CN104342480B - 利用线粒体动力学的美白物质的筛选方法及利用其的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种依靠测定线粒体动力学的美白物质的筛选方法及利用其的试剂盒。更详细地，涉及一种降低线立体的活性，从而阻碍动力学之后，使用候选物质进行处理，然后通过测定线粒体动力学的增加与否来评价候选物质是否具有美白功效的美白物质的筛选方法，以及利用这种线粒体的特性，能够简便地筛选美白物质的试剂盒。

Description

利用线粒体动力学的美白物质的筛选方法及利用其的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种依靠测定线粒体动力学的美白物质的筛选方法及利用其的试剂盒。更详细地，涉及一种降低线立体的活性，从而阻碍动力学之后，使用候选物质进行处理，然后通过测定线粒体动力学的增加与否来评价候选物质是否具有美白功效的美白物质的筛选方法，以及利用这种线粒体的特性，能够简便地筛选美白物质的试剂盒。
背景技术
以往，对于开发新型美白物质一直使用以下方法，将候选物质对黑色素生成细胞的黑素细胞(melanocyte)直接进行处理后，确认是否抑制黑色素生成，或者对黑素细胞照射紫外线，确认候选物质是否阻断此时产生的黑色素生成信号。但是在真实的皮肤中，黑素细胞不单独存在，而是从其他周边细胞或微环境直接或间接地受到物理性或化学性的影响而生成黑色素，因此仅用黑素细胞无法再现这种实际皮肤组织状态。
并且像黄褐斑，痣，黑疣，老年斑等色素过度沉着症，其发病因素或机理与紫外线引起的黑色素生成增加不同。虽然有因紫外线而使其症状恶化的倾向，但在没有紫外线刺激的情况下，黑色素生成和分散也会持续增加。因此，基于现有的紫外线照射方法开发的美白物质的情况下，实际在临床上不显示人皮肤色素过度沉着症抑制效果的情况较多。而且为了研究皮肤色素过度沉着症，对受试者的色素沉着过渡部位的皮肤进行活检后使用，需要大量的费用和努力，不仅不容易得到人的皮肤组织，而且不同于紫外线照射模型，难以获得皮肤色素过度沉着症的动物模型。
因此需要提供一种利用与黑色素生成相关的其它因素就能够评价候选物质是否具有美白功效的简单的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题
对此，本发明人发现如果线粒体的动力学被阻碍，黑色素的生成会增加，即，发现了线粒体动力学和黑色素生成量之间的密切相关关系。证明了通过人为调节线粒体的动力学，能够有效地筛选出具有美白功效的物质，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种通过测定线粒体动力学变化，从而能够既简便又有效地评价是否具有美白功效的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种通过评价动力学被阻碍的线粒体中是否使动力学增加来筛选美白物质的方法及利用其的试剂盒。
有益效果
通过应用本发明的方法及利用其的试剂盒，在试管内也能够既简便又有效率地筛选出在临床上具有美白功效的物质。
附图说明
图1为示出反复进行分裂和融合的线粒体动力学的模拟图。
图2为示出利用Mdivil诱导线粒体的融合后的结果的图，A为示出观察线粒体融合而排列成行的形态的结果的图(右)，B为示出处理Mdvil时黑色素的生成增加的图(黑色小球是黑色素；α-MSH是阳性对照组，用于确认黑色素生成诱导与否)，C为示出B结果的定量评价结果的图表，D为示出使用免疫印迹法对处理Mdivil时诱导黑色素生成的酪氨酸酶，TRP1蛋白质的表达增加进行确认的图。这时肌动蛋白是为了确认各样品是否被加载相同量的蛋白质而使用的内部对照物质。
图3为示出利用Drp1siRNA诱导线粒体融合后的结果的图，A 为示出观察线粒体融合而排列成行的形态的结果的图(右)，B为示出处理Drp1siRNA时黑色素的生成增加的图(黑色小球是黑色素)，C为示出B结果的定量评价结果的图表，D为示出使用免疫印迹法对处理Drp1siRNA时诱导黑色素生成的酪氨酸酶蛋白的表达增加进行确认的图(Scram为siRNA实验时相当于媒介物(Vehicle)的对照组)。这时肌动蛋白是为了确认各样品是否被加载相同量的蛋白质而使用的内部对照物质。
图4为示出利用CCCP诱导线粒体分裂后的结果的图，A为示出观察线粒体分裂，线粒体以点的形态显示的结果的图(右)，B为示出处理α-MSH时虽然黑色素的生成增加(黑色小球是黑色素)，但是即使处理α-MSH也会因为CCCP的处理而使得黑色素的生成减少的图，C为示出B结果的定量评价结果的图表，D为示出使用免疫印迹法对处理CCCP时诱导黑色素生成的酪氨酸酶，TRP1蛋白质的表达减少进行确认的图。这时肌动蛋白是为了确认各样品是否被加载相同量的蛋白质而使用的内部对照物质。
图5为示出利用OPA1siRNA诱导线粒体分裂后的结果的图，A为示出观察线粒体分裂，线粒体以点的形态显示的结果的图(右)，B为示出处理α-MSH时虽然黑色素的生成增加(黑色小球是黑色素)，但是即使处理α-MSH也会因为OPA1siRNA的处理而使得黑色素的生成减少的图，C为示出B结果的定量评价结果的图表，D为示出用免疫印迹法对处理OPA1siRNA时诱导黑色素生成的酪氨酸酶，TRP1蛋白质的表达减少进行确认的图(Scram为siRNA实验时相当于媒介物的对照组)。这时肌动蛋白是为了确认各样品是否被加载相同量的蛋白质而使用的内部对照物质。
具体实施方式
线粒体作为在细胞内对能量形成起着必需作用的细胞器，具有在正常的细胞内重复持续分裂和融合的动力学(dynamics)(图1)。这 种线粒体动力学(分裂和融合)，不只是调节线粒体的形态，还调节细胞内分布，活性及功能。异常的线粒体动力学，造成线粒体功能异常，因而与细胞老化及退化性脑部疾病等多种疾病的症状有密切的关联。特别地，伴随老化的线粒体动力学的变化被认为在多种细胞中会对其功能带来很大影响。但是，目前为止没有关于线粒体动力学与黑色素(或黑色素生成)的相关关系的报道。
本发明人欲证明线粒体动力学和黑色素生成之间的相关关系，其结果发现，线粒体活性降低，从而使动力学降低，则黑色素生成会增加；动力学增加，会使黑色素生成减少；已知上述过程在人为地调节线粒体活性的情况下也会显示同样的结果。以这些事实为基础，本发明提供一种美白物质的筛选方法，该方法通过在动力学被阻碍的线粒体中测定是否增加动力学，从而将增加线粒体动力学的物质评价为美白物质。
作为本发明的一个实施方式，本发明提供一种美白物质的筛选方法，其包括以下步骤：
1)降低线立体的活性，阻碍其的动力学；
2)使用候选物质对动力学被阻碍的线粒体进行处理；
3)处理上述候选物质后，测定线粒体动力学；以及
4)评价线粒体动力学增加与否。
“阻碍线粒体的动力学”是指诱导线粒体的融合或分裂，由此使黑色素生成增加。在本发明中，作为阻碍线粒体动力学的方法利用药物和siRNA。
为了阻碍线粒体动力学，本发明所使用的药物包括Mdivi-1(3-(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-磺酰基-4(3H)-喹唑啉酮(3-(2,4-dichloro-5-me thoxyphenyl)-2-sulfanyl-4(3H)-quinazolinone；线粒体分裂发动蛋白的选择性抑制剂；诱导线粒体融合)(经销商：恩佐生命科学(Enzo li fe sciences))，CCCP(羰基氰化物间-氯苯基腙(carbonylcyanide m -chlorophenylhydrazone)；氧化性磷酸化抑制剂；诱导线粒体分裂)(西格玛(Sigma))等，但不限于此。
并且，为了阻碍线粒体的动力学，本发明所使用的siRNA包括以下物质，但不限于此。
–诱导线粒体的融合
DRP1siRNA#1(5'-CUAAUUGUCAGAAAGAAUAUU-3'；SEQ ID NO：1)(经销商：Dharmacon)
DRP1siRNA#2(5'-GAAUUUCAGGAAAUAAUAAUU-3'；SEQ ID NO：2)(经销商：Dharmacon)
–诱导线粒体的分裂
OPA1siRNA(5'-GAAACUUUCUCCAAUUAAAUU-3'；SEQ ID NO：3)(销路:Dharmacon)
线粒体动力学的阻碍/增加或恢复程度可以通过肉眼观察，与正常状态比较时，比较线粒体的融合或分裂的诱导与否，相对性地进行比较评价来确定。
此外，线粒体动力学的阻碍/增加或恢复与否，可以通过测定线粒体的相对长度来进行判断。
具体地，如果线粒体的融合被诱导，则线粒体的平均长度会增加，如果线粒体的分裂被诱导，则线粒体的平均长度会减少。
因此，诱导线粒体融合的情况下，可以通过线粒体的平均长度与没有经过任何处理的线粒体相比增加来判断动力学被阻碍。在这种情况下，处理候选物质后，可以通过线粒体平均长度的减少来确认线粒体的动力学是否恢复。
并且，诱导线粒体分裂的情况下，可以通过线粒体的平均长度与没有经过任何处理的线粒体相比减少来判断动力学被阻碍。在这种情况下，处理候选物质后，可以通过线粒体平均长度的增加来确认线粒体的动力学是否恢复。作为替代方法，因线粒体动力学的阻碍及候选 物质的处理而引起的线粒体动力学的增加或恢复与否，还可以通过细胞内黑色素含量的增加与否来确认。具体地，如果线粒体的动力学被阻碍，则黑色素的生成会增加，从而使黑色素含量升高，相反，如果线粒体的动力学增加，则黑色素含量会降低。
作为另一实施方式，本发明提供一种美白物质的筛选方法，其包括以下步骤：
1)降低线粒体活性，从而阻碍动力学，测定细胞内黑色素含量；
2)使用候选物质对动力学被阻碍的线粒体进行处理；
3)处理上述候选物质后，测定细胞内黑色素含量；以及
4)比较上述步骤1)及步骤3)中测定的黑色素含量，评价黑色素含量增加与否。
上述方法中，阻碍线粒体动力学的方法可以利用药物和siRNA，与上述记载的方法相同。
上述方法中线粒体动力学的阻碍程度通过肉眼观察，与正常状态比较时，比较线粒体的融合或分裂的诱导与否，相对性地进行比较评价来确定。
此外，线粒体动力学的阻碍/增加或恢复与否，可以通过测定线粒体的相对长度来进行判断。
具体地，如果线粒体的融合被诱导，则线粒体的平均长度会增加，如果线粒体的分裂被诱导，则线粒体的平均长度会减少。
因此，诱导线粒体融合的情况下，可以通过线粒体的平均长度与没有经过任何处理的线粒体相比增加来判断动力学被阻碍。在这种情况下，处理候选物质后，可以通过线粒体平均长度的减少来确认线粒体的动力学是否恢复。
并且，诱导线粒体分裂的情况下，可以通过线粒体的平均长度与没有经过任何处理的线粒体相比减少来判断动力学被阻碍。在这种情况下，处理候选物质后，可以通过线粒体平均长度的增加来确认线粒 体的动力学是否恢复。作为替代方案，因线粒体动力学的阻碍及候选物质的处理而引起的线粒体动力学的增加或恢复与否，还可以通过细胞内黑色素含量的增加与否来确认。具体地，如果线粒体动力学被阻碍，则黑色素的生成会增加，从而使黑色素含量升高，相反，如果线粒体的动力学增加，则黑色素含量会降低。
此外，为了更加明确地确认线粒体动力学的阻碍与否，本发明的方法还包括以下步骤：在实施上述步骤1)之前测定细胞内黑色素含量，然后将由此得到的结果与步骤1)中得到的黑色素含量进行比较，步骤1)中得到的黑色素含量更高的情况下，可以判断线粒体动力学被阻碍。
此外，本发明提供筛选美白物质的试剂盒。上述试剂盒包括阻碍黑素细胞和线粒体动力学的方法，具体地，其特征为，包括阻碍线立体动力学的药物及siRNA中的一种；以及黑色素生成细胞。
以下，通过实施例及试验例对本发明的内容进行更具体地说明。这些实施例仅为了理解本发明的内容而示出，本发明的权利保护范围不被这些实施例及试验例所限定，可以实施本领域通常已知的变形，替换及插入等，这些也包括在本发明的范围内。
实施例1：利用药物的线粒体融合的诱导
将小鼠黑色素瘤B16F1细胞(购自ATCC)，以1.6×104细胞/ml浓度，置于12孔板上。24小时后，用10μM及15μM的Mdivi-1(恩佐生命科学)和200nM的α-MSH(黑色素诱导阳性对照组)进行处理。通过处理Mdivi1诱导融合后，用激光共聚焦显微镜观察，可以观察到如图2A示出的线粒体的融合。48小时后收集细胞，利用1NNaOH，在100℃下使细胞溶解30分钟。之后，收集细胞，用肉眼观察黑色素的总量，其与图2B示出的一样。之后在470nm下测定吸光度(SpectraMax190酶标仪，美国分子仪器公司，美国)，将对图2B的结果进行定量化而测定的黑色素总量用图 2C的图表示出。并且，利用免疫印迹法对图2B所示出的在细胞内部的黑色素生成调节蛋白质的量进行评价后，在图2D中示出。其结果，可以确认酪氨酸酶，TRP-1表达量增加。
实施例2：利用DRP1siRNA的线粒体融合的诱导
将小鼠黑色素瘤B16F1细胞，以1.6×104细胞/ml浓度，置于12孔板上。24小时后利用脂质体试剂(英杰公司(invitrogen))转染DRP1siRNA#1100pmol。用DRP1siRNA进行处理诱导融合后，用激光共聚焦显微镜(LSM510，卡尔蔡司(Carl Zeiss)，美国)观察，可以观察到如图3A示出的线粒体的融合。72小时后收集细胞，利用1N NaOH，在100℃下使细胞溶解30分钟。之后，收集细胞，用肉眼观察黑色素的总量，其与图3B示出的一样。之后在470nm下测定吸光度，将对图2B的结果进行定量化而测定的黑色素总量，用图3C的图表示出。并且，利用免疫印迹法对图3B所示出的在细胞内部的黑色素生成调节蛋白质的量进行评价后，在图3D中示出。
并且，除了用DRP1siRNA#2100pmol代替DRP1siRNA#1100pmol使用之外，采用同样的方法将小鼠黑色素瘤B16F1细胞用DRP1siRNA#2100pmol转染后，在470nm下测定黑色素的总量。测定结果在图3中示出。
通过图3D可以确认，虽然酪氨酸酶的表达量增加，但由于使用了Drp1siRNA，从而使得Drp1蛋白质的表达减少。
实施例3：利用药物的线粒体分裂诱导
将小鼠黑色素瘤B16F1细胞，以1.6×104细胞/ml浓度，置于12孔板上。24小时后，用2.5μM及5μM的CCCP(西格玛)和200nM的α-MSH进行处理。此时，CCCP是在处理α-MSH诱导黑色素生物合成的条件下处理的。另外，单独使用CCCP进行处理，诱导分裂后，用激光共聚焦显微镜(LSM510，卡尔蔡司，美国)观察，可以观察到如图4A示出的线粒体的分裂。48小时后，收集细胞，利用1N N aOH，在100℃下使细胞溶解30分钟。之后，收集细胞，用肉眼观察黑色素的总量，其与图4B示出的一样。之后在470nm下测定吸光度(SpectraMax190酶标仪，美国分子仪器公司，美国)，将对图4B的结果进行定量化而测定的黑色素总量用图4C的图表示出。并且，利用免疫印迹法对图4B所示出的在细胞内部的黑色素生成调节蛋白质的量进行评价后，在图4D中示出。其结果，可以确认酪氨酸酶，TRP-1表达量减少。
实施例4：利用OPA1siRNA的线粒体分裂的诱导
将小鼠黑色素瘤B16F1细胞，以1.6×104细胞/ml浓度，置于12孔板上。24小时后利用脂质体试剂(英杰公司)转染OPA1siRNA100pmol。此外，作为使用无效siRNA的阴性对照组，使用了scramb led siRNA(Scram)。处理OPA1siRNA，诱导分裂后，用激光共聚焦显微镜观察，可以观察到如图5A示出的线粒体的融合。24小时后处理α-MSH200nm之后，48小时后收集细胞，利用1N NaOH，在100℃下使细胞溶解30分钟。之后，收集细胞，用肉眼观察黑色素的总量，其与图5B示出的一样。之后在470nm下测定吸光度，将对图5B的结果进行定量化而测定的黑色素总量，用图5C的图表示出。并且，利用免疫印迹法对图5B所示出的在细胞内部的黑色素生成调节蛋白质的量进行评价后，在图5D中示出。其结果，可以确认酪氨酸酶，TRP-1表达量减少。

Claims (15)

1.一种美白物质的筛选方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)降低线粒 体的活性，阻碍线粒体动力学，其中，所述阻碍线粒体动力学是通过诱导线粒体的融合或分裂来实现的；
2)使用候选物质对动力学被阻碍的线粒体进行处理；
3)处理上述候选物质后，测定线粒体动力学；以及
4)评价线粒体动力学增加与否。
2.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的融合是通过3-(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-磺酰基-4(3H)-喹唑啉酮进行诱导的。
3.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的融合是通过选自SEQ ID NO：1的DRP1siRNA#1及SEQ ID NO：2的DRP1siRNA#2的1种以上进行诱导的。
4.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的分裂是通过羰基氰化物间-氯苯基腙进行诱导的。
5.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的分裂是通过SEQ ID NO：3的OPA1siRNA进行诱导的。
6.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，在所述步骤1)中通过诱导线粒体的融合来阻碍线粒体动力学时，所述线粒体动力学的阻碍与否是通过线粒体平均长度的增加与否来进行评价的。
7.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，在所述步骤1)中通过诱导线粒体的分裂来阻碍线粒体动力学时，所述线粒体动力学的阻碍与否是通过线粒体平均长度的减少与否来进行评价的。
8.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，以通过诱导线粒体的融合来阻碍线粒体动力学的方式实施所述步骤1)时，还包括以下步骤，将在实施所述步骤1)之前测量线粒体的长度而得到的线粒体的平均长度值与在实施所述步骤1)之后测量线粒体的长度而得到的线粒体的平均长度值进行比较，从而确认线粒体的平均长度是否增加。
9.根据权利要求1所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，以通过诱导线粒体的分裂来阻碍线粒体动力学的方式实施所述步骤1)时，还包括以下步骤，将在实施所述步骤1)之前测量线粒体的长度而得到的线粒体的平均长度值与在实施所述步骤1)之后测量线粒体的长度而得到的线粒体的平均长度值进行比较，从而确认线粒体的平均长度是否减少。
10.一种美白物质的筛选方法，其包括以下步骤：
1)降低线粒体的活性，从而阻碍动力学，测定细胞内黑色素含量，其中，阻碍所述线粒体动力学是通过诱导线粒体的融合或分裂来实现的；
2)使用候选物质对动力学被阻碍的线粒体进行处理；
3)处理上述候选物质后，测定细胞内黑色素含量；以及
4)比较上述步骤1)及步骤3)中测定的黑色素含量，评价黑色素含量增加与否。
11.根据权利要求10所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的融合是通过3-(2,4二氯-5-甲氧基苯基)-2-磺酰基-4(3H)-喹唑啉酮进行诱导的。
12.根据权利要求10所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的融合是通过选自SEQ ID NO：1的DRP1siRNA#1及SEQ ID NO：2的DRP1siRNA#2中的1种以上进行诱导的。
13.根据权利要求10所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的分裂是通过羰基氰化物间-氯苯基腙进行诱导的。
14.根据权利要求10所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，所述线粒体的分裂是通过SEQ ID NO：3的OPA1siRNA进行诱导的。
15.根据权利要求10所述的美白物质的筛选方法，其特征在于，还包括以下步骤，将在实施所述步骤1)之前测定细胞内黑色素含量而得到的黑色素含量值与在步骤1)中得到的黑色素含量值进行比较，从而确认线粒体的动力学是否被阻碍。
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