物植入机体后，血管新生需要数天时间，细胞耐受缺氧为数小时；细胞存活需要的氧和营养仅能靠机体组织液渗透供应，而氧的扩散距离局限于0.2mm内，这就决定种子细胞的成活及体外构建组织工程化骨不能按照实际骨缺损的大小预构，尤其是大块骨缺损，即构建组织工程骨的厚度不能大于0.5mm，否则其中的种子细胞因得不到氧和营养物质的供应而死亡。因此，血管化仍是组织工程骨研究和临床应用所面临的瓶颈之一。虽然生物反应器内构建的组织工程骨植入体内有成骨作用，但植入初期与受区血液循环没有直接衔接，种子细胞成活及代谢产生的各种物质与受体间交换仍靠渗透进行，距离有限，效果难以保证。
发明内容
本发明的一个目的是一种骨组织工程支架复合材料的制备方法；具体步骤如下：
a)去抗原松质骨的制备：
剔除原料骨表面的骨膜、附着组织，并用双蒸水漂洗干净；分割成小骨块，然后在双蒸水中搅拌浸泡7h，得到无血色的骨块；骨块捞出沥干后，置入25℃恒温摇床中，用1:1氯仿/甲醇浸泡12h进行脱脂，然后再用双蒸水反复清洗3次，10-15min/次；制备成去抗原松质骨支架；
b)壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液表面修饰的去抗原松质骨支架的制备：
制备壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液(C/GP/Co)；将a)制备的去抗原松质骨支架浸入C/GP/Co溶液中，在37℃水浴中放置15min，去离子水清洗后冷冻干燥，得到C/GP/Co修饰的去抗原松质骨支架。
在步骤a)中，在脱脂清洗处理后，还进行超声清洗脱细胞处理，具体处理方法为：将骨块放入含有0.05～0.2％的胰酶、0.1～0.3％的烷基糖苷和0.1％的聚乙二醇的PBS溶液中进行超声，pH为7.4，超声条件为：超声频率25kHz，超声功率为50W，超声时间5min，超声两次；所述烷基糖苷为巴斯夫公司生产的Glucopon225DK。
在步骤b)中，所述C/GP/Co溶液中，壳聚糖的浓度为15mg/ml，β-甘油磷酸钠的浓度为30mg/ml，胶原的浓度为35mg/ml，pH为7.4；在进一步地实施中，所述C/GP/Co溶液中还包含0.5ng/ml的BMP-2，35ng/ml的bFGF和50mg/ml的女贞子总苷。所述女贞子总苷的提取方法为将女贞子药材粉碎用12倍量的50％乙醇，加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液加压干燥即得。
在本发明中，松质骨可以是自体移植物、同种异体移植物或异种移植物。作为非限制性的实例，如果支架是异种移植物，其可以来自绵羊、猪或牛的骨。松质骨可以取自任何部位，其中可以利用所需的大小。在本发明的一个实施方案中，松质骨是椎骨松质骨。在从骨中获得后，将骨髓从松质骨中去除。随后可以使松质骨部分成形。可选地，可以在去除骨髓前，使松质骨成形。可以使松质骨部分形成支架所需的任何形状。应当理解，支架的形状取决于应用以及体内放置支架的位置。支架形状的非限定性实例是薄片、矩形块、圆柱体、犬骨形或平行六面体。尽管这些形状作为实例给出，但设计所需的任何形状的支架而无需不适当的实验，完全在本领域技术人员的知识范围内。支架的尺寸也可以根据支架的所需用途而变化。在说明性的实施方案中，支架的厚度可以为约0.1m至约15mm，或约0.5mm至约10mm，尽管如有需要，其可以更小或更大。例如，如果支架用于修复踝关节，则支架可以小于0.55mm。可选地，如果支架用于修复膝关节中的关节软骨缺损，则支架的尺寸可以更大。
应当理解，本发明的松质骨支架可以适当地进行定型，用于多种应用。例如，本发明的松质骨支架可以应用于手、肘、膝、足、踝或所需的任何其他解剖学位置中的韧带、腱、软骨或生长板的修复。此外，本发明的支架可以应用于替代或修复多种关节中的任何关节。本领域已知的用于关节替代的方法和植入物的形状，可以根据本发明公开的植入物进行定型并由本发明的植入物置换。
所述松质骨支架还可以包括细胞，可以添加的细胞的非限定性实例是成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞或其混合物。在另一个可选的实例中，松质骨支架还可以包含成体干细胞。成体干细胞的非限定性实例是骨髓干细胞和脂肪衍生的干细胞。所述松质骨支架添加脂肪干细胞的方法为：
将采用上述方法制备的松质骨支架材料浸入脂肪干细胞的混悬物中，反复交替吸取支架材料上的细胞混悬物，以确保接种均匀，然后成骨诱导液中培养3周，使骨髓间充质干细胞诱导分化成成骨细胞，形成含成骨细胞的细胞-支架材料复合物，植入体内便为由脂肪干细胞构建的组织工程骨。所述成骨诱导液包括低糖DMEM，10％胎牛血清，100mg/ml链霉素，100U/ml青霉素，β-甘油磷酸钠10mmol/L，地塞米松10nmol/L，维生素C50mg/L。
本发明采用物理化学结合(超声结合冻干)的方法较好的解决了松质骨支架的去抗原问题，尤其是超声处理，通过超声溶液与超声条件的配合最大限度的减少了抗原的存在，并且使去抗原的松质骨支架具备较好的力学性能。另外，在松质骨支架外面包被了含有营养成分的水凝胶材料，使松质骨支架在体内可以较好的捕获种子细胞，尤其是脂肪干细胞，并提供了适合的营养成分适合细胞向成骨和成血管方向分化，加工制作科学合理、简便易行。
附图说明
图1：松质骨材料的扫描电镜图；
图2：C/GP/Co修饰的去抗原松质骨扫描电镜图。
具体实施方式
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
在本发明中，除特殊说明外，“％”代表重量百分比。
实施例1
步骤1：剔除猪骨表面的骨膜、附着组织，并用双蒸水漂洗干净；分割成小骨块，然后在双蒸水中搅拌浸泡7h，得到无血色的骨块(6mm×6mm×6mm)10颗；骨块捞出沥干后，置入25℃恒温摇床中，用1:1氯仿/甲醇10ml浸泡12h进行脱脂，然后用双蒸水反复清洗3次，10-15min/次；随后将骨块放入含有0.1％的胰酶、0.2％的烷基糖苷和0.1％的聚乙二醇的PBS溶液中进行超声，pH为7.4，超声条件为：超声频率25kHz，超声功率为50W，超声时间5min，超声两次；然后用双蒸水反复清洗3次，10-15min/次；制备成如图1所示的去抗原松质骨支架；
步骤2：壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液表面修饰的去抗原松质骨支架的制备：
制备壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液(C/GP/Co)；溶液组成为15mg/ml的壳聚糖，30mg/ml的β-甘油磷酸钠，35mg/ml的胶原，0.5ng/ml的BMP-2，35ng/ml的bFGF和50mg/ml的女贞子总苷，pH为7.4；将步骤1制备的去抗原松质骨支架浸入C/GP/Co溶液中，在37℃水浴中放置15min，去离子水清洗后冷冻干燥，得到C/GP/Co修饰的去抗原松质骨支架，如图2所示。
所述烷基糖苷为巴斯夫公司生产的Glucopon225DK。
实施例2
不同超声条件下松质骨支架的性能检测
除下表参数外其它支架材料制备方法同实施例1
(1)扫描电镜观察
采用常规方法制备扫描电镜标本(每组3例)，置于Quanta400FEG型扫描电镜下观察并摄片，计算松质骨支架孔径和孔隙率，结果如下：
| 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | |
| 孔径(μm) | 352.5±57.8 | 289.4±75.6 | 317.2±43.3 | 495.5±32.4 | 176.8±29.8 |
| 孔隙率(％) | 67.4±3.7 | 31.8±2.5 | 57.2±3.3 | 65.7±4.7 | 43.2±4.0 |
(2)抗压强度测定
加支架材料立于加载平台上，对支架施加垂直压缩力，载荷测量精度为1N，变形测量精度为0.005mm，按公式σ0＝Fmax/A，计算材料的抗压强度，Fmax为最大破坏载荷(N)；A为材料横截面积(mm2)，σ0为抗压强度(MPa)，具体结果如下：
(3)支架材料对抗原特异性淋巴细胞刺激增殖的影响
取ICR小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，组织匀浆，过200目筛，离心重悬，得小鼠脾单细胞悬液，加入24孔培养板中(每孔1×106个)，将各组支架材料匀浆取上清液，加入24孔培养板中，培养三天后，采用3H-TdR测定计算淋巴细胞刺激指数(SI)，支架组cpm/对照组cpm。
| 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | |
| SI | 1.01±0.13 | 1.93±0.24 | 1.31±0.18 | 1.27±0.21 | 1.83±0.12 |
实施例3
植入支架材料大鼠的研究
取SD大鼠，体重180-220g，氯胺酮麻醉，在臀部皮下植入支架材料(对照组只手术不植入材料)，在植入2周后，腹主动脉取血进行流式细胞检测，分析T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的细胞百分含量和CD4+/CD8+比值，具体结果如下：
| 对照组 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | |
| CD4+(％) | 28.4±4.2 | 31.6±3.7 | 41.3±3.1 | 36.2±2.9 | 33.7±3.8 | 39.6±3.4 |
| CD8+(％) | 13.3±1.5 | 13.9±2.1 | 16.8±1.6 | 15.2±1.1 | 14.3±1.3 | 23.4±4.2 |
| CD4+/CD8+ | 2.1±0.1 | 2.2±0.2 | 2.5±0.2 | 2.4±0.1 | 2.4±0.2 | 2.5±0.1 |
组织学观察：植入2周后，将植入支架材料进行组织学观察，实施例1组未发现浸润细胞，而其他各组均发现明显的炎性细胞浸润。
实施例4
支架材料对人脂肪干细胞体外增殖的影响
除下表参数外其它支架材料制备方法同实施例1
将支架材料置于24孔板中，并将脂肪干细胞用培养基制成细胞悬液后加入24孔板中没过支架材料(每孔细胞数1×105个)进行共培养，培养3天后，采用MTT法测定各组的平均OD值(595nm)，结果如下：
经one-wayANOVA分析表明实施例1与其他支架材料组均存在显著性差异。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (2)
1.一种骨组织工程支架复合材料的制备方法，具体步骤如下：
a)去抗原松质骨支架的制备：
剔除原料骨表面的骨膜、附着组织，并用双蒸水漂洗干净；分割成小骨块，然后在双蒸水中搅拌浸泡7h，得到无血色的骨块；骨块捞出沥干后，置入25℃恒温摇床中，用1:1氯仿/甲醇浸泡12h进行脱脂，然后再用双蒸水反复清洗3次，10-15min/次；
在脱脂清洗处理后，进行超声清洗脱细胞处理，具体处理方法为：将骨块放入含有0.05～0.2wt％的胰酶、0.1～0.3wt％的烷基糖苷和0.1wt％的聚乙二醇的PBS溶液中进行超声，pH为7.4，超声条件为：超声频率25kHz，超声功率为50W，超声时间5min，超声两次，制备成去抗原松质骨支架；
b)壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液表面修饰的去抗原松质骨支架的制备：
壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原溶液，即C/GP/Co溶液；将a)制备的去抗原松质骨支架浸入C/GP/Co溶液中，在37℃水浴中放置15min，去离子水清洗后冷冻干燥，得到C/GP/Co溶液表面修饰的去抗原松质骨支架；
所述的C/GP/Co溶液中，壳聚糖的浓度为15mg/ml，β-甘油磷酸钠的浓度为30mg/ml，胶原的浓度为35mg/ml，pH为7.4；所述C/GP/Co溶液中还包含0.5ng/ml的BMP-2，35ng/ml的bFGF和50mg/ml的女贞子总苷。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原料骨为猪骨。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410513528.9A CN104353112B (zh) | 2014-09-29 | 2014-09-29 | 一种骨支架复合材料的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410513528.9A CN104353112B (zh) | 2014-09-29 | 2014-09-29 | 一种骨支架复合材料的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104353112A CN104353112A (zh) | 2015-02-18 |
| CN104353112B true CN104353112B (zh) | 2016-02-17 |
Family
ID=52520483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410513528.9A Active CN104353112B (zh) | 2014-09-29 | 2014-09-29 | 一种骨支架复合材料的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104353112B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108498857B (zh) * | 2018-05-14 | 2023-04-18 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种载富勒烯人工髓核配方的制备方法 |
| CN113350486A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-09-07 | 深圳市人民医院 | 一种具有骨缺损修复功效的药物组合物及其应用 |
| CN115645617B (zh) * | 2022-09-09 | 2023-07-25 | 北京鑫康辰医学科技发展有限公司 | 一种具有生物活性的骨基质凝胶的制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1146368C (zh) * | 2000-12-15 | 2004-04-21 | 四川大学华西医院 | 生物衍生组织工程骨及其制备方法 |
| US8685432B2 (en) * | 2008-03-25 | 2014-04-01 | University Of Utah Research Foundation | Controlled release tissue graft combination biomaterials |
| CN102229705B (zh) * | 2011-06-02 | 2012-11-28 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 一种胶原蛋白温敏型水凝胶及其制备方法 |
-
2014
- 2014-09-29 CN CN201410513528.9A patent/CN104353112B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104353112A (zh) | 2015-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yin et al. | Induction of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and functional cartilage microtissue formation for in vivo cartilage regeneration by cartilage extracellular matrix-derived particles | |
| Liu et al. | Composite scaffolds of nano-hydroxyapatite and silk fibroin enhance mesenchymal stem cell-based bone regeneration via the interleukin 1 alpha autocrine/paracrine signaling loop | |
| Chen et al. | Decellularized bone matrix scaffold for bone regeneration | |
| Xue et al. | Repair of articular cartilage defects with acellular cartilage sheets in a swine model | |
| Bekkers et al. | One-stage focal cartilage defect treatment with bone marrow mononuclear cells and chondrocytes leads to better macroscopic cartilage regeneration compared to microfracture in goats | |
| Li et al. | Tissue-engineered mesh for pelvic floor reconstruction fabricated from silk fibroin scaffold with adipose-derived mesenchymal stem cells | |
| US12048779B2 (en) | Engineering mechanically functional human cartilage and method of making same | |
| Sharifi et al. | Criteria, challenges, and opportunities for acellularized allogeneic/xenogeneic bone grafts in bone repairing | |
| JP2004531297A (ja) | 組織修復のための方法および装具 | |
| Browe et al. | Glyoxal cross‐linking of solubilized extracellular matrix to produce highly porous, elastic, and chondro‐permissive scaffolds for orthopedic tissue engineering | |
| JP6574502B2 (ja) | 線維芽細胞からのエクスビボ軟骨生成 | |
| CN104353112B (zh) | 一种骨支架复合材料的制备方法 | |
| JP2022113744A (ja) | 軟骨細胞適用のための脂肪細胞 | |
| Woźniak et al. | Candidate bone-tissue-engineered product based on human-bone-derived cells and polyurethane scaffold | |
| Jin et al. | Implantation of bone marrow-derived buffy coat can supplement bone marrow stimulation for articular cartilage repair | |
| WO2018120672A1 (zh) | 一种诱导肌腱组织再生的生物活性支架及其制备方法和用途 | |
| Song et al. | Fabrication and development of artificial osteochondral constructs based on cancellous bone/hydrogel hybrid scaffold | |
| Ceylan et al. | Can chondral healing be improved following microfracture? The effect of adipocyte tissue derived stem cell therapy | |
| Lehmann et al. | Recellularization of auricular cartilage via elastase-generated channels | |
| CN105412986A (zh) | 小肠黏膜下层载药补片及其制备方法和应用 | |
| WO2020060520A9 (en) | Isolated septal cartilage exosome used for generating cartilage tissue | |
| Deutsch et al. | Stem cell-synthesized extracellular matrix for bone repair | |
| Du et al. | A preliminary study on the application of bone marrow stromal cell sheet on the formation of functional tissue-engineered bone in dogs | |
| WO2019055927A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR PARTICULATE AND RECONSTITUTED TISSUES | |
| Schimke et al. | Hard tissue augmentation of aged bone by means of a tin-free plla-pcl co-polymer exhibiting in vivo anergy and long-term structural stability |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |